表1 各组分的出峰顺序及保留时间
Table 1 Peak sequence and r etenti on times of cholesterol and p hytosterols
陈月晓1，何 涛2，唐凌轩1，徐佳佳1，白沙沙1，崔亚娟1，*，何 梅1，李 东1，黄 华2，路 勇2
（1.北京市营养源研究所，北京 100069；2.北京市食品安全监控和风险评估中心，北京 100041）
摘 要：建立气相色谱法同时测定食品中植物甾醇和胆固醇含量的分析方法，测定植物甾醇含量较高的常见植物油和同时含有胆固醇及植物甾醇的样品。采用5α-胆甾烷为内标参照物，样品经皂化后提取，浓缩后正庚烷定容上机进样分析。胆固醇和植物甾醇在0.001～2.5 mg/mL质量浓度范围内线性良好，线性相关系数R2均大于0.99。方法的检出限为0.3 mg/100 g，定量限为1.0 mg/100 g，该方法相较于液相色谱法能有效将胆固醇和植物甾醇进行分离，具有步骤简单、重复性好、准确度和灵敏度高等特点。
关键词：气相色谱法；胆固醇；植物甾醇
引文格式：
陈月晓， 何涛， 唐凌轩， 等.气相色谱法同时测定食品中的胆固醇和植物甾醇［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 180-183.
CHEN Yuexiao， HE Tao， TANG Lingxuan， et al.Simultaneous determination of cholesterol and phytosterol in foods by gas chromatography［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 180-183.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614032. http://www.spkx.net.cn
植物甾醇是存在于植物中的一大类化学物质的总称，其化学结构是与胆固醇相似的一类甾体化合物，几乎存在于所有的植物性食物中，最常见的包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇，其次是这些植物甾醇的饱和形式，即谷甾烷醇和豆甾烷醇等［1-2］。植物甾醇与胆固醇结构类似，而生理学作用却相差甚远［3-5］。大量流行病学资料和实验室研究证明，人体血清胆固醇增高，易增加心血管疾病的患病几率。而摄入较多的植物甾醇与人群许多慢性病的发生率较低有关，如降低高胆固醇血症、冠状动脉硬化性心脏病、癌症等疾病的危险性［6-9］。人体内不能合成植物甾醇，也不能由胆甾醇转化而成，只能由食物中摄取［10-12］。植物甾醇广泛存在于植物中，在种子、植物油、蔬菜、水果等含量较多。自然界中最常见、含量最多的是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、豆甾烷醇等［13-16］。
目前对胆固醇和植物甾醇的测定方法有分光光度计法、酶法、液相色谱法［17］、薄层色谱法［18-19］、气相色谱法［20-22］、气相色谱-质谱法［23-27］等。如比色法样品前处理需要提取样品中的脂肪，且容易受到其他甾醇和甘油三酯的干扰，造成结果的显著偏大。操作繁杂、误差大、重复性差，仅适用于动物性食品。酶法技术含量较高，特异性强，仅适用于动物性食品。液相色谱法采用波长205～210 nm检测，如此低的检测波长使得待测组分不能与实际样品中的基体完全分离，而干扰其准确定量。气相色谱法的选择性较高，分离效果好。气相色谱-质谱法操作复杂，耗费更大。
本实验定量采用内标法，是一种间接、相对的校准方法，通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算，因而在一定程度上能校正和消除操作条件对分析结果产生的影响，提高分析结果的准确度。色谱条件对结果影响不大，准确度、精度较高，可克服进样量的误差对测量结果的影响，比较适用于多成分的测定方法。
因此有必要建立简便、灵敏度和准确度较好的固醇类分析方法，有效分离并测定植物甾醇和胆固醇的含量，对估计居民摄入量有重要意义，也为科学指导居民膳食提供依据。
1.1 材料与试剂
植物油、牛奶饼干 市售。
5α-胆甾烷 美国AcrosOrganics公司；胆固醇（纯度＞99%）、豆甾醇（纯度＞95%）、β谷甾醇（纯度＞95%）、豆甾烷醇（纯度＞95%） 美国Sigma-Aldrich公司；菜油甾醇（纯度＞95%） 美国ChromaDex公司；菜籽甾醇 日本Tama Biochemical公司；氢氧化钾、体积分数95%乙醇溶液、无水乙醚、无水硫酸钠（均为分析纯） 北京化工厂；正庚烷（色谱纯）美国Fisher公司。
1.2 仪器与设备
GC2010plus气相色谱仪（配氢火焰离子化检测器）日本岛津公司；万分之一天平 德国Sartorius公司；磁力搅拌电热套 天津市泰斯特仪器有限公司；旋转蒸发仪、分液漏斗振荡器 东京理化公司。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
DB-5毛细管色谱柱（25 m×0.32 mm，0.17 μm）；氢火焰离子化检测器；升温程序：柱温210 ℃，以12 ℃/min升至300 ℃，保持12.5 min；进样口温度270 ℃；检测器温度280 ℃；氢气流速40 mL/min；空气流速400 mL/min；进样量1 µL；分流比30∶1。
1.3.2 样品制备
称取适量样品于皂化瓶中，依次加入2.0 mg/mL内标物（5α-胆甾烷）、40 mL体积分数95%乙醇溶液、8 mL质量分数50% KOH溶液，将皂化瓶置于磁力搅拌电热套中，连接冷凝装置，回流冷凝（60±10）min，轻摇试样保证完全皂化。回流冷凝结束后，关闭热源，冷凝管上端加入60 mL体积分数95%乙醇溶液。保持磁力搅拌，15 min后，将皂化瓶从冷凝管移下，冷却至室温。皂化液中加入100 mL乙醚溶液，将溶液转移至500 mL干净的分液漏斗中。加入110 mL 1 mol/L KOH溶液轻轻振摇，待分层清洗后，弃水层。加入40 mL 0.5 mol/L KOH溶液到分液漏斗，轻轻振摇10 s，弃去水层。用40 mL水清洗乙醚层溶液，待分层后弃去水相。反复水洗至少3 次。完成水洗后，将乙醚层从分液漏斗上通过有玻璃棉和20 g无水硫酸钠的玻璃漏斗转移到锥形烧瓶中，并于旋转蒸发仪（55±3） ℃条件下，旋转蒸发至无水。正庚烷5 mL定容，取适量于进样瓶中，上机分析。
1.3.3 内标溶液配制
精确称取5α-胆甾烷100 mg于50 mL容量瓶，正庚烷溶解定容，得到2.0 mg/mL的内标溶液。
1.4 数据处理
采用气相色谱法对待测组分进行测定，根据保留时间定性，峰面积定量。以5α-胆甾烷为内标参比计算胆固醇和植物甾醇的含量。
2.1 混合标准溶液及样品的色谱分离情况
使用单个标准溶液，注入气相色谱仪，核准、确定各组分的保留时间后，将配制好的混合标准溶液注入气相色谱仪，获得出峰顺序及保留时间，如表1所示。依据已建立的色谱条件将混合标准注入气相色谱仪，如图1A所示。代表样品的气相色谱分离情况如图1B、C所示。从标准溶液及样品的测定情况可见，胆固醇和植物甾醇各组分在此实验条件下能实现良好分离。
表1 各组分的出峰顺序及保留时间
Table 1 Peak sequence and r etenti on times of cholesterol and p hytosterols
图1 混合标准溶液 （ A）、植物油样品（ B）、牛奶饼干样品（ C）气相色谱图
Fig.1 Gas chromatograms of mixed standards of cholesterol and phytosterols （A）， vegetable oil （B） and milk biscuits （C）
2.2 前处理方法的优化
分别采用不同体积分数的氢氧化钾-乙醇溶液进行皂化，并对皂化温度和时间进行比较和优化，最终确定在40 mL体积分数95%乙醇溶液和8 mL质量分数50% KOH溶液进行皂化，持续（60±10） min条件下能将样品完全皂化。对标准品的衍生前后进行了上机对比，在仪器上的分离效果并无差异，因此确定为提取后直接上机测定。
2.3 混标溶液配制及标准曲线的建立
表2 混标溶液工作 液各组分的质量浓 度
Table 2 Thec on centrati on of eachc omp on ent in mixed st and ard wo rk in g soluti on
分别称取适量菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、胆固醇、5α-胆甾烷、豆甾烷醇混合标准，配制为储备液。用正庚烷分别稀释为不同质量浓度梯度的工作液，如表2所示，注入气相色谱仪。结果显示线性良好，如表3所示。
表3 混标溶液工作液各组分的线性回归方程及相关系数
Table 3 L in earr egressi on equati on and correlati on c oefficient of each comp on ent in mixed stan da rd wo rk in g soluti on
注：线性回归方程中X为组分的峰面积，Y为相应的组分质量浓度。
2.4 加标回收实验结果
选取花生油样品进行加标回收率实验，根据各成分的含量进行3 个不同质量浓度（本底值的0.5、1、2 倍）的加标回收实验，如表4所示。
表4 花生油样品的加标回收率结果 （n =6 ）
T abl e4 R esults of r ecov ery in s pike d pean ut oil （n =6）
由表4可知，胆固醇和植物甾醇各组分的加标回收率均在90%～110%之间，说明该方法的准确度达到要求。
2.5 方法的检出限和定量限
本方法通过逐步稀释标准溶液，根据信号与噪音的比值，确定标准溶液的检出限，依据本方法最小定容体积为3 mL的情况下，最大称样量为5 g，计算得出方法的检出限为0.3 mg/100 g，定量限为1.0 mg/100 g。
2.6 样品的测定
如表5所示，本方法对于同时含有胆固醇及植物甾醇的样品能够有效进行分离并定量。在常见的植物油中一般不含有胆固醇或其含量很低；植物甾醇总含量最高的油脂种类是玉米油，高达1 339.54 mg/100 g，其次是树莓籽油、米糠油、菜籽油；从植物甾醇种类分布方面来看通常是β-谷甾醇含量最高，其次是菜油甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇等。
表5 不同类别食用植物油中胆固醇和植物甾醇的含量
Table 5 C on tents of cholesterol and phytosterols in edible vegetable oils
注：—.未检出。
本实验优化了样品前处理条件，利用气相色谱仪，采用DB-5毛细管色谱柱对胆固醇和植物甾醇进行分离，内标法定量。研究结果显示在同时含有植物甾醇和胆固醇的样品中，应用此方法能够将其进行良好的分离及定量，且胆固醇和植物甾醇各组分的线性及回收率结果良好。数据结果表明在常见植物油中一般不含胆固醇或含量很低；植物甾醇总含量最高的是玉米油，其次是树莓籽油、米糠油、菜籽油；植物甾醇分布方面通常是β-谷甾醇含量最高，其次是菜油甾醇。
该方法相较于GB/T 22220—2008《食品中胆固醇的测定：高效液相色谱法》法测定胆固醇，能有效将样品中的胆固醇和植物甾醇进行分离，减少样品中植物甾醇成分对胆固醇测定的干扰。相较于气相色谱-质谱法节约成本，具有步骤简单、重复性好、准确度和灵敏度高等特点。
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中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）14-0180-04
收稿日期：2015-11-05
基金项目：首都居民膳食结构研究与数据平台搭建项目（Z141100002614013）；创新工程Ⅱ-3项目：食物中四类植物化学物检测技术的开发改进及植物化学物配方食品加工方法研究项目（PXM2014-178102-000011）
作者简介：陈月晓（1985—），女，助理研究员，硕士，研究方向为食物营养成分。E-mail：yuexiaochen@hotmail.com
*通信作者：崔亚娟（1979—），女，副研究员，博士研究生，研究方向为食物营养成分。E-mail：cuiyj66@163.com
Simultaneous Determination of Cholesterol and Phytosterol in Foods by Gas Chromatography
CHEN Yuexiao1， HE Tao2， TANG Lingxuan1， XU Jiajia1， BAI Shasha1， CUI Yajuan1，*， HE Mei1， LI Dong1， HUANG Hua2， LU Yong2
（1.Beijing Research Institute for Nutritional Resources， Beijing 100069， China；2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment， Beijing 100041， China）
Abstract: A method for the simultaneous determination of phytosterol and cholesterol in foods was established by gas chromatography （GC） in this research.Cholesterol， brassicasterol， campesterol， stigmasterol， β-sitosterol， and stigmasterol were quantifed using 5α-cholestane as the internal reference standard.Samples were saponifed before extraction and the extract was concentrated and diluted again with n-heptane before being injected into the chromatographic system.The results showed that cholesterol and phytosterols were separated well and displayed linear relationship over the concentration range of 0.001-2.5 mg/mL.The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） of this method were 0.3 and 1.0 mg/100 g，respectively.Compared with high performance liquid chromatography （HPLC）， the GC method could effectively separate cholesterol and phytosterols， with simpler operation， better reproducibility， and higher accuracy and sensitivity.
Key words: gas chromatography； cholesterol； phytosterol