图1 黄曲霉毒素的高效液相色谱图
Fig.1 HPLC profiles of aflatoxin standard and paprika extracts
周 丽，杨清山*，连运河，王 磊，张晓芳
（1.河北省天然色素工程技术研究中心，河北 邯郸 057250；2.晨光生物科技集团股份有限公司，河北 邯郸 057250）
摘 要：利用免疫亲和层析净化高效液相色谱法对印度辣椒和新疆辣椒及其辣椒提取物中的黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）进行检测及迁移规律分析。结果表明，不同来源的辣椒和辣椒提取物中存在不同程度的黄曲霉毒素B1（0.93～51.53 μg/kg）污染，在辣椒生产过程中，黄曲霉毒素部分迁移到辣椒油树脂当中，辣椒红中几乎没有。这一结果说明生产过程中黄曲霉毒素污染主要来源于辣椒原料且易迁移到辣椒油树脂中。在生产中要控制产品中黄曲霉毒素的污染，首要的是做到控制好原料。
关键词：黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）；辣椒提取物；免疫亲和层析净化高效液相色谱法；测定；迁移规律
引文格式：
周丽， 杨清山， 连运河， 等.辣椒及辣椒提取物中黄曲霉毒素含量的测定及迁移规律分析［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 165-168.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614029. http://www.spkx.net.cn
ZHOU Li， YANG Qingshan， LIAN Yunhe， et al.Contamination and migration of aflatoxin in paprika and paprika extracts［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 165-168.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614029. http://www.spkx.net.cn
黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一组结构类似的代谢产物，主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2六种。黄曲霉毒素具有致畸、致癌、致诱变作用，而黄曲霉毒素Bl的毒性和致癌性最强，被称为第一大类致癌物，其毒性是砒霜的68 倍［1］，能诱发人和动物的肝癌。近年来黄曲霉毒素Bl污染事件的发生，已引起世界各国及消费者对食品安全的关注［2-3］。目前对黄曲霉毒素的研究主要集中在分析方法，如高效液相色谱［4-6］、高效液相色谱-串联质谱［7-8］、酶联免疫吸附测定［9］、分子［10］检测方法，以及其危害［11-14］、预防［15-16］及控制［17-18］等方面，对其在辣椒提取物中的研究鲜见报道。
辣椒提取物是以辣椒（Capsicum annuum L.）［19］为原料，经粉碎、提取、分离等工序制备而成的辣椒红、辣椒油树脂等产品。辣椒红主要作为着色剂添加到食品当中，而辣椒油树脂作为增味剂添加到食品中［20］。经过多年发展，我国已成为世界上最大的辣椒提取物产销国，每年有8%～10%以上的辣椒用于制备辣椒提取物，辣椒红年产量3 500 t，占国际市场份额的70%以上。因此，辣椒及辣椒提取物的食品安全问题关系到消费者健康和企业发展［21-23］。
辣椒在采摘、晾晒、贮藏、运输、加工等过程中，由于环境条件及水分控制等问题，极易引起霉变及霉菌毒素污染［24-25］，因而辣椒提取物中极有可能由于加工过程中的毒素迁移而污染。开展辣椒提取加工过程中黄曲霉毒素的监测与控制研究，阐明黄曲霉毒素在辣椒提取加工过程中的含量变化、迁移规律，可以为开发黄曲霉毒素控制技术提供理论基础。
1.1 材料与试剂
辣椒，产地印度、新疆。辣椒红，色价E1%1 cm460 nm：50～300。辣椒经粉碎、提取、分离而得到的油状黏稠液体。辣椒油树脂，辣度：1%～30%。辣椒经粉碎、提取、分离而得到的油树脂。以上样品均由晨光生物科技集团股份有限公司提供。
标准品：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2（纯度＞99%） 美国Sigma公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）美国Fisher公司；磷酸氢二钾（分析纯） 天津市恒兴化学试剂制造有限公司；氯化钠、磷酸二氢钾（均为分析纯） 天津市津北精细化工有限公司；氯化钾（优级纯） 天津市光复精细化工研究所；碘（分析纯）天津大茂化学试剂有限公司；浓盐酸（分析纯） 莱阳经济技术开发区精细化工厂；实验室用水均为Milli-Q超纯水，每日更新。
1.2 仪器与设备
1260高效液相色谱仪（配荧光检测器） 美国Agilent公司；柱后衍生系统 美国Pickering Laboratories公司；AL104分析天平 瑞士Mettler公司；拍打式无菌均质器（8 次/s） 法国Interscience公司；免疫亲和柱（黄曲霉毒素B1） 北京华安麦科生物技术有限公司；玻璃纤维滤纸（直径110 mm，孔径1.5 μm） 英国GE Healthcare公司；Master-S UVF超纯水机 上海和泰仪器有限公司；0.22 μm针式过滤膜 上海安谱科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 色谱分离条件
ODS C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；进样量20 μL；柱温40 ℃；流动相：乙腈-甲醇-水（22∶22∶56，V/V）溶液；流速0.8 mL/min；检测波长：激发波长360 nm，发射波长440 nm；增益值：PMT14。
1.3.2 柱后衍生化条件
衍生溶液：体积分数10%甲醇溶液（含0.05%碘）；泵洗液：体积分数20%甲醇溶液；衍生溶液流速0.3 mL/min；衍生反应温度95 ℃。
1.3.3 使用溶液及标准溶液制备
磷酸缓冲盐（phosphate buffer saline，PBS）：称取7.9 g氯化钠、1.8 g磷酸氢二钾、0.24 g磷酸二氢钾、0.2 g氯化钾、900 mL水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用水稀释至1 000 mL，保存于4 ℃备用。
10%甲醇-PBS：取10 mL甲醇溶液，加入PBS并定容至100 mL。
黄曲霉毒素标准储备溶液：用甲醇溶液分别配制成80 μg/kg的黄曲霉毒素B1、G1和20 μg/kg的黄曲霉毒素B2、G2标准混合储备液，保存于4 ℃备用。
黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准储备液，用甲醇溶液稀释成混合标准工作液。
柱后衍生溶液（10%甲醇、0.05%碘溶液）：称取0.5 g碘，溶解于100 mL甲醇溶液后，加纯水定容至1 000 mL，以0.45 μm的尼龙滤膜过滤，充入氮气避光保存。
1.3.4 样品制备
1.3.4.1 提取
称取15 g样品至均质袋中，加入60 mL体积分数70%甲醇溶液，并加入2 g氯化钠；用拍打式无菌均质器均质3 min；用普通滤纸进行过滤，收集滤液至250 mL三角瓶中；移取5 mL滤液至50 mL容量瓶中，用PBS定容；将稀释液用玻璃纤维滤纸过滤至三角瓶中。
1.3.4.2 净化
取1.3.4.1节稀释液10 mL，加入免疫亲和柱（流速1 mL/min）；液体彻底排净后，加入5 mL体积分数10%甲醇-PBS（或纯水）洗涤2 次（流速3 mL/min）；弃去洗脱液，加入1 mL甲醇，孵育2 min（流速1 mL/min）；收集洗脱液，摇匀。
1.3.5 样品测定
将1.3.4.2节洗脱液过0.45 μm滤膜，进行高效液相色谱分析。每次进样20 μL，重复2 次，记录色谱峰面积，利用标准曲线计算出样品中的黄曲霉毒素含量。
2.1 辣椒及辣椒提取物中黄曲霉毒素含量的测定
利用免疫亲和层析净化高效液相色谱法对不同来源的辣椒和辣椒提取物中黄曲霉毒素含量（B1、B2、G1、G2）进行分析，高效液相色谱图见图1，结果见表1～3。
图1 黄曲霉毒素的高效液相色谱图
Fig.1 HPLC profiles of aflatoxin standard and paprika extracts
表1 不同 来源 辣椒 样品 中黄 曲霉 毒素 B1、B2、G1、G2含量
Table 1 Detecti on results of aflatox in B 1，B 2，G 1， and G2 in pa pr ika sam ples fro m differe nt re gi on s
注：＜1.未检出，表2、3同。
不同来源的辣椒中普遍含有不同含量的黄曲霉毒素B1（0.93～48.07 μg/kg），印度辣椒中黄曲霉毒素B1较高，新疆辣椒中黄曲霉毒素B1较低，部分印度辣椒中检出黄曲霉毒素B2，未检出黄曲霉毒素G1、G2。不同来源的辣椒生产的辣椒红产品未检出黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。不同来源的辣椒生产的辣椒油树脂产品中含有不同含量的黄曲霉毒素B1（1.49～51.53 μg/kg），部分印度辣椒和新疆辣椒中检出黄曲霉毒素B2，未检出黄曲霉毒素G1、G2。
表2 不同来源辣椒红中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量
Table 2 Detecti on results of aflatox in B 1，B 2，G 1 and G2 in pa pr ika oleores in fr om differ entpap rika sou rc es
表3 不同 来源 辣椒 油树 脂中 黄曲 霉毒 素B 1、B2、G1、G2含量
Table3 Detecti on results of aflatox in B1，B 2，G 1 and G 2 in capsicum oleores in from different paprika sources
2.2 辣椒及辣椒提取物中黄曲霉毒素的迁移规律
利用免疫亲和层析净化高效液相色谱法对不同来源的辣椒粒和辣椒提取物中黄曲霉毒素含量B1进行分析，结果见表4、5。
表4 不同来源辣椒生产红辣素过程中黄曲霉毒素B1迁移 率
Table4 Migrati on of aflatox in B1from di fferent paprika sourcesto paprikaextractsdur in g produ cti on
分别选取印度和新疆辣椒粒，经溶剂提取、提取液浓缩后得到红辣素，提取后的渣子即为辣椒渣，按照1.3节检测黄曲霉毒素含量，研究黄曲霉毒素B1从原料至红辣素及辣椒渣的迁移规律。结果表明，从辣椒原料生产至红辣素和辣椒渣的过程中，黄曲霉毒素B1主要迁移至辣椒渣中。
将上述得到的印度和新疆红辣素，经分离、浓缩后分别得到辣椒红和辣椒油树脂，按照1.3节检测黄曲霉毒素含量，研究黄曲霉毒素B1从红辣素至辣椒油树脂及辣椒红的迁移规律。结果表明，对于新疆原料，从红辣素生产至辣椒油树脂和辣椒红的过程中，黄曲霉毒素B1主要迁移至辣椒油树脂中，辣椒红中未迁移。对于印度原料，从红辣素生产至辣椒油树脂和辣椒红的过程中，黄曲霉毒素B1迁移至辣椒油树脂及辣椒红中。经分析，黄曲霉毒素和辣椒油树脂均易溶于醇类溶剂，在分离过程中黄曲霉毒素应该迁移至辣椒油树脂中，而印度原料可能由于分离不彻底，造成辣椒红中出现黄曲霉毒素。
表5 不同来源红辣素生产辣椒红、辣椒油树脂过程中黄曲 霉毒 素B 1迁移 率
Table5 Migrati on of aflatox in B1fr om di ffer en tp ap rika e xtractsto pa pr ika oleores in and capsicu m oleo res in dur in g produ cti on
辣椒在贮存、运输、加工过程中，可能会受到黄曲霉毒素的污染，而被污染的辣椒在加工过程中黄曲霉毒素会由辣椒迁移到辣椒油树脂中，造成产品被黄曲霉毒素污染，进而会对人类健康造成威胁。因此，为防止辣椒提取物中黄曲霉毒素的污染，应加强对辣椒原料的控制。
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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614029
中图分类号：TS202.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）14-0165-04
收稿日期：2015-10-25
基金项目：国家国际科技合作专项（2014DFA31220）
作者简介：周丽（1980—），女，工程师，硕士，研究方向为天然产物化学。E-mail：zhouli_2004@126.com
*通信作者：杨清山（1985—），男，工程师，学士，研究方向为天然产物化学。E-mail：yqs5363631@163.com
Contamination and Migration of Aflatoxin in Paprika and Paprika Extracts
ZHOU Li， YANG Qingshan*， LIAN Yunhe， WANG Lei， ZHANG Xiaofang
（1.Hebei Engineering Technology Research Center of Natural Pigments， Handan 057250， China；2.Chenguang Biotech Group Co.Ltd.， Handan 057250， China）
Abstract: Aflatoxins （B1， B2， G1， G2） in paprika and paprika extracts were quantified by high-performance liquid chromatography （HPLC） after cleanup by immunoaffinity chromatography.Paprika samples were collected from India and Xinjiang， China.Paprika extracts were prepared in our laboratory.The results showed that aflatoxin was detected in both paprika and paprika extract samples in the range of 0.93 to 51.53 µg/kg and that during preparation of paprika extracts，aflatoxin migrated from paprika to capsicum oleoresin， but not to paprika oleoresin.These results indicated that the aflatoxin in paprika extracts came from contaminated paprika.To control aflatoxin contamination of paprika extracts， the starting raw material must be free from contamination by aflatoxin.
Key words: aflatoxin （B1， B2， G1， G2）； paprika extract； high-performance liquid chromatography after cleanup by immunoaffinity chromatography； determination； migration