张文静，陈舜胜*
（上海海洋大学食品学院，上海 201306）
摘 要：为研究虾壳中复合钙粉的制取工艺及评价大鼠对其吸收效果，以南美白对虾虾壳为研究对象，采用胰蛋白酶-柠檬酸法制取钙粉，进而以缺钙为模型研究大鼠对复合钙粉的吸收效果。结果表明：采用胰蛋白酶-柠檬酸制取复合钙粉的最佳工艺为加酶量2.5×103U/g、酶解pH 8.0、酶解时间1.5 h、酶解温度45 ℃，此时，蛋白水解度为57.24%；柠檬酸浓度0.35 mol/L、柠檬酸用量20 mL、处理时间1.5 h时，钙溶出率为85.78%；制取的复合钙粉中钙含量为19.6%，总氨基酸含量为18.3%。复合钙粉质地细腻，呈淡褐色，无异味。动物实验表明，从虾壳中制取的复合钙粉的大鼠钙吸收效果显著（P＜0.05），灌胃剂量66.5 mg/（kg·d）（以钙含量及大鼠体质量计）的复合钙粉能明显提高大鼠血清钙、磷水平，促进大鼠正常生长。胰蛋白酶结合柠檬酸能有效地从虾壳中制取复合钙粉，其吸收效果优于相同钙含量的碳酸钙。
关键词：南美白对虾虾壳；复合钙粉；胰蛋白酶；柠檬酸
引文格式：
张文静， 陈舜胜.虾壳中复合钙粉的制备工艺优化及大鼠对其吸收效果的评价［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 1-5.
ZHANG Wenjing， CHEN Shunsheng.Preparation of blended calcium powders from shrimp shell and evaluation of its calcium absorption in rats［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 1-5.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614001. http://www.spkx.net.cn
我国水产资源丰富，其中虾类是人们日常消费的水产品，2012年全国对虾总产量超过153万 t，其中南美白对虾（Penaeus vannamei）130万 t［1］，从而产生大量的虾类废弃物。虾类副产物占到总虾类消费量的40%～48%，其中包括虾头和虾壳，仅有5%的下脚料是用于饲料。废弃物中主要有蛋白质（40%）、矿物质（35%）、几丁质（14%～30%）和虾青素为主的类胡萝卜素［2］。因此，虾类产品副产物的加工具有广泛的利用前景。
2000—2007年中国居民膳食钙摄入的调查中发现，每人日均钙摄入量为410 mg，远低于推荐摄入量的800 mg［3］。2012年对1 098 例妇女进行调查，发现绝经后正常补钙者仅占24.50%，非特殊人群在特殊时期并没有重视补钙［4］。因此，补钙已成为人们极为关注的问题。目前，市售的补钙制剂可谓是琳琅满目，在钙制剂的种类、吸收效果的比较研究中，不同专家学者各有进展。已有文献利用煅烧蛤蜊（Clam mercenaria）壳的方法制备活性钙，利用猪骨、牛骨、鱼骨制备多肽钙制剂的研究甚多［5-11］。而利用虾壳中的蛋白、钙开发良好的补钙制品鲜有报道。
传统虾壳脱蛋白脱钙方式是利用强酸强碱，该方法虽提取效率高，但因其有腐蚀性且对环境有影响等原因不被认可。因此，在寻找一种比较温和处理方式的同时，又不至于引入强酸强碱，酶法、乳酸菌发酵法、有机酸等处理方式受到推崇［12-16］。
本实验以南美白对虾虾壳为主要原料，采用酶法与有机酸结合的方式回收虾壳中的蛋白与钙质，利用胰蛋白酶酶解及柠檬酸处理虾壳制取复合钙粉，这种温和的处理方式对于虾壳中的其他成分如甲壳素等影响甚少，从而能实现其综合利用。而后建立缺钙模型探究大鼠对复合钙粉钙吸收效果，从而实现废弃虾壳再利用的生产价值，对虾类废弃物的进一步深加工提供理论依据。
1.1 材料与试剂
新鲜南美白对虾购置于上海芦潮港海鲜市场，将虾肉剥离后，收集新鲜虾壳。虾壳与整虾质量比约为1∶10，经挑选除杂、洗净、烘干、粉碎后备用。
胰蛋白酶（按料液比1∶2 5 0稀释，酶活力≥50 000 U/g）、盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、柠檬酸钠、柠檬酸钙、氢氧化钾、甲醛、0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；4 周龄SD（Sprague-Dawley）大鼠50 只 上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.2 仪器与设备
HJ-4A多头磁力加热搅拌器 广州沪瑞明仪器有限公司；KESUN CG603研磨机 广东科嘉霖电器制造有限公司；石墨炉消化炉 长沙基隆仪器有限公司；BS-200全自动生化分析仪 迈瑞医疗国际有限公司；MARS6微波消解仪 美国CEM公司；Zoonit700原子吸收分光光度仪 德国耶拿公司；L-8800氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司。
1.3 方法
1.3.1 原料制备
南美白对虾虾壳经挑选去杂后，用清水反复冲洗至上清液澄清，沥干后放入鼓风干燥箱中80 ℃干燥6 h，研磨机粉碎，过筛（60 目），放入干燥器中常温保存。
称取2 g虾壳粉，加入20 mL去离子水，均质5 min后，于磁力搅拌器上搅拌消泡30 min。
1.3.2 复合钙粉的制备
1.3.2.1 酶解处理
将均质后虾壳粉水解液置于恒温水浴锅内，至温度上升为最适酶解温度时，调节pH值。按比例加胰蛋白酶。在酶解过程中，每间隔10～15 min以pH计监控pH值，并用盐酸或氢氧化钠调节，使酶解pH值保持恒定。反应结束后取出酶解液于沸水浴中煮沸10 min灭酶，离心（5 000 r/min，15 min）得上清液，4 ℃保存样品，测定上清液游离氨基酸态氮含量，按式（1）计算水解度［12］，以蛋白已水解肽键数与原料中总肽键数的比值计。
式中：A1为水解液中游离氨基酸态氮的含量/g；B1为原料中总氮含量/g；C1为原料中游离氨基酸态氮的含量/g；D1为粗甲壳素中氮含量/g。
1.3.2.2 柠檬酸处理
酶解后下层沉淀物中分别加入不同浓度（0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mol/L）和不同用量（5、8、10、12、14、16、18、20、22、24 mL）柠檬酸，置于磁力搅拌器上酸解处理一定的时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h）后（某一条件改变时固定条件分别为柠檬酸浓度0.35 mol/L、用量20 mL、处理时间1.5 h），离心（5 000 r/min，15 min）得上清液，4 ℃保存样品，利用火焰原子吸收法测定钙含量，按式（2）计算钙溶出率［17］。
1.3.2.3 烘干成粉
将酶解、柠檬酸处理虾壳粉后所得的上层液合并，经95 ℃真空蒸发浓缩、100 ℃鼓风烘干后制得复合钙粉。
1.3.3 酶解正交试验
通过参考文献［18］及预实验结果，初步选择胰蛋白酶处理虾壳粉酶解加酶量、酶解时间、酶解pH值、酶解温度为因素，以蛋白水解度为指标，确定最佳酶解条件，正交试验因素与水平设计见表1。
表1 正交试验因素与水平
Table1 Factors and levelsused for orthog on almethodology
1.3.4 大鼠实验
1.3.4.1 大鼠组别
4 周龄断奶大鼠，体质量80 g左右，以基础饲料适应性喂养1 周后，称质量后挑选体质量无显著性差异的大鼠50 只。按照复合钙粉和碳酸钙中的钙含量计算各组钙剂用量，随机分成5 组：低钙对照组，碳酸钙对照组，复合钙粉低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10 只。
1.3.4.2 大鼠喂养方式
低钙对照组以低钙饲料喂养（低钙饲料配方［19］：酪蛋白19.4%、玉米淀粉39.4%、大豆油10%、麦芽糊精13.6%、蔗糖8.7%、纤维素5%、混合维生素1%、DL-蛋氨酸0.1%、酒石酸胆碱0.25%、特丁基对苯二酚0.002%、矿物质混合物2.5%、钙0.1%）。低、中、高剂量组在大鼠饲喂低钙饲料的基础上，每日灌胃低、中、高剂量钙的复合钙粉。灌胃剂量参照：800 mg（成人体质量60 kg）换算成13.3 mg/（kg·d），低、中、高剂量为人体剂量的2、5、10 倍［20］。即对应大鼠灌胃钙剂量为26.6、66.5、133 mg/（kg·d）（以钙含量及大鼠体质量计）。各组大鼠在相同环境下喂养，自由进食，每周称1 次体质量。
1.3.4.3 钙吸收率的测定
喂养大鼠至第4周后，放入代谢笼进行3 d代谢实验，而后收集粪便、尿液将其置于100 ℃烘箱中干燥，利用火焰原子吸收法测定代谢产物中钙的含量。
1.3.4.4 大鼠血清生化指标的测定
喂养大鼠至8 周后处死，取其动脉血2 mL，静止放置30 min 后，在低温条件下离心（10 000 r/min，10 min）取上层血清，利用全自动生化分析仪测定血清中钙、磷含量、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量。
1.4 数据处理
所有测定数据均重复3 次，测定的平均值及标准偏差分别通过SSPS 17.0软件处理，P＜0.05被认为有显著性差异。
2.1 复合钙粉制备工艺条件的确定
2.1.1 胰蛋白酶酶解条件的优化结果
经测定，虾壳粉中粗蛋白含量为48.94%，粗脂肪含量为1.45%，灰分含量为24.61%（其中18.85%为钙）。正交试验设定酶解过程蛋白水解度大小反映蛋白水解的程度，从而得到最优的胰蛋白酶酶解条件。
表2 正交试验设计与结果
Table2 Resultso for thog on alarraymethodology
表3 方差分析与显著性分析结果
Table3 Results of analysis of variance and significancetest
注：*.差异显著（P＜0.05）。
正交试验酶解反应蛋白水解度在48%～56%之间（表2）。从表3可看出，各因素对蛋白水解度的影响程度为加酶量＞酶解时间＞酶解pH值＞酶解温度，加酶量对蛋白水解度影响显著。胰蛋白酶水解虾壳粉以水解度为指标，最佳水解工艺参数为A1B2C1D3，即加酶量2.5×103U/g、酶解pH 8.0、酶解时间1.5 h、酶解温度45 ℃。在此条件下进行3 次验证实验，得出水解度为57.24%，钙溶出率为7.18%。证实了酶解对脱蛋白的效果较好。
2.1.2 柠檬酸处理条件的确定
图 1 柠檬酸浓度（a）、柠檬酸用量（b）、处理时间（c）对钙溶出的影响
Fig.1 Effects of citric acid concentration， dosage， and treatment time on calcium dissolution
柠檬酸浓度、用量在置换反应中起关键作用。低柠檬酸浓度时，在磁力搅拌的作用下，柠檬酸将虾壳中钙质置换成Ca2+的能力弱，无法高效地制取钙剂。随着柠檬酸浓度的增加，在0.35 mol/L钙溶出率达到最大（图1a）。柠檬酸用量在20 mL时得到最大钙溶出率，之后趋于平缓（图1b）。而酸处理时间在1.5 h时，钙质基本溶出（图1c）。柠檬酸在浓度0.35 mol/L、用量20 mL、处理时间1.5 h时效果最佳，钙溶出率高达85.78%。该工艺方法优于韩凯宁等［21］对南美白对虾虾壳于80 ℃水浴中利用柠檬酸结合甘氨酸处理0.5 h的工艺（钙溶出率25%左右）。
复合钙粉主要成分中钙含量达到19.6%，总氨基酸含量达到18.3%，脂肪含量仅0.44%，水分含量3.6%，无机砷、铅含量小于0.000 1%。钙粉呈淡黄色，无异味。
2.2 大鼠摄入复合钙粉对其生长及钙吸收效果的评价
2.2.1 大鼠摄入复合钙粉对其生长的影响
饲养期间，实验动物未出现明显疾病和死亡。实验初期各组大鼠体质量、身长无明显差异。喂养4 周后，复合钙粉各剂量大鼠生长情况良好。复合钙粉各剂量组大鼠体质量均显著高于低钙对照组（P＜0.05，表4）。低钙对照组大鼠生长指标明显低于其他剂量组，此时大鼠毛色暗淡无光泽，倦怠行动迟缓。表明缺钙确实会抑制大鼠生长发育，因此摄入足量的钙质是保证大鼠正常生长的前提。
表 4 复合钙粉对大鼠生长的影响（x±s，n=10）
Table 4 Body weight and length of rats in each group （x±s，n= 10）
注：同列字母不同表示差异显著（P＜0.05），下同。
2.2.2 大鼠摄入复合钙粉对其钙吸收情况的评价
表 5 复合钙粉对大鼠体内钙吸收的影响（x±s，n=10）
Table 5 Effect of different calcium sources on calcium absorption in rats （x±s，n= 10）
摄入各剂量复合钙粉的大鼠，其钙表观吸收率、钙储存率均显著低于低钙对照组（P＜0.05，表5），低钙摄入时能较好地得以吸收。与正常对照组、碳酸钙对照组相比，复合钙粉各剂量间中剂量组大鼠表观钙吸收效果最好。复合钙粉中剂量组大鼠的钙表观吸收率及钙储存率均高于低、高剂量组，表明钙摄入量的高低与其吸收率不呈正比。随着钙摄入量增多，当其吸收达到平衡后不再利用，随之代谢出更多的钙，吸收效果下降。因此摄入中剂量复合钙粉较高剂量相比吸收效好，利用率较高。
表 6 复合钙粉对大鼠血清水平的影响（x±s，n=10）
Table 6 Serum indexes related to calcium of rats in each group （
± s， n= 10）
钙离子经小肠吸收后进入血液，因此血清相关指标是评价钙吸收效果的重要指标。其中，中、高剂量组大鼠血清钙浓度均高于低钙对照组（P＜0.05，表6）；与碳酸钙对照组相比，复合钙粉中剂量组大鼠的血清钙浓度较高。可能是碳酸钙溶解性差，无法被小肠充分吸收，进入血清中的量少。而各组大鼠血清磷含量无显著性差异。血清中碱性磷酸酶活性、骨钙素含量水平为骨形成的特殊标志。大鼠在低钙情况下其血清碱性磷酸酶活性、骨钙素含量急剧增加且高于其他组，缺钙导致血清碱性磷酸酶、骨钙素水平失衡。
经综合分析，大鼠通过摄入复合钙粉后，其体内钙吸收效果优于碳酸钙，可作为一种良好的补钙产品。其中大鼠摄入中剂量66.5 mg/（kg·d）复合钙粉能有效地促进大鼠正常生长，保证血清中骨形成相关的蛋白酶水平稳定。
胰蛋白酶结合柠檬酸能有效地从虾壳中制取复合钙粉，其吸收效果优于相同钙含量的碳酸钙。胰蛋白酶-柠檬酸制取复合钙粉的最佳工艺为加酶量2.5×103U/g、酶解pH 8.0、酶解时间1.5 h、酶解温度45 ℃；柠檬酸浓度0.35 mol/L、柠檬酸用量20 mL、处理时间1.5 h。最优条件下，蛋白水解度为57.24%，钙溶出率为85.78%；复合钙粉中钙含量为19.6%，总氨基酸含量为18.3%。大鼠摄入中剂量66.5 mg/（kg·d）复合钙粉时，钙吸收效果最佳。因其成分中含有氨基酸、多肽等促钙吸收的蛋白水解物［22］，无需纯化钙粉，可作为营养补充剂与柠檬酸钙一起利用。
钙吸收利用率的高低直接影响其生物利用率。低钙对照组大鼠钙吸收率显著高于其他组，这与在“钙饥饿”状态下，钙吸收率增加的结果相符［23］。从大鼠体内钙吸收率、储存率结果得出，钙摄入量与吸收率不呈正比，可能是在钙摄入充足时，大鼠体内钙吸收代谢达到平衡。人体摄入钙并由小肠吸收之后进入血液，血清中的碱性磷酸酶活性、骨钙素水平是骨形成的标志。因此，血清指标亦是大鼠补钙效果评价的方式［24］。缺钙状态下，大鼠血清钙浓度偏低，碱性磷酸酶活性、骨钙素含量水平显著增加，标志着骨钙代谢偏高，无法促进大鼠正常生长。复合钙粉能有效地促钙吸收，可进一步作为补钙产品推向市场。
本工艺条件温和，不仅保证制取的钙制剂安全有效，也为高纯度甲壳素的制备提供了条件。大鼠实验确定了复合钙粉钙摄入剂量，在此基础上，需进一步将复合钙粉与其他类型钙剂进行对比，探索其生物利用率。最终可作为原料制备营养钙片，从而实现其利用价值。
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融合海洋食品科学的海洋生物药物项目（B5201120040）；上海市2015高校内涵建设项目（A2018150009）
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614001 10.7506/spkx1002-6630-201614001. http://www.spkx.net.cn
中图分类号：TS254.9
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）14-0001-05
收稿日期：2015-12-06
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31471685）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD28B05）；
作者简介：张文静（1990—），女，硕士，主要从事水产品加工利用研究。E-mail：zwj323@sina.com
*通信作者：陈舜胜（1956—），男，教授，硕士，主要从事水产品加工与贮藏研究。E-mail：sschen@shou.edu.cn
Preparation of Blended Calcium Powders from Shrimp Shell and Evaluation of Its Calcium Absorption in Rats
ZHANG Wenjing， CHEN Shunsheng*
（College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）
Abstract: Purpose: To optimize the preparation of blended calcium powders from shrimp shell and to evaluate its calcium absorption in rats.Methods: The extraction of blended calcium powders from shrimp shell （Penaeus vannamei） by the combined use of trypsin and citric acid was investigated.Furthermore， the effects of calcium powder on growth， calcium absorption in rats was studied by establishing calcium deficiency model.Results: The optimized preparation conditions were determined as follows: initial hydrolysis with 2.5 × 103U/g of trypsin at pH 8.0 and 45 ℃ for 1.5 h followed by treatment with 20 mL of 0.35 mol/L citric acid for 1.5 h.Under these conditions， the rate of proteolysis was 57.24%， and the dissolution rate of calcium was 85.78%.Furthermore， the calcium power contained 19.6% calcium and 18.3% total amino
acids， which was a hazel powder with a delicate texture and without off-flavor.Animal experiments showed that the calcium powder prepared from shrimp shell significantly improved calcium absorption in rats （P ＜ 0.05）， and that gavage dose of 66.5 mg/（kg·d） （calculate based on calcium content and the body weight of rats） could improve the contents of calcium and phosphorous in serum.Conclusion: Trypsin combined with citric acid offers a mild and effective way to extract blended calcium powder from shrimp shell， which exhibits better absorption than of CaCO3with the same calcium content.
Key words: shrimp shell； blended calcium powders； trypsin； citric acid.