响应面法优化超声波-微波协同提取富硒蛹虫草硒多糖工艺

张国财,赵 博,刘春延,赵金艳,林连男,于 舒
(东北林业大学林学院,黑龙江 哈尔滨 150040)

摘 要:在单因素试验基础上,采用响应面法对富硒蛹虫草硒多糖超声波-微波协同提取工艺进行优化,并与超声波提取法和水提法提取硒多糖抗氧化活性进行比较分析,探究3种提取方法对硒多糖提取效果 的影响。结果表明:超声波-微波协同提取最佳工艺条件为超声时间26.0 min、微波时间3.20 m in、微波功率350 W、液料比32.00∶1(mL/g),在此条件下,硒多糖提取率为5.05%,比超声提取法和水提法分别提高了19.96%和3.70%;3种提取方法硒多糖体外抗氧化活性排序依次为:超声波-微波协同 提取法>超声波提取法>水提法。此外,超声波-微波协同提取法可获得更高的多糖硒含量,为360.37 mg/kg,相比超声提取法和水提法分别提高了4.47%和12.92%。

关键词:响应面法;超声波-微波协同;富硒蛹虫草;硒多糖;抗氧化活性

引文格式:

张国财, 赵博, 刘春延, 等. 响应面法优化超声波-微波协同提取富硒蛹虫草硒多糖工艺[J]. 食品科学, 2016, 37(12): 33-39. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612006. http://www.spkx.net.cn

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蛹虫草(Cordyceps militaris (Vuill.) Fr.)属子囊菌门(Ascomycota)昆虫寄生真菌,为我国传统名贵药食同源中药材之一。已有研究[1]表明,蛹虫草富含核苷、多糖、生物碱、甾醇等多种活性物质。其中,多糖类化合物作为蛹虫草重要的活性物质之一,具有抗氧化/衰老[2]、抗肿瘤[3]、调节免疫[4]、抗炎[5]等诸多药理作用。硒是人体必需的微量元素,缺硒会导致人体多种疾病发生[6]。然而,硒的生物利用度与其化学形态关系密切,有机硒更易为机体吸收和利用,且具有较高的安全性[7]。真菌对硒具有良好的富集能力,并将无机硒转化成有机硒[8],其中,多糖结合硒是硒在食用菌中主要赋存形态之一[9-10]。此外,硒多糖作为一种有机硒化合物兼有多糖和硒二者的活性和优点[11]。研究[12-14]表明,相比普通多糖,硒多糖具有更高的抗氧化、抗肿瘤及免疫增强活性。因此,以富硒食用菌为原料开发硒多糖功能食品或加工成膳食补充剂已成为未来发展的必然趋势。

已有研究表明,蛹虫草有很强的富硒和耐硒能力[15],且富硒蛹虫草硒多糖抗氧化活性均高于普通虫草多糖[16-17],利用富硒蛹虫草活性物质开发药物或保健品已引起业界的广泛关注,其开发潜力大,应用前景广阔。目前,对虫草多糖提取工艺研究亦多有报道[18-19],但对富硒蛹虫草产品研究较少。此外,研究[20-21]证实,硒多糖热稳定性较差,可见若利用现有的虫草多糖工艺条件提取蛹虫草硒多糖,必然会造成活性的大幅下降,然而迄今针对硒多糖提取工艺的研究鲜有报道。超声波-微波协同提取法具有提取时间短、提取率高及对有效成分影响小等优点,目前已成功应用于多种多糖提取研究中[22-24]。因此, 本实验采用响应面法对超声波-微波协同提取富硒蛹虫草硒多糖工艺进行优化,并与超声波提取法和传统水提法的提取效果和硒多糖抗氧化活性进行比较分析,旨在提供一套高效富硒蛹虫草硒多糖提取工艺,为其生产和综合开发利用提供依据,亦可为普通蛹虫草多糖提取工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草母种由东北林业大学森林保护学国家重点学科保藏;富硒蛹虫草由本实验室自行栽培,以亚硒酸钠为硒源,硒添加量为200 mg/kg,蛹虫草子座有机硒含量为187.89 mg/kg,无机硒含量为0.09 mg/kg。

葡萄糖标准品、硒标品、2,3-二氨基萘、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美国Sigma公司;抗•OH试剂盒、抗O2·试剂盒 南京建成生物工程研究所;其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

GE ULtrospec 5300 pro紫外分光光度计 美国通用电气医疗集团;F-2500荧光分光光度计 日本日立公司;JY92-IIN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;G70F23CN2P-BM1(S0)微波炉 格兰仕微波炉电器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工艺流程

富硒蛹虫草子座→鼓风干燥(温度为45 ℃至恒质量)→粉粹(100 目筛)→超 声提取→微波提取→抽滤→滤液→醇沉过夜(体积分数80%乙醇溶液)→离心(8 000 r/min)→沉淀→AB-8大孔吸附树脂静态吸附脱色→Sevag法除蛋白→醇沉过夜(体积分数80%乙醇溶液)→沉淀→无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤去脂→透析(截流量为分子质量3 500 kD)→超滤浓缩(截流量为分子质量2 000 kD)→冷冻干燥→粗多糖粉末。

1.3.2 单因素试验

以富硒蛹虫草粉末为原料,分别研究超声功率、超声时间、微波功率、微波时间及液料比对富硒蛹虫草多糖提取率的影响。提取基本条件为:超声时间25 min、超声功率400 W、微波时间3 min、微波功率280 W、液料比30∶1(mL/g)。各因素水平为:超声时间5、15、25、35、45、55、65 min;超声功率200、250、300、350、400、450、500 W;微波时间0.5、1、3、5、7、9、11 min;微波功率140、210、280、350、420、490、560 W;液料比5∶1、30∶1、45∶1、60∶1、75∶1、90∶1(mL/g)。

1.3.3 响应面优化试验

根据提取工艺单因素试验结果,选择超声时间、微波时间、微波功率、料液比4 个因素,选用Box-Behnken模型对以上因素进行响应面设计,以富硒蛹虫草多糖提取率为响应值进行优化。试验设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Scheme of Box-Behnken design

水平 因素A超声时间/min B微波时间/min C微波功率/W D液料比(mL/g)1 35 5 420 45∶1 0 25 3 350 30∶1 -1 15 1 280 15∶1

1.3.4 硒多糖和多糖硒含量的测定

1.3.4.1 硒多糖含量测定和提取率的计算

采用苯酚-硫酸法[25]进行测定。线性回归得标准曲线为:y=15.059 8x+0.042 5(y为吸光度;x为硒多糖质量浓度/(mg/mL)),R2=0.999 8,线性范围为0.016~0.16 mg/mL。根据标准曲线计算硒多糖提取率,按公式(1)计算:

式中:mp为硒多糖提取量/g;mt为富硒蛹虫草子座原料用量/g。

1.3.4.2 多糖硒含量测定

采用荧光分光光度法[26]对样品多糖硒含量进行测定。线性回归得标准曲线为:y=15 042x+149.27,(y为荧光读数;x为试管中硒含量/μg),R2=0.999 6,线性范围为0~0.5 μg。具体操作为:精确称取粗多糖粉末0.05 g,以双蒸水定容至100 mL,取溶液1 mL测定硒含量,以经硝化样品多糖中总硒含量,以未经硝化样品测定其无机硒含量,多糖硒含量按公式(2)计算:

式中:mst为多糖中总硒质量/μg;msi为多糖中无机硒质量/μg;msp为硒多糖质量/g。

1.3.5 不同提取方法硒多糖抗氧化活性测定

分别利用超声波-微波协同提取法、超声波提取法和水提法提取富硒蛹虫草硒多糖,并对体外抗氧化活性进行比较分析。其中,水提法取条件为:提取温度90 ℃、提取时间2 h、液料比30∶1(mL/g);超声波提取法提取条件为:超声功率500 W、超声时间40 min、超声温度50 ℃、液料比40∶1(mL/g)。

1.3.5.1 总还原能力测定

参照文献[27]方法进行测定。

1.3.5.2 •OH清除率测定

采用抗•OH试剂盒,按说明书进行测定。

1.3.5.3 DPPH自由基清除率测定

参照文献[28]方法进行测定。

1.3.5.4 ·清除率测定

采用抗·试剂盒,按说明书进行测定。

1.4 数据处理

实验所得数据利用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,显著性检验采用最小显著差数法。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 超声时间(a)、超声功率(b)、微波时间(c)、微波功率(d)及液料比(e)对硒多糖提取率的影响
Fig. 1 Effects of ultrasonication time (a), ultrasonic power (b), microwave treatment time (c), microwave power (d) and liquor to solid ratio (e) on Se-polysaccharides yield

由图1a可知,随着超声时间的延长,富硒蛹虫草硒多糖提取率呈明显上升趋势,当超声时间为25 min时,硒多糖提取率最高,为4.59%,当超声时间大于25 min后,提取率逐渐下降,因此选择超声时间25 min对硒多糖进行提取。同理由图1b~1e可得,确定超声功率400 W、微波时间3 min、微波功率350 W,液料比30∶1(mL/g)为适宜提取条件。由SPSS 17.0 软件方差分析得,除超声功率对提取率影响不显著外(P>0.05),其余各因素对硒多糖提取率,存在极显著影响(P<0.01)。此外,单因素试验结果表明,当超声时间、微波时间及微波功率超过适宜条件后,其硒多糖提取率均呈现出了不同程度的下降,这可能是由于过长的超声波机械作用和热效应或过长/强的微波强热效应,使部分硒多糖发生降解造成的[29-30]

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果

根据单因素试验结果,选取超声时间、微波时间、微波功率及液料比4 个因素,采用四因素三水平进行响应面设计,试验方案及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果
Table 2 Scheme and results of Box-Behnken design

试验号 A超声时间 B微波时间 C微波功率 D液料比(mL/g)硒多糖提取率/% 1 -1 0 0 -1 4.14 2 0 0 0 0 5.06 3 0 1 1 0 4.21 4 0 0 -1 1 4.35 5 1 0 -1 0 4.31 6 0 0 0 0 5.06 7 0 1 0 -1 4.53 8 0 1 -1 0 4.43 9 -1 -1 0 0 3.95 10 0 0 1 1 4.56 11 0 -1 -1 0 3.90 12 0 0 0 0 5.00 13 -1 0 -1 0 4.06 14 -1 0 1 0 4.20 15 1 -1 0 0 4.35 16 0 -1 1 0 4.36 17 1 0 0 -1 4.51 18 0 0 -1 -1 4.27 19 1 1 0 0 4.36 20 0 1 0 1 4.53 21 1 0 1 0 4.40 22 0 0 0 0 5.05 23 0 0 1 -1 4.35 24 1 0 0 1 4.51 25 0 -1 0 1 4.40 26 -1 1 0 0 4.39 27 0 0 0 0 5.07 28 0 -1 0 -1 4.11 29 -1 0 0 1 4.49

2.2.2 回归方程的建立与显著性检验

利用Design-Expert 8.0软件,通过对多项式回归分析,得到的拟合全变量二次回归方程模型为:Y=5.05+0.10A+0.12B+0.065C+0.078D-0.11AB-0.012AC-0.086AD-0.17BC-0.074BD+0.034CD-0.38A2-0.41B2-0.42C2-0.25D2。回归方程及偏回归系数方差分析结果见表3。

表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

注:***.差异高度显著(P<0.001);*.差异显著(P<0.05)。

变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 2.97 14 0.21 336.00 <0.000 1 *** A超声时间 0.12 1 0.12 195.08 <0.000 1 *** B微波时间 0.16 1 0.16 252.34 <0.000 1 *** C微波功率 0.050 1 0.050 80.01 <0.000 1 *** D液料比 0.072 1 0.072 114.34 <0.000 1 *** AB 0.044 1 0.044 70.20 <0.000 1 *** AC 5.482×10-4 1 5.482×10-4 0.87 0.366 9 AD 0.030 1 0.030 46.93 <0.000 1 *** BC 0.12 1 0.12 185.15 <0.000 1 *** BD 0.022 1 0.022 34.29 <0.000 1 *** CD 4.518×10-3 1 4.518×10-3 7.16 0.018 1 * A2 0.96 1 0.96 1 515.92 <0.000 1 *** B2 1.07 1 1.07 1 689.10 <0.000 1 *** C2 1.14 1 1.41 1 801.17 <0.000 1 *** D2 0.41 1 0.41 651.79 <0.000 1 ***残差 0.012 14 6.306×10-4失拟项 8.828×10-3 10 5.904×10-4 0.81 0.644 6误差项 5.949×10-3 4 7.310×10-4总和 2.98 28

由表3可知,该模型P<0.001,表明回归模型高度显著;失拟项P=0.644 6>0.05,模型失拟不显著,试验误差小;模型相关系数R2=0.997 0,校正决定系数,表明此模型拟合优度好,因此可用该模型来分析和预测富硒蛹虫草硒多糖提取工艺。此外,模型各因素对响应值的影响P<0.01,均极显著,交互项中除AC外,其余均显著,说明4 个因素对硒多糖提取率影响均较大,且非简单线性关系。

2.2.3 响应面各因素交互作用分析

由图2可知,AB、AD、BC及BD响应曲面坡度陡峭,交互作用高度显著,CD响应面相对陡峭,交互作用显著,但AC交互作用不显著。4 个因素中微波时间和超声时间对富硒蛹虫草硒多糖提取率影响最大,随着二者的延长,硒多糖提取率亦快速上升。

图2 两因素交互作用对富硒蛹虫草硒多糖提取率影响的响应面分析
Fig. 2 Response surface plots showing the interactive effects of four extraction parameters on Se-polysaccharides yield

2.2.4 优化提取工艺参数的验证

对回归模型进行响应面分析,得到最佳工艺条件为:超声时间26.02 min、微波时间3.21 min、微波功率354.22 W、液料比31.88∶1(mL/g)。在此条件下,硒多糖提取率预测值为5.07%。考虑到实际操作,选用超声时间26.0 min、微波时间3.20 min、微波功率3 5 0 W、液料比3 2.0 0∶1(m L/g),在此条件下,经3 次重复实验,得到硒多糖提取率平均值为5.05%,由此确定富硒蛹虫草硒多糖提取工艺条件。

2.3 不同提取方法的富硒蛹虫草硒多糖体外抗氧化能力比较

图3 不同提取方法得富硒蛹虫草硒多糖体外抗氧化能力
Fig. 3 Reducing power (a) and scavenging effects on hydroxyl radical (b), DPPH radical (c) and superoxide radical (d) of SCMP obtained with different extraction methods

a.还原力;b. ·OH清除能力;c. DPPH自由基清除能力;d.•清除能力。

由图3a可知,硒多糖质量浓度在0.5~3.5 mg/mL范围内,3种方法提取富硒蛹虫草硒多糖均具有一定的还原能力,且随硒多糖质量浓度的增大而增加,呈现明显的量效关系,其中,超声波-微波协同法提取硒多糖总还原能力最高,超声波提取法次之,水提法硒多糖总还原能力最弱。当硒多糖质量浓度为3.5 mg/mL时,其吸光度分别为0.372、0.335和0.251。方差分析结果表明,即3种提取方法对硒多糖总还原能力影响极显著(P<0.01)。

由图3b可知,3种方法提取的多糖均表现出质量浓度与·OH清除率间的量效关系,当硒多糖质量浓度在0.6~1.8 mg/mL范围内,超声波-微波协同提取和超声波提取硒多糖对·OH清除率均随着质量浓度的增加而上升,其后趋于平稳,而水提法硒多糖在所选质量浓度范围内,清除率始终呈缓慢上升趋势,且低于超声波-微波协同提取和超声波提取的清除率。利用SPSS 17.0软件拟合计算,超声波-微波协同提取、超声波提取法和水提法硒多糖对·OH清除率IC50值分别为0.766、1.019 mg/mL和1.324 mg/mL,以超声波-微波协同提取清除能力最强。方差分析结果表明,不同方法提取的硒多糖对·OH清除率IC50值间存在极显著差异(P<0.01)。

由图3c可知,在一定的质量浓度范围内,3种方法对硒多糖DPPH自由基清除率均随着质量浓度的增加而增强,呈现显著剂量依赖性,且具有较强的DPPH自由基清除能力,当超声波-微波协同提取硒多糖的质量浓度为0.55 mg/mL时,其对DPPH自由基清除率即达90.81%,当硒多糖质量浓度为0.65 mg/mL时,超声波提取法和水提法硒多糖对DPPH自由基清除率亦超过70%。经SPSS 17.0软件分析得,超声波-微波协同提取、超声波提取法及水提法硒多糖对DPPH自由基清除率IC50值依次为0.143、0.238 mg/mL 和0.322 mg/mL,以超声波-微波协同法提取硒多糖清除能力最强。方差分析结果表明,不同方法提取的硒多糖对DPPH自由基清除率IC50值间差异极显著(P<0.01)。

由图3d可知,富硒蛹虫草硒多糖对·清除能力较弱,3种方法提取的硒多糖对·清除率均随质量浓度的升高而缓慢提高,且呈明显的量效关系。相比超声波提取法和水提法,超声波-微波协同法提取的硒多糖具有更高的·清除率,在实验最大质量浓度14 mg/mL条件下,超声波-微波协同提取硒多糖对·清除率最强为41.77%,超声波提取法次之,清除率为37.25%、水提法最差,清除率仅为30.07%。方差分析结果表明,不同提取方法对富硒蛹虫草硒多糖对·清除率存在极显著影响(P<0.01)。

表3 不同提取方法提取效果综合比较分析
Table 3 Comparative analysis of different extraction methods

注:同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01);不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

提取方法 提取 硒多糖 多糖硒含量/抗氧化活性IC50/(mg/mL)时间/min提取率/%(mg/kg) ·OH清除率 DPPH自由基清除率超声波-微波协同 29.20 5.05Aa 360.37Aa 0.766Aa 0.143Aa超声 波 40.00 4.21Bc 344.96ABb 1.019Bb 0.238Bb水提 120.00 4.87Ab 319.14Bc 1.324Cc 0.322Cc

由表3可知,超声波-微波协同提取法可有效缩短提取时间,提高硒多糖提取率,且提取多糖具有较高的硒含量和抗氧化活性。相比超声波提取法,超声波-微波协同提取法硒多糖提取率由4.21%提升到了5.05%,提高了19.96%,差异极显著(P<0.01),相比水提法,超声波-微波法提取率虽然仅提高了3.70%,差异显著(P<0.05),但提取的硒多糖具有更高的抗氧化活性,其对·OH和DPPH自由基清除能力IC50值分别提高了42.15%和55.59%,差异极显著(P<0.01)。此外,实验结果表明,不同提取方法对多糖中硒含量产生不同程度的影响,超声波-微波协同法提取多糖硒含量最高,为360.37 mg/kg,相比超声提取法和水提法分别提高了4.47%和12.92%,方差分析结果表明,超声波-微波协同法与超声法差异不显著(P>0.05),但与水提法差异极显著(P<0.01),三者差异均显著(P<0.05)。

3 讨论与结论

多糖的生物活性与其结构包括化学组成、分子质量、分支、糖苷键、高级结构、理化性质等关系十分密切[31-33]。同时,利用不同方法提取多糖,其分子质量、单糖比例、糖醛酸含量、形貌特征、黏度具有一定差异[34-36],从而对其活性产生不同程度的影响。实验中不同提取方法硒多糖体外抗氧化活性比较分析结果表明,3种提取方法对富硒蛹虫草硒多糖总还原能力、·O H、O2·及D PPH自由基清除率影响显著,总体上超声波-微波协同提取法>超声波提取法>水提法。除以上原因外,这也可能是由于硒多糖稳定性较差,在长时间的高温或超声波机械剪切作用下,导致硒多糖结构发生改变或降解[37],从而造成了多糖活性下降。本研究结果还发现,不同提取方法对富硒蛹虫草多糖硒含量亦具有一定的影响,以超声波-微波协同提取法硒含量最高,达360.37 mg/kg,这可能是由于硒在富硒蛹虫草多糖不同极分中分布不均,而不同方法提取的多糖分子质量分布不同引起的[34]。另一方面,从硒多糖提取率看,超声波-微波协同法的硒多糖提取率比超声波法提高了19.96%,比水提法仅提高了3.70%,分析其原因,推测是相比单一超声波提取,超声波-微波协同提取在适宜的超声波的空化作用和次级效应加之微波的热效应以及二者的协同作用下[38-39],可在短时间内进一步破坏富硒蛹虫草细胞结构,增加了细胞膜和细胞壁的通透性[40],更有利于硒多糖释放进入溶剂中,进而大幅提高了提取率;而传统水提法因长时间的高温作用,亦有利于多糖的溶出[41],从而获得了较高的提取率,确切机理还有待于进一步研究。

在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken试验设计和响应面分析法,得到超声波-微波协同提取富硒蛹虫草硒多糖最佳工艺条件为超声时间26.0 min、微波时间3.20 min、微波功率350 W、液料比32.00∶1 (mL/g),在此条件下,硒多糖提取率可达5.05%,相比超声波提取法和水提法,硒多糖提取率分别提高了19.96%和3.70%。

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Optimization of Ultrasound-Microwa ve Assisted Extraction of Selenium-Containing Polysaccharides from Se-Enriched Cordyceps militaris by Response Surface Methodology

ZHANG Guocai, ZHAO Bo, LIU Chunyan, ZHAO Jinyan, LIN Liannan, Y U Shu
(College of Forestry, Northeast Forestry Univer sity, Harbin 150040, China)

Abstract: Response surface methodology was used to optimize the ultrasound-microwave assi sted extraction (UME) of selenium-containing polysaccharid es from Se-enriched Cordyceps militaris (SCMP) based on single factor experiments. The yield, selenium content and antioxidant activities in vitro of SCMP were compared with those obtained with hot water extraction (HW E) and ultrasonic extraction (UE). The results indicated that the optimum conditions for UME extraction were as follows: ultrasonication time, 26.0 min; subsequent microwave trea tment, 3.20 min; microwave power, 350 W; and ratio of liquor to solvent, 32.00:1 (mL/g). Under these conditions, the ex traction yield of SCMP was 5.05%, which was inc reased by 19.96% and 3.70% compared with UE an d HWE, respectively. Furthermore, the SCMP prepared by UME exhibited the strongest antioxidant activity and contained the highest level of organic selenium, and its selenium content was 360.37 mg/kg, which was increased by 4.47% and 12.92% as compared with those obtained with UE and HWE.

Key words: response surface methodology; ultr asound-mi crowave assisted extraction; Se-enriched Cordyceps militaris; Se-p olysaccharides; antioxidant activity

收稿日期:2015-09-29

基金项目:中央高校基本科研业务费专项(2572014AA08)

作者简介:张国财(1964—),男,教授,博士,研究方向为森林资源保护及利用。E-mail:zhang640308@126.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612006 [10] 铁梅. 食用菌中硒的形态分析[D]. 上海: 华东师范大学, 2006. 10.7666/d.y896676.

中图分类号:TS209

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)12-0033-07