图1 艾地那非一级（A）、二级（B）质谱扫描图
Fig.1 MS （A） and MS2 （B） spectra of aildenafil
张丽媛，颜琳琦，周明昊，吴鸳鸯
（浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310000）
摘 要：目的：采用高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法，建立保健酒中非法添加物艾地那非的检测方法。方法：使用Agilent RRDH Eclipse-plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸-乙腈溶液为流动相A、0.1%乙酸-20 mmol/L乙酸铵溶液为流动相B进行梯度洗脱。通过HPLC-MS/MS系统中全扫描模式对艾地那非进行定性分析，多反应监测模式对艾地那非进行定量分析。结果：该方法线性r2大于0.99，精密度相对标准偏差小于3%，不同质量浓度样品平均回收率为97.31%～100.66%，检出限为0.6 ng/mL，定量限为1.6 ng/mL。结论：此方法测定准确、灵敏度高、分离度高，可用于保健酒中非法添加物艾地那非的筛选和检测。
关键词：艾地那非；高效液相色谱-串联质谱法；保健酒；检测方法；非法添加
引文格式：
张丽媛， 颜琳琦， 周明昊， 等.高效液相色谱-串联质谱检测保健酒中非法添加物艾地那非［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 198-202.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614036. http://www.spkx.net.cn
ZHANG Liyuan， YAN Linqi， ZHOU Minghao， et al.Determination of aildenafil illegally added in health wine by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 198-202.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614036. http://www.spkx.net.cn
艾地那非是5型磷酸二酯酶（phosphodieseterase 5，PDE5）抑制剂枸橼酸西地那非的新型衍生物［1］，枸橼酸西地那非、伐地那非和他达拉非是美国食品药品监督管理局于1998年批准，用于治疗男性勃起功能障碍的药物［2］。近年来，一些不法厂家将其加入到补肾壮阳类中成药和保健食品中，利用其用量少、效果快的特点，谋取高额利润。此类药物，对具有心血管系统疾病和糖尿病的患者有严重不良反应，消费者长期服用此类保健品将对身体产生严重危害［3-7］。2015年7月31日，国家食药监总局在官网通告，有多达51 家69 种保健酒、配制酒中非法添加了西地那非等化学物质，此消息令外界震惊，也暴露了保健酒行业的乱象［8］。
近年来，随着国家查处力度的不断增大，一些不法商家转而向保健食品中添加PDE5型抑制剂的衍生物，以期利用更隐蔽的方法获得高额利润，危害人民健康［9］。对于PDE5型抑制剂及其衍生物的检测多采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法，而HPLC-串联质谱（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法，无论在选择性、灵敏度及分子质量的测定方面均优于HPLC法［10-16］。目前，国家食品药品监督管理局已发布了补肾壮阳类中成药中11 种PDE5型抑制剂及其衍生物的检测方法（国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件（批准件编号：2009030））。但在日常监督检测中，发现某厂家生产的3 批保健酒中非法添加了新型的衍生物——艾地那非。故采用HPLC-MS/MS法，对保健酒中非法添加的化学药物艾地那非进行方法学研究，以期建立快速有效的检测方法。
1.1 材料与试剂
艾地那非（纯度9 9.9%）、红地那非（纯度99.1%）、伪伐地那非（纯度99.5%）、羟基豪莫西地那非（纯度98.8%）、那莫西地那非（纯度99.7%）、豪莫西地那非（纯度98.7%）、伐地那非（纯度99.5%）、氨基他达拉非（纯度99.9%）、那红地那非（纯度99.9%）、硫代艾地那非（纯度99.7%） 加拿大TLC Pharmachem公司；西地那非（纯度99.3%）、他达拉非（纯度99.3%） 中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯） 德国Merck公司；乙酸铵、甲酸（均为色谱纯） 美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
1290-6490QQQ HPLC-MS/MS联用仪（配有电喷雾离子源及MassHunter数据处理系统） 美国Agilent公司；MS205DU电子天平 瑞士梅特勒公司；KQ-300DB超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Genpure UV/UF超纯水仪 美国热电公司。
1.3 方法
参考国家食品药品监督管理局发布的（国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件（批准件编号：2009030））对补肾壮阳类中成药中11 种PDE5型抑制剂及其衍生物的检测方法，优化并确定对新发现PDE5型抑制剂衍生物艾地那非检测的条件。
1.3.1 HPLC条件
A g i l e n t R R D H E c l i p s e-p l u s C1 8色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样量1 μL；流动相A：0.1%甲酸-乙腈溶液；流动相B：0.1%乙酸-20 mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱程序：0～7 min，30% A，70% B；7～12.5 min，30%～85% A，70%～15% B；12.5～13 min，85% A，15% B；13～13.5 min，85%～30% A，15%～70% B；13.5～15 min，30% A，70% B。
1.3.2 MS条件
离子化方式：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：全扫描一级质谱，选择离子全扫描二级质谱方式定性检测；一级质谱扫描范围为m/z 100～1 000；二级质谱扫描范围为m/z 50～550；多反应监测模式定量检测；毛细管温度350 ℃；鞘气流速11 L/min；离子源电压4 kV。
1.3.3 对照品溶液制备
精密称取艾地那非对照品适量，加乙腈配制成每1 mL含1 μg、100 ng的溶液，分别作为一级质谱扫描及选择离子全扫描二级质谱溶液。
1.3.4 样品溶液制备
取待测保健酒样品过0.22 μm有机滤膜，取续滤液置进样瓶中，待测。用乙腈稀释，并进行一、二级质谱扫描。待测保健酒样品均采自浙江省食品药品检验研究院日常抽检。
2.1 艾地那非一、二级质谱扫描图谱
由图1可知，艾地那非［M+H+］m/z如下：一级质谱母离子为489，二级质谱分子离子碎片为377、311、283、113、99、71。在二级质谱扫描模式下对艾地那非碰撞能进行优化，选择碰撞能量为43 cid。
图1 艾地那非一级（A）、二级（B）质谱扫描图
Fig.1 MS （A） and MS2 （B） spectra of aildenafil
艾地那非与西地那非衍生物-豪莫西地那非具有相同的分子式和相似的结构式［1，17］，见图2。在HPLC-MS/ MS系统下，通过一级质谱全扫描发现艾地那非与豪莫西地那非具有相同的母离子，两者二级质谱扫描图相似，如图3所示，且在色谱图中出峰时间相近。因此，采用HPLC-MS/MS方法检测保健酒中非法添加艾地那非时，应注意各色谱峰的分离度，避免误判。
图2 艾地那非（A）、豪莫西地那非（B）结构式
Fig.2 Structural formulas of aildenafil （A） and homosildenafi （B）
图3 豪莫西地那非二级质谱扫描图
Fig.3 MS2 spectrum of homosildenafil
2.2 多反应监测模式下艾地那非的定量分析结果
选择艾地那非对照品碎片离子中离子丰度较高的2 个碎片离子283、99，分别作为定性和定量离子，见图4。采用MassHunter软件进行数据处理。
图4 艾地那非多重反应监测质谱图
Fig.4 Mass spectrum of aildenafil in MRM mode
2.2.1 线性关系
精密称取艾地那非对照品适量，加乙腈配制成质量浓度分别为1.61、3.22、8.05、16.10、32.20 ng/mL的梯度对照品，测定峰面积［18］。以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，计算得回归方程Y=709.69X+238.49，r2=0.999 5。可见，艾地那非在质量浓度为1.61～32.20 ng/mL范围内线性良好。
2.2.2 精密度实验结果
分别精密吸取质量浓度为1.61、8.05、32.20 ng/mL的艾地那非对照品溶液作为低、中、高质量浓度溶液，各重复进样3 次，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于3.0%，表明仪器精密度良好［19-20］。结果见表1。
表1 艾地那非在不同质量浓度条件下的精密度
Table 1 Precisi on （RSD） for 3 replicated eterm in ati on s of aildena fila td ifferentc on centrati on levels
2.2.3 检出限与定量限测定结果
采用空白样品加标准溶液的方法测定［18-22］。取某厂生产的在上述检测条件下未检出艾地那非的保健酒溶液2 份，分别加入适量对照品溶液。以3 倍信噪比为检出限最低响应值，计算检出限为0.6 ng/mL；以10 倍信噪比为定量限最低响应值，计算定量限为1.6 ng/mL。
2.2.4 回收率测定结果
表2 艾地那非在不同质量浓度条件下的回收率
Table 2 Recoveries of aildenafilspiked at different c on centrati on levels
采用样品加标回收法测定［20，22］。取上述检测条件下阴性保健酒溶液9 份，分别加入适量对照品溶液，使加标质量浓度分别达到定量限质量浓度、2 倍定量限质量浓度、10 倍定量限质量浓度3 个添加水平，按1.3.3节供试品溶液制备，每个添加水平平行制备3 份样，计算回收率，如表2所示，不同质量浓度水平平均回收率为97.31%～100.66%，RSD小于3%。
2.2.5 专属性
在3 批检出艾地那非的保健酒中，按1.3节方法测定，样品中出现与对照品保留时间和质谱图一致的色谱峰［18］。同条件下艾地那非与11 种对照品能有效分离，如图5所示。
图5 12 种对照品色谱图
Fig.5 Chromatogram of mixture of12 reference substances
2.2.6 样品定量测定结果
按照上述方法对10 批保健酒样品进行确证定量，检测出3 批含艾地那非的阳性样品，含量分别为1.00、0.83、0.91 mg/kg，如图6所示。
图6 阳性样品色谱图（A）、多重反应监测质谱图（B）
Fig.6 Chromatogram of positive samples （A） and MRM spectrum （B）
西地那非等化学药物为可溶于乙醇和水的白色或类白色结晶粉末［23］，故易溶解于保健酒中。经过文献［24］检索发现，艾地那非为西地那非的衍生物。故参照国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件（批准件编号：2009030）检测方法，采用直接进样法可有效检测出保健酒中非法添加的化学药物。本实验中涉及到的保健酒中非法添加的化学药品艾地那非是日常监督样品中的“异常图谱”，属于意外发现。参照上述方法对保健酒中添加的化学药物艾地那非进行方法学验证表明：该方法可方便、快速、准确的对保健酒中非法添加的化学药品艾地那非进行定性、定量检测。且可以在同一系统条件下将12 种化学药品成分有效分离，提高了工作效率。
西地那非等PDE5抑制剂作为临床治疗阴茎勃起功能障碍的一线药物，且主要为进口药物［25-26］，目前有针对的检测方法。但艾地那非是新型PDE5抑制剂，未广泛应用且检测方法未成熟，故在监管上存在一定程度的漏洞，让不法商家有机可乘。通过建立保健酒中非法添加物艾地那非的检测方法，来进一步扩大检测范围，更有效的规范市场，使行业更加健康有序的发展。
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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614036
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）14-0198-05
收稿日期：2015-11-30
作者简介：张丽媛（1985—），女，助理工程师，硕士，研究方向为保健食品化妆品检测。E-mail：xiaojie1119ok@163.com
Determination of Aildenafil Illegally Added in Health Wine by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
ZHANG Liyuan， YAN Linqi， ZHOU Minghao， WU Yuanyang
（Zhejiang Institute for Food and Drug Control， Hangzhou 310000， China）
Abstract: Objective: To develop a detection method for aildenafil adulterated in health wine using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）.Methods: The chromatography was performed using an Agilent RRDH Eclipse plus C18column （2.1 mm × 100 mm， 1.8 μm）， with a mobile phase consisting of acetonitrile-0.1% formic acid （phase A） and 0.1% acetic acid-20 mmol/L ammonium acetate （phase B） by gradient elution.Qualitative analysis of aildenafil was conducted under full-scan model， and quantitative analysis in the multiple reaction monitoring （MRM） model.Results: The method was linear with a correlation coefficient （r2） ＞ 0.99， and its precision， expressed as RSD， was ＜ 3%.The recoveries of aildenafil at different spiked concentrations ranged from 97.31% to 100.66%.The limit of detection （LOD） was 0.6 ng/mL and the limit of quantitation （LOQ） was 1.6 ng/mL.Conclusion: This method is fast and accurate with a high sensitivity and a high degree of separation.It can be used for the screening and detection of aildenafil illegally added in health wine.
Key words: aildenafil； high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）； health wine；detection method； illegally added