表1 测试奶粉样品信息
Table 1 Summary of the information about milk power samples
郭秀春1,2，郭小白3，张苗苗3，马娇豪3，康文艺1,2,*
（1.河南大学药学院，中药研究所，河南 开封 475004；2.开封市保健食品功效成分研究重点实验室，河南 开封 475004；3.河南大学民生学院，河南 开封 475004）
摘 要：选用市售同种品牌不同年龄段的奶粉，采用莱茵-埃农氏法和高效液相色谱-示差折光检测法对其乳糖和蔗糖进行测定，分析乳糖和蔗糖的差异，并对两种分析方法的结果进行比较，为奶粉中乳糖和蔗糖的检测方法提供依据。结果表明，莱茵-埃农氏法和高效液相色谱-示差折光检测法相比，高效液相色谱-示差折光检测法测定乳糖和蔗糖含量的准确度更高，蔗糖和乳糖的线性范围均为2～12 mg/mL，相关系数分别为0.999 3、0.999 6，精密度实验结果表明，相对标准偏差分别为2.53%、3.81%，平均加样回收率分别为99.70%、101.06%。高效液相色谱-示差折光检测法结果准确、分析时间短、前处理简单，适用于快速测定奶粉中蔗糖和乳糖含量。
关键词：莱茵-埃农氏法；高效液相色谱-示差折光检测法；奶粉；蔗糖；乳糖
引文格式：
郭秀春, 郭小白, 张苗苗, 等. 莱茵-埃农氏法和高效液相色谱-示差折光法检测奶粉中乳糖和蔗糖的比较研究[J]. 食品科学, 2016, 37(12): 139-143. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612024. http://www.spkx.net.cn
GUO Xiuchun, GUO Xiaobai, ZHANG Miaomiao, et al. Comparative detection of lactose and sucrose in milk powder by Lane-Eynon’s method and high performance liquid chromatography with refractive index detector[J]. Food Science, 2016, 37(12): 139-143. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612024. http://www.spkx.net.cn
糖类是奶粉中比较重要的成分之一，特别是乳糖经人体内乳糖酶作用后能形成有机酸，可以促进钙离子的吸收，促进有益菌的成长，有利于肠道健康[1]。但随着年龄的增长，肠道中乳糖酶活性急剧下降，因而成年人尤其是高龄人群食用大量的乳糖，不易消化，食物中乳糖含量高于15%时可导致渗透性腹泻。此外，研究[2-4]表明，受种族、气候以及遗传等诸多因素的影响，有相当一部分人的体内缺乏乳糖酶，这些人群摄入含有大量乳糖的产品会出现肠鸣、腹痛、排气和渗透性腹泻等“乳糖不耐受”反应。蔗糖是常用的食品添加剂之一，常被加入奶粉中以提高含糖量。食用过量蔗糖会危害身体健康，如蛀牙和肥胖等[1]。由此可见，对乳制品中的乳糖和蔗糖含量进行有效控制就显得十分必要。
目前，国内外对乳制品中乳糖的检测技术，有可见分光光度法[5-6]、红外光谱法[7]、离子色谱法[8]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[9-11]、毛细管区带电泳-间接紫外检测法[12]、气相色谱法[13]、高效薄层扫描法[14]、直接比色法[15-16]、直接滴定法（莱茵-埃农氏法）[17-18]等。为此，我国也相继出台的关于食品中乳糖测定的相关标准包括：GB/T 22221—2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定高效液相色谱法》[19]、GB 5413.5—2010《婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》[17]。本实验选用市售同种品牌不同年龄段奶粉为研究对象，采用GB 5413.5—2010中给出的莱茵-埃农氏法和优化条件后的HPLC-示差折光检测法对奶粉中乳糖和蔗糖含量的测定，为有效控制奶粉质量和指导消费者合理消费具有指导意义。
1.1 材料
选购市售同种品牌适用不同年龄段的9种奶粉为测试奶粉样品（表1）。
表1 测试奶粉样品信息
Table 1 Summary of the information about milk power samples
1.2 试剂
蔗糖标准品（分析纯，C A S号：5 7-5 0-1）天津市科密欧化学试剂有限公司；乳糖标准品（分析纯，CAS号：63-42-3） 天津市大茂化学试剂厂；乙腈（色谱纯，≥99.9%） 美国Avantor Performance Materials公司；乙酸铅溶液、草酸钾、磷酸氢二钠、盐酸、硫酸铜、浓硫酸、酒石酸钾钠、氢氧化钠溶液、酚酞溶液、乙醇、次甲基蓝溶液、费林氏液（甲液和乙液）[17]均为分析纯；水为Milli-Q超纯水机（Millipore）制备的超纯水。
乙酸锌溶液：21.9 g乙酸锌加3 mL冰乙酸加水溶解并稀释至100 mL；亚铁氰化钾溶液：10.6 g亚铁氰化钾加水溶解并稀释至100 mL。
1.3 仪器与设备
电子天平 美国Mettler-Toledo公司；DL-1型电炉 北京中兴伟业仪器有限公司；W201B型恒温水浴锅上海申生科技有限公司；KQ-500DB型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；LC-20AT HPLC仪（配置有SIL-20AC自动进样器、LC-20AD四元低压梯度泵、CTO-20AC柱温箱、RID-20A示差折光检测器） 日本岛津公司。
1.4 方法
1.4.1 莱茵-埃农氏法测定乳糖和蔗糖
按GB 5413.5—2010中规定的方法。
1.4.2 HPLC法测定乳糖和蔗糖
1.4.2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil 100-5-N H2氨基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃，检测器温度35 ℃，流速1.0 mL/min，流动相：乙腈-水（75∶25，V/V），进样量20 μL。
1.4.2.2 标准品溶液的制备
混合对照品贮备液（20 mg/mL）：分别称取1 g（精确至0.1 mg）经过（96±2）℃的干燥2 h后的蔗糖、乳糖标准品，溶解并定容至50 mL容量瓶中。
混合对照品使用液：分别准确吸取混合对照品贮备液1.00、2.00、3.00、5.00 mL和6.00 mL于10 mL容量瓶中加水定容，分别相当于2.0、4.0、6.0、10.0 mg/mL和12.0 mg/mL的标准溶液。
1.4.2.3 供试品溶液的制备
准确称取2.0 g样品（精确至0.1 mg）加入50 mL水溶解，再加入21.9 g/mL乙酸锌、10.6 g/mL亚铁氰化钾溶液各5 mL超声30 min定容至100 mL，用滤纸过滤弃去初液，取滤液用0.22 μm的滤膜过滤至进样瓶中待用。
2.1 莱茵-埃农氏法测定奶粉样品中乳糖和蔗糖
通过1.4.1节方法对9种奶粉中乳糖和蔗糖含量进行了测定，结果如表2所示。由表2可知，经莱茵-埃农氏法测定，不同年龄段奶粉中均含有乳糖和蔗糖，并且乳糖含量高于蔗糖。其中，中老年奶粉中乳糖含量最高，其次是幼儿、儿童奶粉，其他奶粉中乳糖含量相差不大。而无添加蔗糖的奶粉样品5、8和9，经莱茵-埃农氏法测定却显示含有少量蔗糖，可能是由于莱茵-埃农氏法测蔗糖是经过盐酸加热水解成为果糖和葡萄糖，再测定还原糖的总量，在水解过程中还可将部分糊精、麦芽糖等组分水解成葡萄糖，故使最后测定结果偏高[9]。而无添加蔗糖的8号样品因配料表中含麦芽糖，使得其用莱茵-埃农氏法测得的蔗糖数据为（4.31±0.45） g/100 g。因此，莱茵-埃农氏法测乳糖和蔗糖含量，虽然方便快捷简便，但因操作原因易引起系统及随机误差，且存在无法区分乳糖和其他还原糖等不足[18]。由此表明，莱茵-埃农氏法在测奶粉中乳糖和蔗糖过程中易存在一定的误差。
表2 莱茵-埃农氏法测定乳糖和蔗糖含量（n=6）
Table 2 Contents of lactose and sucrose assayed by the Lane-Eynon's method (n=6)
2.2 HPLC法测定奶粉样品中乳糖和蔗糖
2.2.1 色谱条件的优化
2.2.1.1 流动相选择
通过调节流动相的配比来优化各组分的保留时间及分离度。分别用乙腈体积分数为70%、75%、80%和85%的流动相进行了分离度实验。结果表明，分离时间随着流动相中水的比例的提高而缩短，但分离度会下降，蔗糖峰会与样品中其他糖的峰部分重叠；降低流动相中水的比例能使分离度变大，但分离时间延长，峰展宽严重。当乙腈和水的体积比为75∶25，流速为1.0 mL/min时，样品中的分离效果令人满意。
2.2.1.2 检测器温度选择
示差折光检测器对环境的温度比较敏感，温度变化明显，基线会出现漂移或波浪起伏。在设定检测器的温度为30、35 ℃和40 ℃时，发现在35 ℃温度的条件下效果好。
2.2.2 标准品中乳糖和蔗糖的测定结果
将1.4.2.2节制备得到的不同质量浓度的乳糖和蔗糖标准溶液在1.4.2.1节条件下进行HPLC测定，得到了不同质量浓度的乳糖和蔗糖混合标准品的HPLC图（图1）。通过HPLC测定数据，分别绘制蔗糖和乳糖的标准曲线，结果表明，在2～12 mg/mL范围内乳糖和蔗糖质量浓度与峰面积线性关系良好，其线性方程及相关系数检出限见表3。取线性范围内最低质量浓度的混合对照品溶液，逐步稀释后，按1.4.2.1节条件下色谱条件进行测定，信噪比为3时的相应质量浓度或注入仪器的量即为检出限[20]。测得蔗糖和乳糖的检出限分别为0.030 mg/mL 和0.024 mg/mL。
图1 2种糖的标准色谱图
Fig. 1 Chromatogram of mixed sugar standards
1.蔗糖；2.乳糖。
表3 蔗糖和乳糖的回归方程、线性范围、相关系数与检出限
Table 3 Linear regression equations, linear ranges, correlation coefficients and limits of detection for sucrose and lactose
2.2.3 奶粉样品中乳糖和蔗糖的HPLC图
图2 9种奶粉样品的HPLC图
Fig. 2 HPLC profiles of 9 milk powder samples
1～9. 9种奶粉样品编号对应表1。
表4 HPLC-示差折光检测法测定乳糖和蔗糖含量（n=3）
Table 4 Contents of lactose and sucrose assayed by HPLC-RID (n=3)
利用配备有示差折光检测器的HPLC仪，按照1.4.2.1节的方法对9种奶粉样品中的乳糖和蔗糖含量进行了测定。由图2和表4可知，在无添加蔗糖的奶粉样品5、8、9中未检测出蔗糖，符合样品无添加蔗糖的特点。9种奶粉样品中均含有乳糖，且幼儿、儿童奶粉样品中乳糖含量最高，其次是中老年奶粉。幼儿、儿童奶粉中乳糖的作用主要是有益于幼儿和儿童的脑部发育，以及促进钙吸收和体内有益菌生长等。而中老年奶粉中乳糖含量高可能是为了有助于预防骨质疏松、体内有益菌生长、延缓动脉硬化的形成[21]等，但不适合乳糖酶缺乏者食用。青少年和适合全家人饮用的奶粉类样品中乳糖量处于中等水平。
2.2.4 精密度实验结果[20,22]
精密吸取1.4.2.2节的某一质量浓度的蔗糖、乳糖的混合对照品溶液20 μL，注入色谱仪，按1.4.2.1节的色谱条件操作，记录色谱仪，连续进样6 次，分别测量蔗糖和乳糖的峰面积，计算蔗糖和乳糖的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.35%、3.70%，说明仪器的精密度良好。
精密吸取1.4.2.3节的某一含有蔗糖、乳糖的供试品溶液20 μL，注入色谱仪，按1.4.2.1节色谱条件操作，记录色谱仪，连续进样6 次，分别测量蔗糖和乳糖的峰面积，计算RSD，结果见表5。从表5可见，蔗糖和乳糖的RSD分别为2.53%、3.81%，说明方法的精密度良好。
表 5 精密度实验结果
Table 5 Results of precision test
2.2.5 稳定性实验结果[23]
精密吸取1.4.2.3节的某一供试品溶液20 μL，注入色谱仪，按1.4.2.1节的色谱条件操作，在0、3、6、9、12、24 h进样，分别测量蔗糖和乳糖的峰面积，计算RSD分别为3.71%、3.24%，结果表明供试品中蔗糖和乳糖在24 h内基本稳定。
2.2.6 重复性实验结果[20]
精密称取某一奶粉样品6 份，按1.4.2.3节的方法制备蔗糖和乳糖供试品溶液，按1.4.2.1节的色谱条件操作，均进样1 次，分别测量样品中蔗糖和乳糖的峰面积，计算RSD分别为3.14%、4.67%，结果表明本实验重复性良好。
2.2.7 加样回收率实验结果[23-24]
取已知含量的样品粉末约2 g，平行18 份；9 份用于蔗糖加样回收率实验，分为3 份3 个水平，分别加入含量相当量80%、100%、120%的蔗糖对照品，按1.4.2.3节的方法制备成溶液，每次进样20 μL；同样，9 份用于乳糖加样回收率实验，分为3 份3 个水平，分别加入含量相当量80%、100%、120%的乳糖对照品，按1.4.2.3节方法制备成溶液，每次进样20 μL。记录色谱图，测量蔗糖和乳糖的峰面积，代入回归方程计算，并求得蔗糖的平均回收率为99.70%，RSD为3.23%；乳糖的平均回收率为101.06%，RSD为2.05%，结果见表6。
表6 加样回收率实验结果
Table 6 Results of spike recovery test
由以上可见，HPLC-示差折光检测法对乳糖和蔗糖的测定具有很好的选择性、分离性较好、精密度高、稳定性重复性好、回收率高等特点，能够反映出测得数值的准确性。
2.3 莱茵-埃农氏法和HPLC-示差折光检测法比较
将莱茵-埃农氏法和HPLC-示差折光检测法测定蔗糖和乳糖的含量绘制成柱形图（图3），将两种方法的测定结果进行分析比较。
图3 2种检测方法测定蔗糖（a）和乳糖（b）含量的结果比较
Fig. 3 Comparison of the results of two methods for the determination of lactose and sucrose
由图3a显示，无添加蔗糖的奶粉样品5、8、9用HPLC-示差折光检测时均无检测到蔗糖，但用莱茵-埃农氏法均测得含有少量蔗糖。而其余6种奶粉样品用HPLC-示差折光检测法测得的蔗糖含量要明显高于莱茵-埃农氏法测得的蔗糖含量。此结果与文献[9]测定结果一致。由图3b显示，1和2号奶粉样品用HPLC-示差折光检测法测得的乳糖含量要明显高于莱茵-埃农氏法测得的乳糖含量。而8和9号奶粉样品用莱茵-埃农氏法测得的乳糖含量要明显高于HPLC-示差折光检测法测得的乳糖含量，这是由于莱茵-埃农氏法测定乳糖时无法区分乳糖和其他还原糖所致[18]。通过两种方法比较可知，莱茵-埃农氏法引起误差的原因存在不确定性，所测定的结果没有HPLC法准确度高。
莱茵-埃农氏法测乳糖和蔗糖含量，虽然方便快捷简便，但因操作原因易引起系统及随机误差，且存在无法区别乳糖及其他还原糖等不足。而HPLC-示差折光检测法对乳糖和蔗糖含量的测定具选择性好、分离性较好、精密度高、稳定性重复性好、回收率高等特点，比较适合奶粉中乳糖和蔗糖的同时测定。用HPLC-示差折光检测法的9种奶粉样品中乳糖和蔗糖含量总体情况良好，符合奶粉的真实品质，可以指导消费者根据自身情况来选购奶粉，避免盲目性消费，为有效控制奶粉质量和指导消费者合理消费具有指导意义。
参考文献：
[1] 赵丹霞, 王力清, 黄秋研, 等. 国内市售婴幼儿配方乳粉中葡萄糖、果糖、乳糖及蔗糖含量的检测与分析[J]. 食品安全质量检测学报, 2015, 6(3): 942-946.
[2] 赵显峰, 荫士安. 乳糖不耐受以及解决方法的研究动态[J]. 中国学校卫生, 2007, 28(12): 1151-1153.
[3] YANG Y, HE M, CUI H, et al. The prevalence of lactase deficiency and lactose intolerance in Chinese children of different ages[J]. Chinese Medical Journal, 2000, 113(12): 1129-1132.
[4] 王文建. 乳糖不耐受症的诊断与治疗[J]. 实用儿科临床杂志, 2012, 27(19): 1468-1470. DOI:10.3969/j.issn.1003-515X.2012.19.003.
[5] 朱坚. SN/T 0871—2012 进出口乳及乳制品中乳糖的测定方法[S].北京: 中国标准出版社, 2012.
[6] 陶兆林, 张世满, 司友琳. 利用分光光度法测定乳制品中的乳糖[J].中国卫生检验杂志, 2001, 11(1): 50-51.
[7] GOMBAS Á, ANTAL I, SZABO-REVESZ P, et al. Quantitative determination of crystallinity of alpha-lactose monohydrate by nearinfrared spectrometry[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2003, 256(1/2): 25-32. DOI:10.1016/S0378-5173(03)00059-0.
[8] 熊建飞, 周光明, 许丽, 等. 离子色谱法测定奶粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖[J]. 食品科学, 2012, 33(8): 176-179.
[9] 莫海涛, 李永库, 潘发用, 等. 高效液相色谱-激光蒸发光散射检测法测定低蔗糖食品中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖含量[J]. 食品工业科技, 2006, 27(3): 186-191. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2006.03.059.
[10] 樊祥, 王敏, 韩丽, 等. 乳制品中乳糖的高效液相色谱-脉冲式安培电化学检测[J]. 分析试验室, 2010, 29(增刊1): 30-32. DOI:10.13595/ j.cnki.issn1000-0720.2010.0361.
[11] 杨勇, 吴琳琳, 罗奕, 等. HPLC-CAD法测定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖含量的不确定度评定[J]. 中国食品添加剂, 2015(9): 172-180.
[12] 张欢欢, 李疆, 赵珊, 等. 毛细管区带电泳-间接紫外检测法快速测定食品中乳糖、蔗糖、葡萄糖和果糖[J]. 色谱, 2015, 33(8): 816-821. DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.03042.
[13] 孙曼泽, 沈崇钰. 气相色谱法测定奶粉中乳糖和蔗糖方法的探讨[J].南京财经大学学报, 1994(2): 49-51.
[14] 王燕, 陈芳. 高效薄层扫描法测定乳粉中乳精和蔗糖的含量[J]. 石河子大学学报(自然科学版), 1994, 12(1/2): 73-75.
[15] BARNETT A J G, TAWAB G A. A rapid method for the determination of lactose in milk and cheese[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1957, 8(7): 437-441. DOI:10.1002/jsfa.2740080712.
[16] 樊宏, 陈强. 乳制品中乳糖直接比色测定方法探讨[J]. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(3): 296-297.
[17] 卫生部. GB 5413.5—2010 婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定[S].北京: 中国标准出版社, 2010.
[18] 钟宁, 侯彩云. 三种乳糖检测方法的比较[J]. 食品科技, 2011, 36(7): 263-265. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2011.07.016.
[19] 国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB/T 22221—2008 食品中果糖葡萄糖蔗糖麦芽糖乳糖的测定: 高效液相色谱法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.
[20] 魏金凤, 张志娟, 李冬冬, 等. 离子液体辅助萃取山高粱中4种黄酮类成分的研究[J]. 中国中药杂志, 2015, 40(7): 1305-1310.
[21] 王利, 吴洁, 李凯锋, 等. 乳糖不耐受及其相关性的研究[J]. 科技创新导报, 2010(28): 4-5.
[22] 李静芳, 张素文, 彭美纯, 等. 高效液相色谱法检测乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的含量[J]. 食品工业科技, 2011, 32(6): 391-393. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.06.099.
[23] 刘薇, 李冬冬, 杨洪帅, 等. 超声辅助离子液体-反相液相色谱法测定赤芍中齐墩果酸和芍药苷的含量[J]. 中国中药杂志, 2015, 40(3): 443-449. DOI:10.4268/cjcmm20150314.
[24] 王浩, 刘艳琴, 杨红梅, 等. 液相色谱-质谱联用技术测定无糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖[J]. 分析化学, 2010, 38(6): 873-876. DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00873.
Comparative Detection of Lactose and Sucrose in Milk Powder by Lane-Eynon’s Method and High Performance Liquid Chromatography with Refractive Index Detector
GUO Xiuchun1,2, GUO Xiaobai3, ZHANG Miaomiao3, MA Jiaohao3, KANG Wenyi1,2,*
(1. Institute of Chinese Materia, Pharmaceutical College, Henan University, Kaifeng 475004, China; 2. Kaifeng Key Laboratory of Functional Components in Health Food, Kaifeng 475004, China; 3. Minsheng College, Henan University, Kaifeng 475004, China)
Abstract: Lactose and sucrose in milk powder from the same commercial brand for two different age groups were assayed by the Lane-Eynon’s method and high performance liquid chromatography with refractive index detector (HPLC-RID). The differences in lactose and sucrose contents among different samples were analyzed, and the results of the two methods were compared. It was indicated that the accuracy of the HP LC-RID method was higher than that of the Lane-Eynon’s method. The linear ranges of the HPLC method for sucrose and lactose were both 2–12 mg/mL with correlation coefficients of 0.999 3 and 0.999 6, respectively. The precision, expressed as relative standard deviations, for sucrose and lactose were 2.53% and 3.81%, respectively. The average recovery rates were 99.70% and 101.06%, respectively. The HPLC method had some advantages such as high accuracy, short analysis time, simple sample pretreatment and suitability for rapid determination of sucrose and lactose contents in milk powder.
Key words: Lane-Eynon’s method; high performance liquid chromatography with refractive index detector (HPLC-RID); milk powder; lactose; sucrose
收稿日期：2016-02-15
基金项目：2016年度河南省高校科技创新团队项目（16IRTSTHN019）；2015年河南省教育技术装备和实践教育研究立项课题（GZS008）；河南大学民生学院2015年度大学生创新创业训练计划项目（MSCXCY2015053）
作者简介：郭秀春（1982—），女，讲师，博士，主要从事活性天然产物研究。E-mail：guoxiuchun1982@163.com
*通信作者：康文艺（1972—），男，教授，博士，主要从事活性天然产物研究。E-mail：kangweny@hotmail.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612024
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）12-0139-05