葡萄酒泥酵母制备水溶性β-D-葡聚糖
工艺优化及其纯化后抗氧化性分析

杨学山1,2，祝 霞2,3，李 颍2,3，杨 婷2,3，马腾臻2,3，韩舜愈2,3

（1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

摘 要：以诱导自溶后的葡萄酒泥酵母细胞壁为试材，采用蛋白酶水解法，通过响应面分析法确定制备水溶性
β-D-葡聚糖的最佳工艺条件，将粗品经Sephacryl S-400 HR凝胶柱层析纯化后，对其抗氧化性进行分析。结果表明，酶解制备水溶性β-D-葡聚糖的最佳工艺条件为浸提温度60 ℃、加酶量247 U/mL、pH 7.5、浸提时间1.5 h，得率为80.91%。凝胶柱层析纯化后得到3 种组分，比例依次为组分Ⅰ 68.08%、组分Ⅱ 13.97%、组分Ⅲ 8.79%，其中组分Ⅰ分子质量为100 065.18 D。纯化后的水溶性β-D-葡聚糖清除ABTS＋•、羟自由基、DPPH自由基、O2－•和螯合Fe2＋
的EC50值分别为2.035、6.352、16.773、5.238、1.061 mg/mL，具有良好的抗氧化活性。

关键词：葡萄酒泥酵母；可溶性β-葡聚糖；提取纯化；抗氧化

Purification and Antioxidant Activities of Water-Soluble β-D-Glucan from Waste Wine Yeast

YANG Xueshan1,2, ZHU Xia2,3, LI Ying2,3, YANG Ting2,3, MA Tengzhen2,3, HAN Shunyu2,3

(1. College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;

2. Key Laboratory of Viticulture and Oenology, Gansu Province, Lanzhou 730070, China;

3. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Abstract: An enzymatic method was used to prepare water-soluble β-D-glucan from the autolyzed cell wall of waste wine yeast. Single factor method and response surface methodology were applied to optimize the extraction conditions. The water-soluble β-D-glucan was purified by Sephacryl S-400 HR gel column chromatography to investigate its antioxidant activities. The optimum conditions for β-D-glucan extraction were determined as follows: temperature, 60 ℃; enzyme dosage, 247 U/mL;
pH, 7.5; and time, 1.5 h. Under these conditions, the yield of water-soluble β-D-glucan was 80.91%. Three components designated asⅠ, Ⅱ and Ⅲ were eluted from the chromatographic column, the contents of which were 68.08%, 13.97% and 8.79%, respectively. The relative molecular weight of componentⅠ was 100 065.18 D. Antioxidant activity studies showed that the purified water-soluble β-D-glucan had good antioxidant activities with EC50 values for scavenging, 2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate (ABTS+•), hydroxyl radical, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH) radical and superoxide anion radical and chelating Fe2+ of 2.035, 6.352, 16.773, 5.238 and 1.061 mg/mL, respectively.

Key words: wine yeast; water-soluble β-D-glucan; extraction and purification; antioxidant activities

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614005

中图分类号：TS261.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2016）14-0024-08

引文格式：

杨学山, 祝霞, 李颍, 等. 葡萄酒泥酵母制备水溶性β-D-葡聚糖工艺优化及其纯化后抗氧化性分析[J]. 食品科学, 2016, 37(14): 24-31. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614005. http://www.spkx.net.cn

YANG Xueshan, ZHU Xia, LI Ying, et al. Purification and antioxidant activities of water-soluble β-D-glucan from waste wine yeast[J]. Food Science, 2016, 37(14): 24-31. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614005. http://www.spkx.net.cn

葡萄酒发酵过程中产生的大量酵母细胞中含有丰富的多糖、氨基酸、维生素、酶及矿物质，是开发生物活性物质的优良资源[1]。但在实际生产中酒泥酵母常被当作饲料、肥料甚至垃圾处理，不仅未能充分体现其经济价值，而且形成了很大的环保压力，已成为葡萄加工业亟需解决的行业性问题[2-3]。

β-D-葡聚糖约占酵母细胞壁干物质含量的60%，具有抗肿瘤、抗辐射、抗氧化等功能[4-5]，可广泛用于化妆品、食品、医药等领域[6-8]。研究[9-10]表明，酵母葡聚糖在水中的溶解度与其分子内部的聚合度、分支度和化学修饰有关，直接提取的β-D-葡聚糖水溶性差，限制了其实际应用。因此，探索安全、高效的增溶工艺，获得大分子质量的可溶性β-D-葡聚糖是促进其产业化推广的关键问题之一。目前已有通过化学修饰法制备可溶性β-D-葡聚糖的相关报道[11]，但存在潜在安全隐患；生物酶是通过特异性或非特异性地作用于葡萄糖苷键，将多糖裂解为聚合度较低的低聚糖以增强其溶解性的新方法[12]。
王成龙等[13]采用葡聚糖酶降解不溶性葡聚糖，由于葡聚糖酶可专一作用于葡聚糖主链的β-1,3-D-糖苷键，很容易将多糖降解为分子质量过低的低聚糖或寡糖，从而严重影响其生物活性，使获得的水溶性多糖失去应用价值。近年来，一些非专一性酶受到了重视，余奕珂等[14]采用来自于芽孢杆菌的Alcalase蛋白酶将酵母葡聚糖水解为分子质量较大的可溶性低聚糖，且保持了多糖生物活性及功能。

本实验以诱导自溶后的葡萄酒泥酵母细胞壁为原料，采用响应面分析法对酶法水解制备水溶性β-D-葡聚糖的工艺进行优化，并将粗品经Sephacryl S-400 HR凝胶柱层析纯化后，系统研究其体外抗氧化作用，以期为降低酵母多糖生产成本、拓展应用领域、促进葡萄酒泥酵母的资源化开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄酒酵母泥 甘肃祁连葡萄酒业有限公司；葡萄糖标准品 美国Sigma公司；中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶 中国Biosharp公司；兰色葡聚糖、Dextran标准品 美国Pharmacia公司；2,2’-联氮基-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、菲洛嗪、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH） 上海源叶生物科技有限公司；冰乙酸、异丙醇、无水乙醇、氯化钠、乙酸钠、蒽酮、乙二胺四乙酸等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDZ5-WS湘仪离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；HH-1数显恒温水浴锅 上海梅香仪器有限公司；
TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-3C型pH计 上海雷磁有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水溶性β-D-葡聚糖提取工艺流程

葡萄酒泥→诱导自溶→除甘露聚糖→除脂质→酶解→
乙醇醇析（酶解液-乙醇体积比2∶1，12 h）→丙酮、乙醚洗涤（15 min，2 次）→透析→冷冻干燥→水溶性β-D-葡聚糖样品

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 酵母自溶

参照本实验室已建立的方法，称取4 g葡萄酒泥酵母，溶于质量分数2% NaCl溶液、pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，47.5 ℃诱导自溶33 h。

1.3.2.2 除甘露聚糖

称取2.5 g自溶后的酵母细胞壁，以料液比1∶23在124 ℃条件下（高温灭菌锅）热水浸提5 h，离心后取沉淀。

1.3.2.3 除脂质

将沉淀用蒸馏水洗涤2～3 次，加入3 mL体积分数为4%的冰乙酸溶液，室温条件下放置2 h，将离心后的沉淀用蒸馏水洗涤2 次，以料液比1∶2加入异丙醇，4 ℃静置过夜，离心取沉淀。

1.3.2.4 酶解

向沉淀中加一定量酶液，在适当pH值及温度条件下酶解一定时间，85 ℃灭酶15 min，离心取上清液。

1.3.2.5 透析

向上清液加入无水乙醇醇析，丙酮、乙醚洗涤后沉淀用蒸馏水溶解，所得溶液依次用蒸馏水透析48 h、蒸馏水透析24 h，透析完成后，将透析袋（8 000～14 000 D）内溶液进行冷冻干燥，即得水溶性β-D-葡聚糖。

1.3.3 水解酶的筛选

以中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶3 种蛋白酶为水解酶，在其各自最适酶解条件（参照产品说明书）下水解3 h（表1），以水溶性β-D-葡聚糖得率为评价指标，对3 种不同蛋白酶的酶解效果进行评价，筛选水解效果较好的酶。

表 1 不同酶的最适酶解条件

Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions for different enzymes

1.3.4 单因素试验设计

称取1 g葡聚糖沉淀，分散到20 mL的磷酸缓冲溶液中，加入碱性蛋白酶进行水解，分别考察浸提温度（50、55、60、65、70 ℃）、浸提时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、加酶量（100、150、200、250、300 U/mL）和缓冲液pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响。

1.3.5 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，以水溶性β-D-葡聚糖得率为响应值，设计四因素三水平的响应面分析试验，优化提取工艺。

1.3.6 水溶性β-D-葡聚糖含量测定

1.3.6.1 标准曲线的制作

参照文献[15]的方法并修改，准确配制葡萄糖质量浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL，加入4 mL 0.2%蒽酮试剂，混合均匀后迅速冷却，煮沸10 min后取出，迅速冷却，室温放置10 min。于620 nm波长条件下比色，记录吸光度。以葡萄糖标准品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得标准曲线方程为：
y=7.202 9x＋0.001 9，相关系数R2=0.999 3。

1.3.6.2 样品制备及测定

称取固体样品25 mg放入水解管中，加入2.7 mol/L的H2SO4 6.75 mL后封管，置于100 ℃沸水浴中水解3 h，冷却至室温，水解液转入容量瓶定容备用。取样液1 mL，按1.3.6.1节方法测吸光度，以标准曲线方程计算水溶性β-D-葡聚糖质量浓度。

1.3.7 水溶性β-D-葡聚糖得率计算

（1）

1.3.8 水溶性β-D-葡聚糖凝胶柱层析

1.3.8.1 水溶性β-D-葡聚糖纯化

取制备的水溶性β-D-葡聚糖样品进行凝胶柱层析，将其上样到已平衡好的Sephacryl S-400 HR凝胶柱（1.0 cm×50 cm）上。其中，上样量为10 mg，上样体积为1 mL，用含0.5 mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱流速为2 mL/min，自动收集器收集洗脱液，每管馏分2 mL，采用紫外分光光度法进行跟踪检测，收集合并主峰，测定水溶性β-D-葡聚糖含量[16]。

1.3.8.2 水溶性β-D-葡聚糖相对分子质量测定

凝胶柱用0.5 mol/L的NaCl溶液平衡60 h后分别用3 mg兰色葡聚糖和Dextran标准品（T500、T70、T40、T10）相继上柱，测得外水体积V0和洗脱体积V，以分子质量对数lgMw为纵坐标，V/V0为横坐标绘图，制作标准曲线。

将纯化的水溶性β-D-葡聚糖上样，分部收集流出液（1 mL/管）。水溶性β-D-葡聚糖采用蒽酮-硫酸法检测糖峰，分别测定洗脱体积V1，依据V1/V0从标准曲线求得样品分子质量[17]。

1.3.9 水溶性β-D-葡聚糖体外抗氧化活性测定

1.3.9.1 抗氧化物制备

参照文献[18]方法并修改，将分离制备的水溶性β-D-葡聚糖，采用活性炭脱色法去除其中的色素成分，100 ℃加热浓缩、干燥后配制质量浓度为1.1、1.6、2.1、2.6、3.1、3.6、4.1 mg/mL的水溶性β-D-葡聚糖测定液，并配制相同质量浓度的阳性对照VC和EDTA溶液。

1.3.9.2 ABTS＋•清除能力测定

参照文献[19]方法并修改。以VC作阳性对照，计算如式（2）所示：

（2）

式中：A0为ABTS工作液和乙醇的吸光度；A1为ABTS工作液和水溶性β-D-葡聚糖的吸光度。

1.3.9.3 羟自由基清除能力测定

参照文献[20]。以VC为阳性对照，计算如式（3）所示：

（3）

式中：A0为空白对照吸光度；A1为水溶性β-D-葡聚糖存在条件下的吸光度；A2为只含水溶性β-D-葡聚糖的吸光度。

1.3.9.4 DPPH自由基清除能力测定

参照文献[20]。以VC为阳性对照，计算如式（4）所示：

（4）

式中：A0为DPPH和磷酸钠盐缓冲液的吸光度；A1为DPPH和水溶性β-D-葡聚糖溶液的吸光度；A2为水溶性β-D-葡聚糖和磷酸钠盐缓冲液的吸光度。

1.3.9.5 O2－•清除能力测定

参照[21]方法并修改。以VC为阳性对照，计算如式（5）所示：

（5）

式中：ΔA0为邻苯三酚自氧化速率；ΔA1为加入水溶性β-D-葡聚糖水解液后邻苯三酚的氧化速率；A2为只含水溶性β-D-葡聚糖时的吸光度。

1.3.9.6 Fe2+螯合能力测定

参照[20]方法并修改。以EDTA为阳性对照，计算如式（6）所示：

（6）

式中：A0为不含水溶性β-D-葡聚糖的吸光度；A1为在水溶性β-D-葡聚糖存在时的吸光度。

1.3.10 半数有效浓度（median effective concentration，EC50）计算

EC50是指清除率为50%时水溶性β-D-葡聚糖、VC或EDTA的质量浓度，采用Logit回归计算。EC50可作为评价抗氧化能力的重要参数，如某种物质的EC50低于10 mg/mL，则表明其具有很好的抗氧化活性[22]。

1.4 数据分析

实验设3次重复，数据采用Excel 2007软件进行整理和图表处理，SPSS 17.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 水解酶筛选结果

图 1 3 种酶对水溶性β-D-葡聚糖酶解效果

Fig. 1 Comparison of extraction efficiencies of water-soluble β-D-glucan with three enzymes

由图1可知，3 种蛋白酶中碱性蛋白酶对β-D-葡聚糖水溶化效果最好，在酶解时间为1.5 h时水溶性β-D-葡聚糖得率最大，达70.70%。胰蛋白酶和中性蛋白酶分别在1.5、2.0 h时达到最大52.66%和53.26%，均低于碱性蛋白酶。因此，选择碱性蛋白酶为水溶性β-D-葡聚糖制备工艺优化的最适用酶。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 浸提温度对水溶性β-D-葡聚糖提取的影响

图 2 浸提温度对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响

Fig. 2 Effect of temperature on the yield of water-soluble β-D-glucan

由图2可知，浸提温度为60 ℃时，水溶性β-D-葡聚糖得率最大，为71.76%，所以选择60 ℃为制备水溶性β-D-葡聚糖的较佳温度。当温度小于或大于60 ℃时，都会使得率降低，这是由于温度较低，活化分子数较少，未达到酶促反应的最适温度，反应不充分；温度过高，会增加构成酶本身蛋白质结构的分子热能，增加多重弱非共价键相互作用破裂的机会，最终导致酶的变性，导致水溶性β-D-葡聚糖得率下降[23]。

2.2.2 浸提时间对水溶性β-D-葡聚糖提取的影响

图 3 浸提时间对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响

Fig. 3 Effect of extraction time on the yield of water-soluble β-D-glucan

由图3可知，浸提时间不同，水溶性β-D-葡聚糖得率也有所不同。当浸提时间为1.5 h时，水溶性β-D-葡聚糖得率最大，为71.01%，所以选择1.5 h为制备水溶性β-D-葡聚糖的较佳时间。当浸提时间小于1.5 h时，酶解过程不彻底，水溶性β-D-葡聚糖得率较低；若时间过长，会使葡聚糖降解，杂质相应的也被提取出来，也会导致得率降低[24]。

2.2.3 加酶量对水溶性β-D-葡聚糖提取的影响

图 4 加酶量对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响

Fig. 4 Effect of enzyme dosage on the yield of water-soluble β-D-glucan

由图4可知，随着加酶量的增加，水溶性β-D-葡聚糖得率呈现一个先上升后下降的趋势，在加酶量为
250 U/mL时得率最大，为79.06%，因此选择250 U/mL为制备水溶性β-D-葡聚糖的较佳加酶量。当加酶量低于250 U/mL时，酶未能充分与底物接触并发挥水解作用，水解不彻底，导致得率降低[23]；酶量过大，会大量作用于己经水解的葡聚糖，产生二糖、单糖等，从而导致水溶性β-D-葡聚糖得率降低。

2.2.4 pH值对水溶性β-D-葡聚糖提取的影响

图 5 pH值对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响

Fig. 5 Effect of pH on the yield of water-soluble β-D-glucan

由图5可知，不同pH值处理对水溶性β-D-葡聚糖的制备也有较明显影响。随着pH值的升高，水溶性β-D-葡聚糖得率增大，pH值达到7.5时得率最大，为79.06%。随后当pH值升高到8.0时，葡聚糖得率有轻微下降。究其原因是由于不同pH值处理会影响水解酶的活性，当pH值为7.5时，达到酶的最适pH值，水解效果最明显，而当pH值偏离最适pH值时，会对酶的空间结构造成破坏，使酶活降低。但由于所用碱性蛋白酶的最适pH值范围为7.0～8.0，因此，水溶性β-D-葡聚糖得率下降较少。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 回归模型的确定

表 2 Box-Behnken响应面试验结果

Table 2 Results of Box-Behnken response surface experiments

利用Design-Expert 7.0软件对表2进行二次多项回归拟合试验和方差分析，反映浸提温度、浸提时间、加酶量和pH值对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响，拟合所得多元二次回归方程如下：

Y=－1 098.144 62＋22.116 45X1＋115.494 15X2＋
0.293 58X3＋105.158 23X4－1.498 00X1X2＋
0.000 50X1X3＋2.037 12X1X4－0.036 140X2X3＋4.265 60X2X4＋0.184 51X3X4－0.294 40X12－16.240 18X22－0.003 33X32－18.656 43X42

该方程决定系数R2=0.984 3，校正决定系数R2Adj=0.968 7，因此，可以充分描述独立变量对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响。该模型回归方程P值小于0.000 1，模型极显著，模型拟合程度良好。

2.3.2 回归方程的方差分析

表 3 回归方程各项的方差分析

Table 3 Analysis of variance for all the terms of the regression equation

注：*. P＜0.05，差异显著；**. P＜0.01，差异极显著。

由表3可以看出，水溶性β-D-葡聚糖得率方程的一次项X3显著，二次项极显著，说明各具体因素对响应值的影响不是简单的线性关系。交互项X1X2、X1X4及X3X4极显著，说明X1和X2、X1和X4、X3和X4之间的交互作用很好，整个响应面基于各因素间的交互作用构成。另外，模型的变异系数为1.51%，证明回归方程拟合程度较好，说明试验具有很高的可信性和准确性。失拟项不显著，说明试验的误差很小。各因素的F值可以反映其对试验指标的重要性。F值越大，对试验指标的影响越大。从方差分析表可知各因素对水溶性β-D-葡聚糖得率的影响程度大小顺序为：加酶量＞浸提温度＞浸提时间＞pH值。

2.3.3 各因素之间交互作用的响应面分析

图 6 各因素交互作用对水溶性β-D-葡聚糖得率影响的响应面

Fig. 6 Response surface plots showing the effect of temperature, time, enzyme dosage and pH on the yield of water-soluble β-D-glucan

由图6及回归方程方差分析可知，因素X1与X2、X1与X4、X3与X4交互作用显著，而X1与X3、X2与X3及X2与X4之间的交互作用不显著。

2.3.4 验证实验结果

由响应面和等高线图以及回归方程分析可知，制备水溶性葡萄酒泥酵母β-D-葡聚糖最佳工艺条件为：浸提温度59.82 ℃、浸提时间1.5 h、加酶量247.47 U/mL、pH 7.48。为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件制备水溶性β-D-葡聚糖，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为浸提温度60 ℃、浸提时间1.5 h、加酶量247 U/mL、pH 7.5。按上述条件进行试验结果的验证，重复3次实际测得的水溶性β-D-葡聚糖得率分别为80.28%、81.12%、81.33%，平均得率为80.91%，与理论预测值（79.86%）相比，其相对误差约为1.31%。说明通过响应面优化得到的回归方程具有一定的实践指导意义。

2.4 分子质量测定结果

2.4.1 水溶性β-D-葡聚糖纯化

图 7 水溶性β-D-葡聚糖Sephacryl S-400 HR柱凝胶层析洗脱曲线

Fig. 7 Elution curve of water-soluble β-D-glucan on
Sephacryl S-400 HR column

由图7可知，不溶性β-D-葡聚糖经酶解后形成了片段不均一的水溶性糖成分，水解产物分为3类，分子质量较大的多糖组成的组分Ⅰ、分子质量较小的低聚糖组成的组分Ⅲ，以及分子质量介于两者之间的寡聚糖组成的组分Ⅱ。经蒽酮-硫酸法测定水溶性β-D-葡聚糖中各组分比例依次为组分Ⅰ 68.08%，组分Ⅱ13.97%，组分Ⅲ 8.79%。

2.4.2 分子质量计算结果

经Sephacryl S-400 HR凝胶层析，根据V/V0和标准品分子质量求得方程y=－0.632 7x＋6.714 9，R²=0.991 7。以葡萄酒泥水溶性β-D-葡聚糖的洗脱体积V1/V0，最终得水溶性β-D-葡聚糖（组分Ⅰ）的分子质量为100 065.18 D。

2.5 水溶性β-D-葡聚糖体外抗氧化活性测定结果

2.5.1 水溶性β-D-葡聚糖对ABTS＋•清除能力

由图8可知，水溶性β-D-葡聚糖清除ABTS＋•能力存在质量浓度相关性。在0～4.1 mg/mL范围内清除率增加趋势较稳定；而VC在0～1.1 mg/mL范围内对其清除率迅速增加，1.1～4.1 mg/mL范围内增加趋势相当缓慢。当质量浓度达到4.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖和VC对ABTS＋•清除率分别为73.16%、98.92%，EC50分别为2.035、0.467 mg/mL。

图 8 水溶性β-D-葡聚糖及VC对ABTS＋•的清除作用

Fig. 8 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against ABTS＋•

2.5.2 水溶性β-D-葡聚糖对羟自由基清除能力

图 9 水溶性β-D-葡聚糖及VC对羟自由基的清除作用

Fig. 9 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against hydroxyl radical

由图9可知，水溶性β-D-葡聚糖具有一定的羟自由基清除能力，清除率随质量浓度的增加而增大。在0～3.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖对羟自由基清除率增加缓慢，3.1～4.1 mg/mL范围内出现较明显的上升；而VC在0～1.1 mg/mL范围时，清除率增加明显，之后趋势变缓。当二者质量浓度达到4.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖和VC对羟自由基清除率分别为36.49%、99.02%，EC50分别为6.352、0.603 mg/mL。

2.5.3 水溶性β-D-葡聚糖对DPPH自由基清除能力

图 10 水溶性β-D-葡聚糖及VC对DPPH自由基的清除作用

Fig. 10 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against DPPH radical

由图10可知，水溶性β-D-葡聚糖对DPPH自由基的清除能力在整个测试质量浓度范围内变化不明显。当质量浓度由1.1 mg/mL升高至4.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖对DPPH自由基清除率由7.42%升高至21.51%，比阳性对照VC（98.89%）低77.38%。水溶性β-D-葡聚糖和VC清除DPPH自由基的EC50分别为16.773、0.440 mg/mL。

2.5.4 水溶性β-D-葡聚糖对O2－•清除能力

图 11 水溶性β-D-葡聚糖及VC对O2－•的清除作用

Fig. 11 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against O2－•

由图11可知，水溶性β-D-葡聚糖具有一定的O2－•清除能力。在0～4.1 mg/mL范围内，清除率变化趋于直线增加；VC质量浓度在0～1.6 mg/mL范围内时，清除率增加较快；当质量浓度达到4.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖对O2－•清除率为40.93%，而VC的清除率为99.15%。二者的EC50分别为5.238、0.756 mg/mL。

2.5.5 水溶性β-D-葡聚糖对Fe2＋螯合能力

图 12 水溶性β-D-葡聚糖及EDTA对Fe2＋的螯合作用

Fig. 12 Fe2+ Chelating effects of water-soluble β-D-glucan and EDTA

由图12可知，水溶性β-D-葡聚糖具有较强的Fe2＋螯合能力。当质量浓度达到4.1 mg/mL时，水溶性β-D-葡聚糖对Fe2＋螯合率为89.85%，EDTA螯合率为95.61%，EC50分别为1.061、0.232 mg/mL。

3 结 论

以诱导自溶后的葡萄酒泥酵母细胞壁为试材，采用响应面分析法优化了酶解制备水溶性β-D-葡聚糖的提取工艺条件。结果显示，在酶解温度60 ℃、加酶量
247 U/mL、pH 7.5的条件下酶解1.5 h制备得水溶性β-D-葡聚糖得率最大，达80.91%。经Sephacryl S-400 HR凝胶柱层析纯化后，水溶性β-D-葡聚糖中3 种组分比例依次为组分Ⅰ68.08%，组分Ⅱ 13.97%，组分Ⅲ 8.79%，其中组分Ⅰ分子质量为100 065.18 D。

体外抗氧化活性研究结果表明，水溶性β-D-葡聚糖对不同的自由基均有抗氧化作用。对清除ABTS＋•、羟自由基、DPPH自由基、O2－•和螯合Fe2＋的EC50分别为2.035、6.352、16.773、5.238 mg/mL和1.061 mg/mL，尤其对
ABTS＋•、O2－•的清除及螯合Fe2＋作用尤为显著。因此，从葡萄酒泥酵母中制备纯化的水溶性β-D-葡聚糖是一种良好的天然抗氧化剂，可以应用于食品、化妆品等行业。

参考文献：

[1] 李莹, 苏婷婷, 王战勇. 葡萄加工副产品的综合利用研究[J]. 中国农学通报, 2006, 17(4): 106-108.

[2] 郑鹤龄, 张斌, 潘洁, 等. 葡萄酒泥农业应用效果研究[J]. 天津农业科学, 2006, 21(3): 47-48.

[3] 王淮, 唐治玉, 熊善柏. 废啤酒酵母中β-1,3-D-葡聚糖的提取及成分分析[J]. 华中农业大学学报, 2006, 24(6): 626-629. DOI:10.13300/j.cnki.hnlkxb.2005.06.021.

[4] 王静, 戴军, 陈尚卫, 等. 提取酵母细胞壁中β-D-葡聚糖的新方法[J]. 食品与发酵工业, 2011, 37(1): 189-193. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2011.01.043.

[5] LIMBERGER V M, FRANCISCO A D, CHAN A, et al. Barley β-glucans extraction and partial characterization[J]. Food Chemistry, 2014, 47(4): 84-89.

[6] LIU X Y, WANG Q, LIU H Z, et al. A new isolation method of β-D-glucans from spent yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Food Hydrocolloids, 2008, 22(2): 239-247.

[7] BORCHANIA C, FONTEYNB F, JAMINB G, et al. Enzymatic process for the fractionation of baker’s yeast cell wall (Saccharomyces cerevisiae)[J]. Food Chemistry, 2014, 47(1): 108-113.

[8] 董兴叶, 孙楚, 刘瑶, 等. 超声波法对燕麦β-葡聚糖提取及性质的影响[J]. 食品工业科技, 2014, 35(16): 294-297. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.056.

[9] 王英杰, 苏理, 兰文忠, 等. 水溶性β-1,3-葡聚糖制备及应用研究的进展[J]. 食品与药品, 2014, 23(2): 222-226.

[10] 黄国宏. 酵母β-1,3-D-葡聚糖硫酸酯制备工艺的研究[J].
食品工业科技, 2009, 30(8): 261-263. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2009.08.009.

[11] 王庆华, 刘山, 崔炳权, 等. 废弃酵母渣提取β-葡聚糖及其羧甲基化的研究[J]. 酿酒科技, 2009, 29(8): 120-122. DOI:10.13746/j.njkj.2009.08.015.

[12] 张学况, 杜丽平, 王超, 等. 酶解法增溶酵母(1→3)-β-D-葡聚糖的研究[J]. 食品与发酵工业, 2012, 38(7): 48-52. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2012.07.012.

[13] 王成龙, 王英珍, 张健, 等. 水溶性酵母葡聚糖的制备及应用研究进展[J]. 动物医学进展, 2010, 31(12): 128-131.

[14] 余奕珂, 白雪芳, 杜昱光. 可溶性酵母葡聚糖的制备及其活性研究[J].
中国生化药物杂志, 2010, 31(4): 254-257.

[15] 杨婷, 祝霞, 李颍, 等. 葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取工艺条件优化[J]. 食品工业科技, 2015, 36(18): 286-289. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.049.

[16] 许文涛, 张方方, 罗云波, 等. 荞麦水溶性多糖的分离纯化及其分子质量的测定[J]. 食品科学, 2009, 30(14): 22-24.

[17] 张玉香, 尹卓荣. 甘露糖蛋白的提纯及分子质量测定[J]. 酿酒科技, 2005, 25(2): 72-74. DOI:10.13746/j.njkj.2005.04.027.

[18] 徐韧博. 松塔多糖的分离纯化、结构鉴定及抗氧化活性研究[D]. 哈尔滨: 哈尔滨工业大学, 2013.

[19] WANG Y, YI L, HU Y. Optimization of polysaccharides extraction from Trametes robiniophila, and its antioxidant activities[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 111(20): 324-332.

[20] MACHOVA E, BYSTRICKY S. Antioxidant capacities of mannans and glucans are related to their susceptibility of free radical degradation[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 61(10): 308-311.

[21] YE C L, HU W L, DAI D H. Extraction of polysaccharides and the antioxidant activity from the seeds of Plantago asiatica L.[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 49(6): 466-470.

[22] LEE J, KOO N, MIN D B. Reactive oxygen species, aging, and antioxidativenutraceuticals[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2004, 42(3): 21-33.

[23] 晁正, 冉玉梅, 杨霞, 等.麦麸中低聚木糖的制备及抗氧化活性研究[J].
核农学报, 2014, 21(4): 655-661.

[24] 马国刚, 王建中. 超声波辅助提取青稞β-葡聚糖的工艺条件优化[J]. 食品科技, 2009, 34(11): 168-174. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2009.11.061.