图1 T OSP A的 GC-M S碎片离子图谱
Fig.1 GC-MS analysis of TOSPA
黄志勇，陈 艳，冯 慧，刘 超，景 赞
（乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000）
摘 要：建立一种乙酸酐衍生-气相色谱-电子捕获器检测食品中三氯蔗糖含量的方法。样品经水稀释、1-甲基咪唑催化、乙酸酐衍生，生成的衍生物采用气相色谱-质谱法定性，气相色谱-电子捕获器法定量。结果表明：衍生目标物为4，1′，6′-三氯-2，3，6，3′，4′-五乙酰基蔗糖，并且在0.02～1.2 mg/mL范围内线性关系良好（R= 0.999 4），检出限为0.23 mg/kg，回收率为90.0%～94.5%，相对标准偏差（n=6）为0.6%～2.5%。该方法操作简单、干扰少、检出限低、灵敏度高、线性好、结果准确，能很好地满足饮料中三氯蔗糖含量的测定。
关键词：三氯蔗糖；乙酸酐衍生；气相色谱-电子捕获器；气相色谱-质谱联用
引文格式：
黄志勇， 陈艳， 冯慧， 等.乙酸酐衍生GC-ECD法测定饮料中三氯蔗糖含量［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 203-206.
HUANG Zhiyong， CHEN Yan， FENG Hui， et al.Determination of sucralose in drinks by gas chromatography with electron capture detector （GC-ECD） after derivatization with acetic anhydride［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 203-206.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614037. http://www.spkx.net.cn
三氯蔗糖（4，1′，6′-三氯-4，1′，6′-三脱氧半乳型蔗糖），俗称蔗糖素［1］，是天然产物蔗糖的氯代衍生物，首先由英国泰莱公司与伦敦大学合作研究小组成功合成。因其具有甜度高（甜度是蔗糖的600 倍）、且甜味纯正、稳定性好、热值低（热值几乎为零）、安全性高［2-4］等诸多优点而被视为是一种较理想的新型甜味剂5-6］。但也有三氯蔗糖可诱发偏头疼发作［7］以及可能通过作用于人类肠道中的细菌，从而加重代谢性疾病病情的报道［8］。三氯蔗糖作为食品添加剂时必须按照GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》［9］中规定的范围和限量使用。
目前，食品中三氯蔗糖的测定方法主要集中在液相色谱-质谱联用法［10-12］和高效液相色谱的柱前衍生紫外检测［13-14］、蒸发光散射检测［15-19］和示差折光检测［19-21］，但采用蒸发光散射检测器其重现性还不够理想，示差折光检测器灵敏度低，不能进行梯度淋洗，达不到良好的分离效果。而对于实验室仪器普及率很高的气相色谱（gas chromatography，GC）在这方面的应用报道较少。Qiu Wenlong［22］、Farhadi［23］等报道了非食品中的三氯蔗糖在吡啶溶剂中进行三甲基硅烷化衍生后GC法测定，都获得了不错的结果，但此方法过程较复杂且对无水条件要求较高，产物易水解，同时在用氢火焰离子检测器检测时生成的二氧化硅容易附着其电极上对检测器造成污染。本实验采用廖洪梅等［24］、贺永惠［25］等单糖的乙酰化方法，在水溶液中以1-甲基咪唑为催化剂，乙酸酐为衍生化试剂，直接对三氯蔗糖进行衍生，并利用GC-MS仪对生成的糖醇乙酸酯衍生物进行定性分析，并利用三氯蔗糖中含有氯原子而采用GC-电子捕获检测器（electron capture detector，ECD）对其进行定量测定。该方法操作简单、干扰少、灵敏度高、结果准确。
1.1 材料与试剂
三氯蔗糖（纯度98%） 北京百灵威科技有限公司；三氯甲烷（色谱纯） 美国Mreda Technology公司；亚铁氰化钾、乙酸锌、乙酸酐（均为分析纯）成都长征化学试剂公司；1-甲基咪唑（纯度99%）成都化夏化学试剂有限公司；超纯水（电阻率：18.25 MΩ·cm）。
1.2 仪器与设备
UPT-Ⅱ-10T优普纯水机 成都超纯科技有限公司；CP225D双量程电子天平 德国赛多利斯公司；2010plus GC仪（配ECD）、TQ8040 GC-MS联用仪日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 标准品的衍生化及标准曲线的绘制
精密称取适量三氯蔗糖标准品于25 mL容量瓶中，加水溶解，并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为10 mg/mL的三氯蔗糖储备液。分别吸取三氯蔗糖储备液0.02、0.04、0.2、0.4、0.6、1.2 mL于10 mL容量瓶中，各加水稀释至刻度，即得质量浓度为0.02、0..04、0.2、0.4、0.6、1.2 mg/mL的标准系列溶液。分别吸取0.5 mL标准系列溶液于50 mL离心管中，加入冰乙酸100 µL，混匀，再加入0.5 mL 1-甲基咪唑和5 mL乙酸酐，混匀，90 ℃水浴反应1 h，冷却后加入10 mL水，分解乙酸酐终止反应，加入2 mL三氯甲烷，充分振摇萃取，静置5 min后取下层，用适量的无水硫酸钠干燥后用0.22 µm微孔膜过滤后，进行GC-ECD分析，以三氯蔗糖的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。其中对质量浓度为0.01 mg/mL标准溶液同时进行GC-MS分析。
1.3.2 样品溶液制备与分析
1.3.2.1 亚铁氰化钾溶液配制
称取106 g亚铁氰化钾，加水至1 000 mL；乙酸锌溶液：称取220 g乙酸锌，溶于少量水中，加入30 mL冰醋酸，加水稀释至1 000 mL。
1.3.2.2 样品分析
准确称取混匀后的样品2.5 g于25 mL容量瓶中，加入15 mL水混匀，超声20 min提取，用水定容至刻度，摇匀待衍生。对于含蛋白质较多的样品则加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各2.5 mL处理提取液，沉淀蛋白质。按1.3.1节法衍生、萃取、过滤后进行GC-ECD分析。
1.3.3 标准品和样品衍生测定
1.3.3.1 GC条件
色谱柱：Rtx-5石英毛细柱（30 m×0.32 mm，0.25 µm）；进样口温度300 ℃；检测器温度310℃；升温程序：180 ℃保持2 min，以20 ℃/min升至280 ℃，保持12 min；柱流量2.08 mL/min；不分流进样；进样量1.0 µL；溶剂延迟时间5 min。
1.3.3.2 GC-MS条件
电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度200℃；质量扫描范围m/z 50～700。色谱柱：Rxi-5Sil MS （30 m×0.25 mm，0.25 µm）；进样口、柱温箱温度均与GC条件一致。色谱柱流量0.83 mL/min；分流比1∶10；进样量1.0 µL；溶剂延迟时间5 min。
2.1 GC-MS联用分析
图1 T OSP A的 GC-M S碎片离子图谱
Fig.1 GC-MS analysis of TOSPA
从图1可以看到，没有出现4，1′，6′-三氯-2，3，6，3′，4′-五乙酰基蔗糖（4，1′，6′-trichloro-2，3，6，3′，4′-sucrose pentaacetate，TOSPA）的分子离子峰（m/z 607），这是由于电子电离源能量为70 eV，远高于普通化学键的键能，容易产生碎片离子，加之目标物本身具有多碳数、多支链的结构特点，导致分子离子峰的稳定性下降，最终没有分子离子峰的出现，但其糖苷键在电子轰击下断裂产生了2 个较大的碎片离子m/z 283、307，以及分离一个乙酰酯基后得到的碎片离子m/z 223、347。实验结果表明，该方法获得的三氯蔗糖衍生物为TOSPA。
2.2 标准曲线和检出限
在选定的色谱条件下进行测定，以峰面积对三氯蔗糖标准溶液质量浓度作校正曲线。配制标准溶液质量浓度分别为0.02、0.04、0.2、0.4、0.6、1.2 mg/mL，其线性方程为y=3 970 876x+69 602，R=0.999 4，其标准溶液的色谱图如图2A所示。将按1.3.2节前处理的加标样品稀释至含三氯蔗糖0.015 mg/mL，再按1.3.3.1节色谱条件进行测定，以3 倍信噪比计算该方法的检出限为0.23 mg/kg。实验结果表明，该方法在0.02～1.2 mg/mL范围内线性关系良好，检出限较低，能满足饮料中三氯蔗糖含量测定的要求。2.3 加标回收率和精密度
图2 三氯蔗糖对照品 （ A）、阴性样品（ B）和阴性加标样品 （ C）的色谱图
Fig.2 Chromatograms of sucralose standard， negative sample and spiked negative sample
在阴性果蔬饮料样品中分别添加低、中、高3 个水平的工作溶液，按照上述衍生和色谱条件进行测定，每个水平重复6 次，色谱图见图2B、C。回收率结果见表1，平均回收率为90.0%～94.5%，相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）为0.6%～2.5%，证实该方法的准确度与精密度都较高，满足测定要求。
表1 阴性样品的加标回收率和RSD（n=6）
Table 1 Spiked recoveries and RSDs of negatives ample（n= 6）
本实验针对饮料中三氯蔗糖建立了一种衍生、GCECD检测方法。利用1-甲基咪唑催化，在水溶液中直接对三氯蔗糖进行衍生，用GC-MS对生成的糖醇乙酸酯衍生物进行分析，确定其衍生物为TOSPA，用GC-ECD对其进行定量测定。在0.02～1.2 mg/mL范围内具有良好的线性响应（R=0.999 4），方法检出限为0.23 mg/kg，添加0.25、0.5、1.0 mg/kg三个水平条件下的平均回收率在90.0%～94.5%之间，RSD在0.6%～2.5%之间。该方法具有操作简单、干扰少、灵敏度高、结果准确等特点，适用于饮料中三氯蔗糖含量的测定。
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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614037 10.7506/spkx1002-6630-201614037. http://www.spkx.net.cn
中图分类号：O657
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）14-0203-04
收稿日期：2015-10-25
作者简介：黄志勇（1986—），男，硕士，研究方向为仪器分析与食品质量控制。E-mail：huangzhy86@163.com
Determination of Sucralose in Drinks by Gas Chromatography with Electron Capture Detector （GC-ECD） after Derivatization with Acetic Anhydride
HUANG Zhiyong， CHEN Yan， FENG Hui， LIU Chao， JING Zan
（Leshan Institute for Food and Drug Control， Leshan 614000， China）
Abstract: A gas chromatographic （GC） method with an electron capture detector （ECD） after acetylation was developed for the determination of sucralose in drinks.Samples were diluted with water and then derivatized with acetic anhydride in the presence of 1-methylimidazole as a catalyst.Qualitative and quantitative analyses of the derivatives were achieved by GC-MS and GC-ECD， respectively.The results showed that the target derivative was 4，1′，6′-trichloro-2，3，6，3′，4′-sucrose pentaacetate （TOSPA）.The calibration curve for the analyte showed good linearity in the range of 0.02-1.2 mg/mL （R = 0.999 4）.The limit of detection （LOD） for sucralose was 0.23 mg/kg， and the recoveries obtained by standard addition method were between 90.0% and 94.5%， with relative standard deviations （RSD， n = 6） between 0.6% and 2.5%.This method provides the advantages of low LOD， high sensitivity， less disturbance， good linearity， high accuracy and simple operation.Thus， it can be applied in sucralose analysis in drinks.
Key words: sucralose； derivatization with acetic anhydride； gas chromatography-electron capture detector （GC-ECD）； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）