黄丹丹1，沈 奇2，朱秋劲1，3，4，*，成 梅1，罗自生5，茅林春5
（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省油菜研究所，贵州 贵阳 550008；3.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州 贵阳 550025；4.国家牛肉加工技术研发分中心，贵州 惠水 550600；5.浙江大学馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058）
摘 要：探究酶法辅助对紫苏叶中迷迭香酸提取的最佳工艺，并评价其抗氧化活性。通过单因素试验研究纤维素酶添加量、酶解温度、时间和pH值对迷迭香酸提取得率的影响，采用响应面分析法和Box-Behnken试验设计优化纤维素酶法提取迷迭香酸的最佳工艺参数，并通过迷迭香酸对超氧阴离子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用来研究其抗氧化活性。结果发现，紫苏叶迷迭香酸最佳提取工艺为纤维素酶添加量3%、酶解温度45 ℃、酶解时间12 min、酶解pH 4，此工艺条件下，迷迭香酸提取得率为0.617%，实际值与理论值0.621%不存在显著性差异，结果合理可靠，可作为紫苏叶迷迭香酸的最佳提取工艺条件。紫苏叶迷迭香酸对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的抗氧化实验结果表明，迷迭香酸有较强的抗氧化活性。
关键词：紫苏；迷迭香酸；响应面；酶法提取；抗氧化活性
引文格式：
黄丹丹， 沈奇， 朱秋劲， 等.响应面法优化酶法辅助提取迷迭香酸工艺及其抗氧化活性［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 37-42.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614007. http://www.spkx.net.cn
HUANG Dandan， SHEN Qi， ZHU Qiujin， et al.Optimization of enzymatic extraction of rosemary acid by response surface methodology and its antioxidant activity［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 37-42.（in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614007. http://www.spkx.net.cn
紫苏（Perilla frutescens L.）又名桂茬，荏子、赤苏、香苏等，茎呈方形，叶对称生长，是一年生紫苏属唇形科的植物，可药食两用［1-3］。紫苏在我国的南北各省区广泛栽培，尤其是贵州、四川、广东3省栽培较多，资源分布较为广阔。据《贵州植物志·第八卷》记载，贵州产紫苏1 种、2 变种［4-6］。贵州地区具有丰富的野生资源及较长的紫苏栽培历史，其独特的喀斯特地貌也使紫苏产生了丰富的资源。紫苏叶中含精氨酸、紫苏醛、薄荷酮、肉豆蔻醚等化学成分［7］。其中紫苏叶中酸类和酚类成分是高效的抗氧化物质，主要酸类物质的活性成分是迷迭香酸，它具有较强的还原力，可以清除一定的自由基［8-11］，阻断亚销酸盐类物质的作用，防止脂质过氧化，对于人类保健、抗衰老有很大的意义。
目前，从植物中提取分离迷迭香酸的方法有微波辅助提取法、溶剂提取法和热水浸提法，张鑫等［11］分别通过热水浸提法和溶剂提取法从紫苏叶中提取迷迭香酸，结果表明溶剂提取法迷迭香酸提取得率较高，为2.732 mg/g，而热水浸提法提取得率为2.105 mg/g。徐春明等［12］使用微波对紫苏叶中迷迭香酸进行提取，结果表明，在处理时间4.5 min、微波功率560 W、料液比1∶33时，所得迷迭香酸产率为2.55 g/mg。但是这些方法存在提取效率低且资源浪费严重的问题。酶法辅助提取是一种提取得率高和反应时间短的高效提取方法，以添加特定的酶提高实验的提取效率［13-15］。纤维素酶是高效的生物催化剂，可以加速植物组织结构的崩解，有利于迷迭香酸从细胞内溶出，从而提高了迷迭香酸的得率。本研究以酶法辅助提取紫苏叶中的迷迭香酸，并利用响应面统计法优化迷迭香酸提取工艺，得到最优工艺条件参数，再通过对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧阴离子自由基清除这两个指标进行分析［16-17］，研究其抗氧化活性，为紫苏叶中迷迭香酸化合物的研究及开发利用提供参考。
1.1 材料与试剂
紫苏叶样品，成熟期叶片，‘奇苏三号’品种，采摘于贵州省油菜研究所紫苏种植基地。
迷迭香酸标品（纯度为98%） 天津士兰科技有限公司；纤维素酶（酶活力不小于15 000 U/g） 贵州赛兰博科技有限公司；乙腈、磷酸、无水乙醇、邻苯三酚等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
BPCL-2-JZ-TG微弱发光仪（高压900 V） 北京建新力拓科技有限公司；HB 3120U超声波清洗仪 江苏汉邦科技有限公司；1260 Infinity高效液相色谱仪 美国Agilent Technologies公司；TGL20M冷冻离心机 长沙迈佳仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 迷迭香酸含量测定
1.3.1.1 迷迭香酸高效液相色谱的测定条件
从紫苏中分离迷迭香酸，Model20l高效液相色谱仪，色谱柱：Welch C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：含1%磷酸的蒸馏水-乙腈（60∶40，V/V）；检测波长：320 nm；进样量：20 μL；体积流量：0.5 mL/min。
1.3.1.2 迷迭香酸标准曲线的绘制
精确称取迷迭香酸标准品，并用蒸馏水溶解稀释质量浓度为20、40、60、80、100 mg/L，由高效液相色谱测出迷迭香酸峰面积，并以质量浓度为横坐标，迷迭香酸峰面积为纵坐标绘制标准曲线［18］。
1.3.2 工艺流程及操作要点
工艺流程：紫苏干粉→酶解→提取→抽滤→热回流→抽滤→残渣提取→合并提取液。
将新鲜紫苏叶洗净烘干粉碎，过60 目筛，称取1.00 g粉末样品，置于具塞锥形瓶内，加入一定量的纤维素酶。加入50%的乙醇溶液30 mL。调节pH值，在水浴锅中酶解，再经20 min热回流提取后过滤，残渣以同样的方法再提取1 次，合并2 次提取液，用蒸馏水定容至100 mL［19］。用高效液相色谱法测得迷迭香酸质量浓度，计算得率。每个处理重复3 次。
1.3.3 纤维素酶法提取的迷迭香酸的单因素试验
1.3.3.1 纤维素酶添加量的影响
固定酶解pH 3、酶解温度40 ℃、酶解时间10 min的条件下，考察酶添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%时提取物中迷迭香酸含量。试验均重复3 次。其中，酶添加量计算见式（1）：
1.3.3.2 酶解温度的影响
固定酶解pH 3、酶添加量1.5%、酶解时间10 min的条件下，考察酶解温度分别为30、40、50、60、70 ℃时提取物中迷迭香酸含量。试验均重复3 次。
1.3.3.3 酶解pH值的影响
固定酶解温度 40 ℃、酶添加量1.5%、酶解时间10 min的条件下，考察酶解pH值分别为2、3、4、5、6时提取物中迷迭香酸含量。试验均重复3 次。
1.3.3.4 酶解时间的影响
固定酶解温度40 ℃、酶添加量1.5%、酶解pH 3的条件下，考察酶解时间分别为5、10、15、20、25 min时提取物中迷迭香酸含量。试验均重复3 次。
1.3.4 迷迭香酸提取工艺的响应面试验设计
以单因素试验结果为依据，利用Box-Behnken试验设计，选取酶添加量、酶解温度、酶解pH值、酶解时间作自变量，以迷迭香酸提取得率为为响应值，进行四因素三水平的响应面试验。优化提取工艺，具体试验因素水平设计见表1。
表1 酶法提取迷迭香酸响应面优化试验因素与水平
Table1 Factors and l evels used in resp on ses urface analysis for op timiz in g the enzym aticextracti on of rosema ry acid
1.3.5 抗氧化活性的测定
1.3.5.1 DPPH自由基清除率的测定
用无水乙醇配制1 mol/L的DPPH溶液，在2～6 ℃条件避光保存［20］。分别配制5 组不同质量浓度的迷迭香酸提取液、VC和VE溶液。取1.0 mL 测试样品溶液及1.0 mL DPPH乙醇溶液混匀到同一试管中，37 ℃条件下暗处静置30 min后，测定517 nm波长处测定其吸光度A1，同时测定1.0 mL测试样品溶液与1.0 mL无水乙醇混合后的吸光度A2，以及1.0 mL DPPH溶液与1.0 mL溶剂（无水乙醇）混合后的吸光度A3。实验重复3 次，取平均值。DPPH自由基清除率按公式（2）进行计算：
1.3.5.2 超氧阴离子自由基清除活性的测定
依照文献［21］邻苯三酚-鲁米诺化学发光体系的方法。出现峰值为E，用双蒸水作空白对照，测定其峰值F，实验重复3 次，按式（3）计算样品液对超氧阴离子自由基的清除率。
1.4 数据处理
用Design Expert 8.0软件对数据进行分析，得出最佳酶解条件。
2.1 迷迭香酸标准曲线的建立
以迷迭香酸质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得曲线方程为：Y=3 799.3X+18 287（式中：X为迷迭香酸质量浓度；Y为峰面积），R2=0.999 7。采用高效液相色谱法，根据所测得峰面积由公式算出迷迭香酸质量浓度，得出迷迭香酸含量，进而算出得率。
2.2 酶法辅助提取得率单因素试验结果
图1 酶添加量 （A ）、酶解温度 （B ）、酶解 p H 值 （C ）、酶解时间 （D ）对迷迭香酸得率的影响
Fig.1 Effects of enzyme dosage （A）， hydrolysis temperature （B）， pH （C），and hydrolysis time （D） on the extraction yield of rosmarinic acid
如图1A 所示，在酶解时间10 min、pH 3、温度40 ℃条件下，随着酶添加量的加大，迷迭香酸的得率逐渐提高；当加酶量大于2%时，随着酶添加量增加，迷迭香酸得率趋于平缓，说明在酶添加量大于2.0%后，底物已经被完全水解，过多的酶对迷迭香酸起包埋作用，使得提取量降低。因此，纤维素酶添加量最佳为2.0%。
如图1B所示，在pH 3、酶添加量1.5%、酶解时间10 min条件下，当酶解温度低于 50 ℃时，迷迭香酸得率随着温度的上升而显著增加；当温度高于50 ℃时，迷迭香酸的得率随温度升高而逐渐降低。这是由于纤维素酶的最适温度是45～55 ℃之间，温度过低会抑制酶的催化活力，过高的温度会导致酶失活。因此最佳酶解温度为50 ℃。
如图1C所示，在酶添加量1.5%、温度40 ℃、酶解时间10 min条件下，pH值从2.0上升至3.0时，迷迭香酸得率随着pH值上升而逐渐增加，但当酶解pH高于3.0之后，迷迭香酸得率明显下降。这是因为纤维素酶的最适pH值是4.5～6.5之间，迷迭香酸的最适pH值是2～2.5之间。因此，适宜的酶解pH值为3。
如图1D所示，在温度40 ℃、酶添加量1.5%、酶解pH 3条件下，迷迭香酸提取得率随着酶解时间的延长不断提高，但当提取时间大于15 min 后，迷迭香酸提取得率随着酶解时间推移而下降。说明纤维素酶需要一定时间才能破坏细胞壁，使迷迭香酸充分溶出。但酶解时间过长，酶的催化活性降低并且纤维素分解产物与迷迭香酸之间发生酯化反应，使得迷迭香酸得率下降，因此迷迭香酸最佳酶解时间为15 min。
2.3 响应面优化试验结果
2.3.1 回归方程的建立与方差分析
表2 响应面试验设计及结果
Table2 Resp on se surface design with experimental and p redicted re sults of rosma r in ic acid extra cti on
利用Design-Expert 8.0软件对表2的数据进行分析，得到响应值与被检变量之间的逻辑关系，由Box-Behnken试验设计，得到了迷迭香酸提取得率（Y）对纤维素酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解pH值（C）和酶解时间（D）的二次多项式回归方程：Y=0.60+0.003 92A+ 0.03B+0.015C-0.023D-0.022AB-0.003 25AC-0.005 5AD-0.009 2+BC-0.015BD+0.002 25CD-0.021A2-0.025B2-0.049C2-0.046D2。
为检验方程有效性，利用分析软件对其进一步进行分析纤维素酶法提取迷迭香酸得率，多元回归模型的方差分析及显著性结果见表3。
表3 迷迭 香酸含量回归方程各项方差分析
Table3 Analysis of variance for theregressi on m odel describ in g rosma r in ic acid extra cti on
注：*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.01）。
表4 回归模型 可信度 分析
Table 4 Reliability analysis of the regressi on m odel
根据回归模型方差分析的结果（表3）和（表4）可以看出，P＜0.05（显著），差拟项检验的P=0.063 1（不显著），模型的相关系数R2=98.53%，调整决定系数R
=95.48%，表明模型在研究的整个回归区域内模型拟合较好且自变量与响应值线性关系显著［22-24］。因此，可用此模型来确定紫苏叶中迷迭香酸的最佳提取工艺。
由回归模型系数显著性检验结果可得知：酶添加量、酶解pH值、酶解温度一次项，酶解时间、酶添加量、酶解pH值、酶解温度的二次项的P值均小于0.01，说明对紫苏叶中提取迷迭香酸得率的影响极显著，而酶解时间和酶添加量交互项P值小于0.05，说明对提取迷迭香酸得率的影响显著。对提取迷迭香酸得率的影响的主次因素依次为酶添加量＞酶解温度＞酶解pH值＞酶解时间。
2.3.2 响应面分析与优化
利用Design-Expert 8.0软件进行二次多元拟合得出响应面图及对应的等高线图，在固定其他因素水平值的情况下观察各因素间的交互作用对迷迭香酸提取得率（Y）的影响，所得响应面如图2所示。
图2 各因素交互作用对迷迭香酸得率影响的响应面图
Fig.2 Response surface plots showing the interactive effects of factors on the extraction yield of rosmarinic acid
从表3的P值和图2a可知，酶解时间和纤维素酶添加量交互作用为显著水平（P＜0.05），具体表现为等高线图呈椭圆形，这是由于紫苏叶的细胞壁需要纤维素酶反应一段时间后才能充分破碎；由图2b可知，酶解pH值不变，提取得率随着酶解温度的升高先增加后减小；而酶解温度不变时，迷迭香酸提取得率随pH值升高而增加。由图2c可知，固定酶解温度和酶解时间，迷迭香酸提取得率随酶添加量增加而增大；pH 2～3之间，固定酶解温度，迷迭香酸提取得率随pH值增加而增大，酶解pH值大于3之后，提取得率随pH值增加呈减小的趋势，但不明显。这是因为纤维素酶的最适pH值是4.5～6.5之间［25］，随着pH值的一直升高，导致酶活性减弱，迷迭香酸得率下降。由图2d酶解温度在50 ℃之前，提取得率随着温度升高而增大，酶解温度在50 ℃之后，提取得率随温度升高呈略微减小的趋势。
2.3.3 验证实验结果
通过试验模型分析，得出迷迭香酸最佳提取工艺为酶解时间12 min、酶添加量3%、酶解pH 4、酶解温度45 ℃。取1 g紫苏叶粉末，按照上述最优条件，重复3 次实验，迷迭香酸平均得率为0.617%，与理论值0.621%偏差不大，且变异系数为1.88%，证明了响应面设计的结果可靠合理。
2.4 迷迭香酸抗氧化分析
2.4.1 对DPPH自由基清除能力
图3 迷迭香酸 、V C、V E对 DP PH 自由基的清除作用
Fig.3 Scavenging activities of rosemary acid， VC， and VE on DPPH radical
由图3可知，清除DPPH自由基能力可阻断脂质过氧化的反应［26-27］，当质量浓度达到150 μg/mL时，VC、迷迭香酸、VE 3 种物质对DPPH自由基清除率均达到最高值，分别为93.12%、69.28%、57.79%；之后随着质量浓度的增大，3 种物质对DPPH自由基清除率开始逐渐下降。但是在同等条件下，清除DPPH自由基能力：VC＞迷迭香酸＞VE。
2.4.2 对超氧阴离子自由基清除能力
图4 迷迭香酸、VC、VE对超氧阴离子自由基的清除作用
Fig.4 Scavenging activities of rosemary acid， VC， and VE on superoxide anion radical
由图4可知，迷迭香酸具有一定清除超氧阴离子自由基的能力，在实验质量浓度范围内，VC、迷迭香酸、VE 3 种物质对超氧阴离子自由基的清除能力随质量浓度的上升而增大。但溶液质量浓度在1.5 g/L以后时，3 种物质对超氧阴离子自由基的清除能力趋势平缓，当质量浓度达到2.0 g/L时，迷迭香酸对超氧阴离子自由基清除率为61.37%，而VC的清除率为79.38%，VE的清除率为51.52%。
采用纤维素酶法辅助提取紫苏叶中迷迭香酸有选择性高、提取时间短、操作简便的优点，通过酶除去紫苏叶的细胞壁，使得迷迭香酸大量溶出，显著提高了迷迭香酸得率。利用响应面法优化酶法提取迷迭香酸最佳工艺条件，考察了影响迷迭香酸提取得率的因素的主次顺序为酶添加量＞酶解温度＞酶解pH值＞酶解时间。迷迭香酸最佳提取工艺：酶添加量3%、酶解温度45 ℃、酶解时间12 min、pH 4，在此最佳条件下，迷迭香酸提取得率为6.17%。且在此条件下的迷迭香酸提取液具有一定的抗氧化作用，对DPPH自由基、超氧阴离子自由基有较好的清除效果。
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贵州山区畜产品系列休闲方便肉食品产业化技术成熟化与示范应用项目（700952142111）
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614007
中图分类号：TS202.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）14-0037-06
收稿日期：2015-10-17
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31360373）；浙江大学馥莉食品研究院资金资助项目（KY201405）；
作者简介：黄丹丹（1990—），女，硕士研究生，主要从事畜产品加工及贮藏工程研究。E-mail：15285637566@163.com
*通信作者：朱秋劲（1969—），男，教授，博士，主要从事食品营养与安全和畜产品加工研究。E-mail：ls.qjzhu@gzu.edu.cn
Optimization of Enzymatic Extraction of Rosemary Acid by Response Surface Methodology and Its Antioxidant Activity
HUANG Dandan1， SHEN Qi2， ZHU Qiujin1，3，4，*， CHENG Mei1， LUO Zisheng5， MAO Linchun5
（1.School of Liquor and Food Engineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China； 2.Guizhou Rapeseed Institute，Guiyang 550008， China； 3.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province，Guiyang 550025， China； 4.National Beef Processing Technology Research and Detection Sub-centre， Huishui 550600， China；5.Fuli Insititute of Food Science， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）
Abstract: The enzyme-assisted extraction of rosemary acid from Perilla frutescens was optimized applying one-factorat-a-time method （OFAT） and response surface methodology （RSM） and the antioxidant activity of the rosemary acid was investigated.Preliminary investigations were conducted into the effect of enzyme dosage， hydrolysis temperature， time and pH on the extraction yield of rosemary acid.Furthermore， the optimization of process parameters for extracting rosemary acid by cellulase hydrolysis of Perilla frutescens was done by RSM using Box Behnken design.Meanwhile， the antioxidant activity was assessed by superoxide anion and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） free radical scavenging assays.The optimal conditions for rosemary acid extraction were determined as follows: enzyme dosage， 3%； hydrolysis temperature，45 ℃； time， 12 min； and pH， 4.The maximum extraction yield of rosemary acid of 0.617% was obtained in experiments conducted under these optimal conditions， being not significantly different from the predicted value （0.621%）.The rosemary acid showed strong scavenging capacity on superoxide anion and DPPH radicals， thereby having potent antioxidant activity.Key words: Perilla frutescens； rosemary acid； response surface methodology； enzymatic extraction； antioxidant activity