地衣芽孢杆菌对草鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响

余永名 1，刘岩 1，李学鹏 1，李春 2，仪淑敏 1，*，励建荣 1，*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州 121013；2.渤海大学数理学院，辽宁锦州 121013）

摘要：将地衣芽孢杆菌接种到草鱼肌原纤维蛋白中，研究不同贮藏温度条件下地衣芽孢杆菌对草鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响。结果表明：地衣芽孢杆菌对草鱼肌原纤维蛋白凝胶特性和结构有较大影响。4 ℃和25 ℃贮藏条件下，随着贮藏时间的延长，凝胶强度、硬度、弹性和白度均呈下降趋势，且对照组下降幅度大于空白组；空白组和对照组凝胶的菌落总数均显著增加，自由水含量随着贮藏时间延长逐渐增加，对照组上升更明显，其保水性逐渐变差；场发射扫描电镜观察到凝胶微观结构被破坏，由紧密的网状结构逐渐变得疏松多孔；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）结果表明肌球蛋白重链和肌动蛋白逐渐被降解，且对照组凝胶的结构和蛋白降解程度均大于空白组。25 ℃条件下更适宜地衣芽孢杆菌的生长，样品凝胶破坏程度大于4 ℃条件下贮藏的样品。

余永名，刘岩，李学鹏，等. 地衣芽孢杆菌对草鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响［J］. 食品科学， 2016， 37（15）: 31-38.

YU Yongming， LIU Yan， LI Xuepeng， et al. Effect of Bacillus licheniformis on gel properties of grass carp myofibrillar protein［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 31-38. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615006.

淡水鱼肌原纤维蛋白的凝胶形成能力较海水鱼差，越来越多的研究者通过在加工过程中改善工艺、加入添加物等方式去提高其凝胶特性。但是贮藏过程中如微生物污染、温度等条件的变化等仍有可能导致最终产品凝胶特性的降低。Mori ［1］和Coton ［2］等认为一些芽孢杆菌出现在鱼糜制品的贮藏中期，推测可能是导致鱼糜制品腐败的原因，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是其中很常见的一类［2］，也是鱼丸的优势腐败菌之一［3］。芽孢杆菌在不利条件下能够形成具有特殊抵抗力的芽孢，污染食品后因具有耐热性而易残留，鱼糜制品经过高温处理也很难将其杀死，在贮藏过程中持续地影响鱼糜制品的品质。

草鱼年产量居我国四大淡水鱼类养殖品种的首位，可作为鱼糜加工的主要原料之一。本实验以草鱼肌原纤维蛋白为研究对象，向其中加入一定量的地衣芽孢杆菌，通过热诱导形成凝胶，研究不同贮藏温度条件下地衣芽孢杆菌对草鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响，从肌原纤维蛋白凝胶特性变化的角度阐述草鱼肉及其鱼糜制品在贮藏过程中变化情况，以期为提高草鱼及其鱼糜制品贮藏品质提供理论参考。

1　材料与方法

地衣芽孢杆菌（菌种编号1.265）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）。

营养肉汤、平板计数琼脂、营养琼脂北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂均为分析纯。

LRH系列生化培养箱上海一恒科技有限公司；TA.XT-plus质构仪英国Stable Micro Systems公司；NMI20核磁共振分析仪上海纽迈电子科技有限公司；蛋白电泳仪、GS-800图像扫描仪美国Bio-Rad公司；UV2550紫外-可见分光光度计日本岛津公司；MLS-3030CH立式高压蒸汽灭菌锅三洋电机有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台苏景集团苏州安泰技术有限公司；CR-400色彩色差计柯尼卡美能达（中国）投资有限公司；BagMixer400拍打均质器法国Interscience公司；T25 basic组织匀浆机德国IKA公司；S4800场发射扫描电镜日本Minolta公司。

菌种活化：用无菌吸管吸取0.3～0.5 mL适宜液体培养基，加入到装有冻干粉末状地衣芽孢杆菌的安培管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，移殖于固体培养基中，在37 ℃条件下培养48 h，获得的地衣芽孢杆菌单菌落再进行2 次纯培养。

菌悬液的制备：将活化好的菌株接种于LB培养基，37 ℃培养12 h，以2%的接种量传代培养1 次后，用无菌生理盐水进行10 倍梯度稀释，制成约10 7CFU/mL菌悬液，4 ℃条件下保存备用。

根据Hong等［4］的方法并略作修改，取新鲜草鱼背部肉，与4 倍体积的pH 6.25、50 mmol/L磷酸盐缓冲液（含有0.1 mol/L NaCl）混合，匀浆2 min，每匀浆20 s，停20 s，防止过热，匀浆液4 ℃、3 500×g离心15 min，并且收集沉淀，重复2 次。沉淀再与4 倍体积的pH 6.25、0.1 mol/L NaCl混合摇匀，混合液4 ℃、3 500×g离心15 min，收集沉淀，重复2 次，再经过两层纱布过滤除去结缔组织，滤液以4 000×g离心15 min，所得沉淀即为肌原纤维蛋白。

将肌原纤维蛋白分成200 g的两等份，加入2.5%食盐擂溃后分装于灭菌的500 mL烧杯中，按照1∶40（V/V）加入浓度为10 7CFU/mL的菌悬液（对照组），另一组按照同样的比例加入生理盐水（空白组），混合均匀，再以15 g每瓶分装于灭菌带盖的玻璃瓶（3 cm×5 cm）中，将小瓶在4 ℃、3 500×g离心1 min，排除内部的空气，之后放到80 ℃水浴锅中加热30 min，取出后在冰上放置1 h，将样品分别贮藏于4 ℃和25 ℃条件下，定期取样测定指标。

凝胶强度为破断力与凹陷距离的乘积：凝胶强度/（g·mm）=破断力/g×凹陷距离/mm。测定前将凝胶样品于室温放置30 min，切成2.5 cm×2.5 cm的圆柱体［5］。凝胶强度通过质构仪进行测定。每组样品进行5 份平行测定。

参数设定：探头型号为P/5S；测前速率为1 mm/s、测试速率为1 mm/s、测后速率为1 mm/s；压缩距离为15 mm；触发力为10 g。

测定前将凝胶样品于室温放置30 min，切成2.5 cm×2.5 cm的圆柱体，选用质构仪的TPA模式测定其硬度、弹性等各项指标。测试参数设定为：P/50探头；测前速率2 mm/s、测试速率2 mm/s、测后速率2 mm/s；触发力5 g；压缩程度为40%，其中停留时间为5 s，每组样品做5个平行。

测定前将凝胶样品于室温放置30 min，采用色差计测量，测定L*（明亮度）、a*（红绿偏差）和b*（黄蓝偏差）值。白度的计算公式如下［6］。

凝胶样品在室温下放置平衡30 min后，制成直径为10 mm、高为20 mm的圆柱体并装入核磁管，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列进行自旋-自旋弛豫时间T 2的测定，每组做5 个平行。测试参数：线圈直径：15 mm；频率：22.0 MHz；温度：（32.00±0.01） ℃；采用重复时间（T R）：3 000 ms；回波时间（EchoTime）：150 μs；重复扫描次数（NS）：8；回波个数（EchoCnt）：3 500。所得CPMG指数衰减曲线采用仪器自带的软件进行反演，得到T 2各个部分所对应的峰面积值为W 1、W 2及W 3，它们分别代表3 个组分中水的百分含量。

参照Oujifard等［7］的方法并稍作修改：将肌原纤维蛋白凝胶切成小块（3 mm×3 mm×2 mm），用2.5%戊二醛溶液固定24 h，去除固定液，用0.2 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液漂洗3 次，15 min/次，再用去离子水冲洗1 h，之后分别用50%、70%、90%的乙醇梯度脱水，15 min/次，再用100%乙醇脱水3 次，10 min/次，处理完后进行真空冷冻干燥，然后离子溅射镀金，最后用扫描电镜进行观察。

1.3.9　十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析

参考Laemmli ［8］的方法并稍作修改：称取鱼糜凝胶3.0 g，绞碎后加入27 mL加热到85 ℃的5% SDS溶液，用高速匀浆机均质4 min后85 ℃水浴加热1 h，冷却后将匀浆液在26～28 ℃、11 000 r/min条件下离心5 min，取上清液。调节上清液质量浓度为6 mg/mL，与上样缓冲液按1∶2（V/V）比例混合，沸水浴5 min。制胶后上样10 μL，其中浓缩胶4%、分离胶10%。52 mA恒流进行凝胶电泳。电泳完成后进行染色和脱色，染色液：0.25%的考马斯亮蓝R-250、50%甲醇和10%冰醋酸；脱色液：含50%甲醇和10%冰醋酸，脱色至背景基本无色，在凝胶成像仪上成像。

称取肌原纤维蛋白凝胶样品10 g，加入90 mL无菌生理盐水中，拍打匀浆120 s，室温静置20 min后，对样品进行梯度稀释后选取合适的稀释度，吸取1 mL不同梯度的稀释液注入平板中，采用平板法30 ℃培养48 h后进行计数。

实验数据采用SPSS 19.0软件进行分析处理，利用Origin 8.0软件作图。

2　结果与分析

表1　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在4 ℃贮藏过程中凝胶强度的变化
Table 1 Change in gel strength of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃

注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。表2～4同。

破断力/g凹陷深度/cm凝胶强度/（g·cm）空白组对照组空白组对照组空白组对照组0586.3±11.3 a583.3±8.6 a7.71±0.38 a7.81±0.44 a4 520.4 a4 555.6 a7607.4±9.9 a598.5±11.8 a7.82±0.22 a7.84±0.37 a4 749.9 a4 692.2 a14565.8±14.2 b512.7±13.4 b7.18±0.18 ab7.03±0.28 b3 847.0 b3 604.3 b21471.4±12.3 c421.5±10.8 c6.83±0.34 bc6.64±0.10 bc3 083.1 c2 705.8 c28377.3±8.3 d317.4±9.2 d6.21±0.23 c5.97±0.19 c2 218.8 d1 894.9 d4 ℃贮藏时间/d

表2　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在25 ℃贮藏过程中凝胶强度的变化
Table 2 Change in gel strength of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃

25 ℃贮藏时间/h破断力/g凹陷深度/cm凝胶强度/（g·cm）空白组对照组空白组对照组空白组对照组0586.3±11.3 a583.3±8.6 a7.71±0.38 a7.81±0.44 a4 520.4 a4 555.6 a12441.2±13.6 b403.7±9.4 b6.79±0.35 b6.62±0.39 b2 995.7 b2 672.5 b24342.9±9.3 c317.8±14.1 c6.28±0.17 bc6.01±0.27 bc2 098.5 c1 910.0 c36296.4±11.3 d238.7±10.7 d5.68±0.29 cd5.45±0.14 cd1 626.8 cd1 409.9 d48247.8±7.4 e219.4±9.9 d5.27±0.12 d5.03±0.22 d1 305.9 d1 103.6 d

凝胶强度是衡量凝胶制品品质的一项常用的指标，能反映凝胶制品内部结构的坚实程度。凝胶强度的大小主要与蛋白质的变性程度及其所形成的空间网络结构有关［9-10］。由表1、2可知，在4 ℃条件下随着贮藏期的延长，空白组和对照组凝胶强度均先略有增加再逐渐下降；且对照组的变化幅度更大。可能是因为在微生物的作用下骨架蛋白遭到破坏，肌原纤维蛋白的凝胶结构发生改变并暴露出更多的巯基基团，巯基含量的增加促使蛋白质凝胶性能得到提高［11］。后期由于微生物大量繁殖，蛋白质变性程度加快，导致网络结构交联度降低，蛋白质分子间相互作用力减小而使凝胶强度降低。相比空白组，对照组凝胶中地衣芽孢杆菌大量繁殖并能产生较多胞外蛋白酶，更易破坏蛋白质的结构，降低蛋白质分子间的相互作用。在25 ℃条件下贮藏的凝胶强度较4 ℃条件下贮藏的凝胶强度变化幅度更大，同样，对照组下降幅度大于空白组。相比4 ℃，25 ℃更适合于微生物的生长、繁殖速度快，产生的胞外酶更多且活性更强，加速对蛋白质的降解，破坏蛋白质网络空间结构的完整性，使蛋白质分子间的相互作用减弱，蛋白凝胶软化腐败，凝胶强度逐渐降低。

表3　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在4 ℃贮藏过程中的硬度和弹性变化
Table 3 Changes in hardness and elasticity of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃

4 ℃贮藏时间/d空白组对照组硬度/g弹性/mm硬度/g弹性/mm 0578.66±13.21 a0.921±0.002 a581.56±12.48 a0.926±0.003 a7586.25±11.57 a0.916±0.006 a591.37±9.08 a0.916±0.002 b14544.30±15.83 b0.872±0.003 b512.63±13.44 b0.831±0.004 c21471.32±8.72 c0.751±0.007 c437.14±11.52 c0.762±0.001 d28383.24±7.65 d0.759±0.004 c335.24±5.77 d0.724±0.002 e

表4　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在25 ℃贮藏过程中的硬度和弹性变化
Table 4 Changes in hardness and elasticity of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃

25 ℃贮藏时间/h空白组对照组硬度/g弹性/mm硬度/g弹性/mm 0578.66±13.21 a0.921±0.002 a581.56±12.48 a0.926±0.003 a12455.34±11.44 b0.803±0.007 b432.38±14.62 b0.788±0.004 b24364.89±9.87 c0.765±0.005 c329.32±9.54 c0.722±0.001 c36298.75±6.74 d0.701±0.002 d241.43±11.32 d0.635±0.005 d48265.45±12.21 e0.642±0.004 e229.47±7.44 d0.616±0.022 d

由表3、4可知，在4 ℃条件下冷藏过程中，空白组和对照组凝胶的硬度均呈现先增加后减小的趋势，且对照组变化的幅度大于空白组，可能是在微生物的作用下蛋白质骨架遭到破坏，并导致肌原纤维蛋白形成空间网络结构的能力变弱，使凝胶的保水性能逐渐降低，从而导致蛋白凝胶硬度略有增加［12-13］；后期微生物大量繁殖，蛋白质逐渐被分解，凝胶结构进一步被破坏，导致凝胶腐败变软，硬度逐渐降低。在25 ℃条件下贮藏过程中，凝胶的硬度呈显著下降趋势，且对照组下降幅度大于空白组；可能是在25 ℃贮藏过程中，细菌大量生长繁殖，产酶量及酶活性更高，加速了蛋白质的降解，破坏了蛋白质网络空间结构的完整性，使得蛋白凝胶软化腐败，硬度下降［14］。两种贮藏温度下，随着贮藏期的延长，对照组凝胶硬度的变化幅度均大于空白组，原因可能与细菌数量及产酶量有关——对照组接种了地衣芽孢杆菌且其可以产生胞外蛋白酶，更容易导致蛋白质腐败变质。

凝胶的弹性是指当外力促使凝胶变形后，除去外力时凝胶所能恢复到形变前状态的程度。弹性反映的是固体力学性质的物理量，只有发生了变形并且具有恢复形变的能力，才能说明该样品具有弹性，弹性可作为衡量凝胶制品品质一项重要指标［15］。由表3、4可知，4 ℃和25 ℃贮藏过程中，凝胶弹性均呈现逐渐降低的趋势。弹性降低可能是由于微生物及蛋白酶对蛋白质的降解，破坏了凝胶的空间立体网络结构，使网络结构孔隙变大甚至破裂所致。实际上，肌原纤维蛋白的数量和完整性与蛋白凝胶的硬度、弹性、凝胶强度、持水力等指标均直接相关。而由空白组与对照组比较可知，随着贮藏期的延长，对照组凝胶弹性的变化幅度大于空白组，由于对照组接种了地衣芽孢杆菌且其可以产生胞外蛋白酶，更容易导致蛋白质腐败变质，所以其弹性的下降幅度要大于空白组。

图1　草鱼肌原纤维蛋白在25 ℃（a）和4 ℃（b）贮藏的白度变化
Fig. 1 Change in whiteness of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃ （a） and 4 ℃ （b）

对于蛋白凝胶而言，光在其中的散色是由肌原纤维蛋白凝胶结构以及散色粒子的大小决定的［16］，即白度主要取决于蛋白质变性与聚合程度以及其表面的光学特性［17-20］。由图1可知，随着贮藏时间的延长，凝胶白度呈明显下降趋势，这可能是由于在贮藏过程中细菌大量繁殖，蛋白质逐渐被氧化，凝胶结构被破坏，蛋白凝胶开始腐败变质，逐渐生成一些黄色斑点所致。另外，Xia Xiufang等［21］认为蛋白凝胶白度值的下降还可能和氨基酸侧链与氧化产物在加热形成凝胶时发生非酶褐变有关。25 ℃条件下蛋白凝胶白度的下降速率要大于4 ℃条件下贮藏的样品，原因是25 ℃更适合细菌的生长，其代谢速率比4 ℃时更快，能产生的胞外酶更多、酶活性更强，对蛋白质的氧化分解作用更强，使凝胶结构遭到严重破坏并逐渐腐败变质生成一些黄色斑点，并伴有汁液流出，甚至难以形成凝胶。而由空白组与对照组比较可知，随着贮藏期的延长，对照组凝胶白度的变化幅度要大于空白组，原因可能与细菌数量及产酶量有关，由于对照组接种了地衣芽孢杆菌且其可以产生胞外蛋白酶，更容易导致蛋白凝胶发生腐败变质，所以白度值的下降幅度要大于空白组。

肌原纤维蛋白凝胶中存在三部分水，分别是：结合水，是指与蛋白质等大分子在氢键的作用下，氨基和羰基紧密结合形成的单分子层水［22］；不易流动水，是位于蛋白质空间网状结构空隙中的水分，即束缚水［23］；自由水，是存在于细胞外的水，自由水是蛋白凝胶中结合最不紧密的水，也是离心等外界处理最易除去的水，该部分水相对百分含量越高，则蛋白凝胶的保水性越差。三部分水分占总水分的比例分别为W 1、W 2、W 3。由表5、6可知，在贮藏过程中，W 1变化范围很小，基本保持不变。W 2的所占比例最高（90%以上），变化幅度不显著，随着贮藏期的延长，初期逐渐下降，后期下降缓慢基本趋于稳定，表明随着贮藏时间的延长，由于细菌大量繁殖及其胞外酶的作用，束缚水存在的凝胶微观结构遭到破坏，导致水分和大分子的结合力减弱，逐渐挣脱原有束缚向外部迁移，逐渐向自由水转变［24］，使得W 2减少。随着贮藏期的延长，W 3呈明显的上升趋势，浮动范围最大，即随着贮藏时间的延长，蛋白凝胶中自由水的含量显著增加，表明蛋白凝胶的保水性越来越差。空白组与对照组之间的差异主要与细菌数量及产酶量有关，导致对凝胶结构的破坏程度不同所致。另外，与4 ℃条件下贮藏的凝胶相比，25 ℃条件下贮藏的凝胶W 3变化幅度更明显，表明在25 ℃时自由水对引起凝胶内部结构的改变所导致的水分迁移性的变化更敏感。

表5　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在4 ℃贮藏过程中水分含量变化
Table 5 Change in moisture content of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃%

注：同行小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。表6同。

组别贮藏时间/d 0 7 142128空白组W 11.69±0.03 a1.70±0.02 a1.68±0.04 a1.71±0.02 a1.70±0.01 aW 295.12±0.29 a94.92±0.37 a94.27±0.19 b93.78±0.22 bc93.37±0.13 cW 33.19±0.13 a3.38±0.10 a4.05±0.09 b4.51±0.18 c4.93±0.11 dW 11.70±0.04 a1.68±0.01 a1.71±0.02 a1.69±0.01 a1.69±0.03 aW 295.21±0.30 a94.78±0.16 a94.16±0.11 b93.56±0.28 c92.81±0.21 dW 33.09±0.12 a3.54±0.08 b4.13±0.10 c4.75±0.17 d5.50±0.10 e对照组

表6　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在25 ℃贮藏过程中水分含量变化
Table 6 Change in moisture content of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃%

组别贮藏时间/h 0 12243648空白组W 11.69±0.03 a1.69±0.02 a1.70±0.01 a1.67±0.02 a1.65±0.04 aW 295.12±0.29 a94.01±0.21 b93.11±0.18 c92.92±0.12 c92.78±0.11 cW 33.19±0.13 a4.30±0.08 b5.19±0.10 c5.41±0.07 cd5.57±0.14 d对照组W 11.70±0.04 a1.69±0.02 a1.71±0.02 a1.69±0.03 a1.68±0.01 aW 295.21±0.30 a93.81±0.17 b92.06±0.21 c91.80±0.06 c91.65±0.10 cW 33.09±0.12 a4.50±0.06 b6.23±0.11 c6.61±0.07 d6.67±0.12 d

由图2、3可知，随着贮藏时间的延长，肌原纤维蛋白凝胶的结构由平整、光滑、紧实逐渐变得凹凸不平、粗糙、疏松多孔，25 ℃条件下贮藏的蛋白凝胶结构变化程度要大于4 ℃条件下贮藏的样品，贮藏后期凝胶结构的孔隙也更大，可能是由于在25 ℃细菌可以大量繁殖且产酶量高，对于蛋白质分解速率更快，降解程度也更高。而由空白组与对照组比较可知，空白组肌原纤维蛋白凝胶样品的降解程度要小于对照组，地衣芽孢杆菌大量生长繁殖及产生的胞外蛋白酶会导致肌原纤维蛋白逐渐被降解，因而导致对照组蛋白凝胶结构的破坏程度大于空白组。

图2　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在4 ℃贮藏的扫描电镜图
Fig. 2 SEM photomicrographs of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃

图3　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在25 ℃贮藏的扫描电镜图
Fig. 3 SEM photomicrographs of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃

2.6　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在贮藏过程中SDS-可溶性蛋白含量的变化

图4　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在4 ℃贮藏过程中的SDS-PAGE图谱
Fig. 4 SDS-PAGE pattern of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃

图5　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在25 ℃贮藏过程中的SDS-PAGE图谱
Fig. 5 SDS-PAGE pattern of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃

由图4、5可知，草鱼肌原纤维蛋白凝胶的SDS-可溶性蛋白条带众多，分子质量主要分布在10～200 kD之间，其中肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）最易发生降解［25］，这与本实验结果相一致。随着贮藏时间的延长，MHC条带的光密度逐渐减弱，说明肌球蛋白重链在贮藏过程中逐渐发生降解。与肌球蛋白重链的变化相比，肌动蛋白（actin）的降解程度略低，但降解程度明显。蛋白质的降解的程度受很多因素影响，如温度、微生物和酶等［26］，内源性组织蛋白酶在80 ℃凝胶化过程中基本失活，而地衣芽孢杆菌在贮藏过程中产生的胞外蛋白酶及其他产酶细菌对蛋白的降解可能起到了主要作用。样品在25 ℃贮藏36～48 h后条带明显变浅，基本不可见；而样品在4 ℃贮藏到第28天时基本不可见，25 ℃条件下贮藏的样品肌球蛋白重链降解速率明显较4 ℃条件下贮藏的样品更快，由于25 ℃时细菌大量繁殖且地衣芽孢杆菌等产酶细菌产生的胞外蛋白酶量更多，导致肌原纤维蛋白更容易被降解。而由空白组与对照组比较可知，空白组MHC的降解程度要低于对照组，原因是对照组接种了地衣芽孢杆菌，其大量生长繁殖及产生的胞外蛋白酶会导致肌原纤维蛋白逐渐降解。

图6　草鱼肌原纤维蛋白凝胶在4 ℃（a）和25 ℃（b）贮藏过程中的菌落总数变化
Fig. 6 Change in total number of colonies of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃ （a） and 25 ℃ （b）

由图6可知，随着贮藏时间的延长，草鱼肌原纤维蛋白凝胶菌落总数明显增加，且在25 ℃条件下前24 h增长迅速，后24 h增长缓慢基本趋于稳定，由于初期营养物质比较丰富，有利于细菌的生长繁殖，随着贮藏时间的延长，细菌数量达到一定的限度，对肌原纤维蛋白的降解及结构的破坏也已经达到了极限，对凝胶网络结构形成过程中氢键、疏水相互作用等的破坏趋于饱和，此时凝胶难以形成，营养物质已经被大量消耗，导致后期菌落数量趋于平稳。25 ℃条件下菌落总数的增长速率明显快于4 ℃条件下，可以看出25 ℃更适合于细菌的生长繁殖。而由空白组与对照组比较可知，随着贮藏时间的延长，接种地衣芽孢杆菌的对照组细菌总数的增长速率要快于空白组。

3　结论

本实验表明，无论是在4 ℃还是25 ℃条件下，随着贮藏时间的延长，空白组和对照组草鱼肌原纤维蛋白凝胶中的细菌总数均明显增加，凝胶强度、硬度和弹性大致呈下降趋势，白度显著下降；低场核磁共振结果显示蛋白凝胶的自由水含量显著增加，表明其保水性逐渐变差。此外，场发射扫描电镜观察到凝胶样品的结构逐渐被破坏，由紧密的网状结构逐渐变得疏松多孔；SDS-PAGE结果表明肌球蛋白重链和肌动蛋白逐渐被降解。对照组的肌原纤维蛋白凝胶样品各指标的变化幅度均大于空白组，表明地衣芽孢杆菌对蛋白凝胶特性产生较大影响，严重破坏了凝胶结构；25 ℃条件下更适宜地衣芽孢杆菌的生长，样品凝胶破坏程度大于4 ℃条件下贮藏的样品凝胶。

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Effect of Bacillus licheniformis on Gel Properties of Grass Carp Myofibrillar Protein

YU Yongming 1， LIU Yan 1， LI Xuepeng 1， LI Chun 2， YI Shumin 1，*， LI Jianrong 1，*（1. National & Local Joint Engineering Research Center of Storage， Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products， Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province， College of Food Science and Project Engineering， Bohai University， Jinzhou 121013， China； 2. School of Mathematics and Physics， Bohai University， Jinzhou 121013， China）

Abstract：The effect of inoculation with Bacillus licheniformis on gel properties of grass carp myofibrillar protein during subsequent storage at different temperatures was investigated. The results showed that gel properties were greatly affected by Bacillus licheniformis， resulting in severely damaged gel structure. At 4 and 25 ℃，with the extension of storage time，gel strength， hardness， elasticity and whiteness showed a falling trend， and the control group presented a more significant decrease than the blank group. The total number of colonies in the two groups increased significantly， and the free water content of myofibrillar protein gels increased gradually with storage period， especially significantly in the control group，which in turn showed poorer water retention capacities. Moreover， the microstructure of gels was damaged and became more loose and porous， which was initially dense， as observed by FE-SEM. In addition， sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） results showed that myosin heavy chain （MHC） and actin were gradually degraded. The control group displayed a higher degree of structure and protein degradation than the blank group. Bacillus licheniformis grew better at 25 ℃， leading to more serious damage to the gel than at 4 ℃.

Key words：Bacillus licheniformis； grass carp； myofibrillar protein； gel properties

基金项目：国家自然科学基金面上项目（31571868）；辽宁省高校重大科技平台-辽宁省教育厅重点实验室基础研究项目（LZ2015002）作者简介：余永名（1990—），男，硕士研究生，主要从事水产品贮藏加工及质量安全控制研究。E-mail：yym1144@163.com

*通信作者：仪淑敏（1980—），女，副教授，博士，主要从事水产品贮藏加工及质量安全控制研究。E-mail：yishumin@163.com励建荣（1964—），男，教授，博士，主要从事水产品贮藏加工及安全控制研究。E-mail：lijr6491@163.com

地衣芽孢杆菌对草鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　结论