叶黄素酯在强化面包制作和贮藏中的稳定性

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014；2.国家蔬菜加工技术研发专业分中心，江苏南京 210014；3.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）

摘要：通过将叶黄素酯水溶性微囊粉添加于面包中，考察面包和面、发酵、焙烤和贮藏过程中总叶黄素酯、总叶黄素及其异构体的变化情况，旨在监测叶黄素酯在强化面包制作和贮藏过程中的稳定性。结果表明：和面和发酵对叶黄素酯的降解影响不大，皂化测得的总叶黄素和全反式叶黄素保留率较高；烘烤引起面包皮和面包芯中叶黄素酯含量的明显降低，随之皂化测得的总叶黄素和全反式叶黄素保留率下降明显。叶黄素酯强化面包制作和贮藏过程中都伴有叶黄素异构体的不断生成和含量变化，和面过程中有少量的13-顺式和13’-顺式叶黄素生成，发酵过程有少量的9-顺式和9’-顺式叶黄素生成，焙烤过程面包皮和面包芯中13-顺式、13’-顺式、9-顺式和9’-顺式叶黄素含量显著累积增加，贮藏过程中面包皮和面包芯中的叶黄素酯、皂化测得的总叶黄素和全反式叶黄素含量，及叶黄素顺式异构体含量均略有下降。

刘春菊，谢晓叶，李大婧，等. 叶黄素酯在强化面包制作和贮藏中的稳定性［J］. 食品科学， 2016， 37（15）: 77-82. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615013. http://www.spkx.net.cn

LIU Chunju， XIE Xiaoye， LI Dajing， et al. Stability of lutein easters in fortified bread during processing and storage［J］. Food Science，2016， 37（15）: 77-82. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615013. http://www.spkx.net.cn

叶黄素酯是一种重要的类胡萝卜素脂肪酸酯，广泛存在于水果、蔬菜等植物中，在2008年被国家卫生部批准为新资源食品［1-2］。叶黄素酯是叶黄素结构中ε-紫罗酮环上的羟基与脂肪酸发生酯化反应，可有效避免羟基氧化生成的醛基或酮基的衍生物［3-4］。其具有抗氧化、抗癌、抗诱变、延缓动脉硬化等生理功能［5-8］，可提高在胃部混合胶束的溶解性，比类胡萝卜素自身更能阻止眼部光化学损伤。摄入叶黄素酯后血液和视网膜中叶黄素的水平升高［9］，有效的预防老年白内障以及老年性眼球视网膜黄色斑所导致的视力下降。

叶黄素酯主要构型为全反式，具有C=C长链，两侧没有活泼的羟基［10］。与叶黄素相比，叶黄素酯的光热降解速率常数低于同条件下的叶黄素，其半衰期长于同条件下的叶黄素［11］，受热强度的增加和时间的延长，叶黄素酯的降解速率比叶黄素要慢［12］，表明叶黄素酯对光、热等外界环境的稳定性优于叶黄素。Achmad等［13］发现羟基基团与脂肪酸发生的酯化反应生成的叶黄素酯对热处理和紫外光照都具有较强的稳定性。Fauziah等［14］研究得出60 ℃温度下，叶黄素酯比叶黄素更稳定，具有较长的保质期。目前叶黄素酯作为抗氧化剂、着色剂等广泛应用于食品、饮料等领域，提高了消费者膳食中叶黄素的摄入量。但强化添加到食品中的叶黄素酯经过现代食品加工工序和贮藏其稳定性如何？这对于叶黄素酯的实际摄入量及对人体所起的作用具有重要的现实意义。因此，本实验通过强化叶黄素酯于面包中，研究面包加工工序及不同贮藏条件下叶黄素酯、叶黄素及其异构体的变化规律，旨在为叶黄素酯在面包工业应用和消费者食用提供一定的参考价值。

1　材料与方法

质量分数5%的叶黄素酯水溶性微囊粉大连医诺生物有限公司。

高活性干酵母粉安琪酵母有限公司；食用盐江苏井神盐化股份有限公司；风筝牌面包粉潍坊风筝面粉有限责任公司；全反式叶黄素标准品（97%）美国Sigma公司；无水硫酸钠、丙酮、石油醚、正己烷、氢氧化钾（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯（色谱级）美国天地公司。

全自动面包机 ACA北美电器；BS224S电子分析天平北京赛多利斯科学仪器公司；LGJ-12 冷冻干燥机北京松源华兴科技发展有限公司；RE-52A旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵上海东玺制冷仪器设备有限公司；WSC-S型色差仪上海精密科学仪器有限公司；D10氮气吹扫仪杭州奥盛仪器有限公司；HPLC1200高效液相色谱仪（主要包括在线真空脱气机、四元梯度洗脱泵、柱温箱、二级管阵列检测器（diode array detector，DAD））美国安捷伦科技有限公司。

根据预实验确定面包配方：面粉300 g、水180 g、盐3 g、酵母4 g，每份均匀添加0.320 g质量分数为5%的叶黄素酯水溶性微囊粉。

面包机执行程序依次为和面成型60 min，38 ℃醒发150 min，180 ℃烘烤60 min。考察和面成型后的面团（刚成团）、发酵后的面团（焙烤前）以及焙烤后的面包芯和面包皮中叶黄素酯和叶黄素含量的变化。取样部位分别为：面包皮从面包的6 个面中心取5 cm×5 cm的正方形后合并，面包芯取面包中心部位。平行取样3 次。

将制作好的面包用灭菌的保鲜袋封装后，再装入塑料包装袋中密封。20 ℃避光贮藏7 d，取样间隔为1 d。平行取样3 次。

按实验设计1.3.1节和1.3.2节条件取样，避光冷冻干燥36 h，粉碎过40目筛后-20 ℃冻藏。准确称取2.00 g面包冻干粉于250 mL磨口三角瓶中，加20 mL蒸馏水溶解，50 mL石油醚-丙酮溶液（3∶2，V/V），加塞后1 500 r/min磁力搅拌10 min，加30 mL蒸馏水转移至分液漏斗，收集有机相，重复此操作3 次至水层无色。合并有机相，30 ℃条件下真空旋干，用2.5 mL丙酮复溶后过0.45 μm滤膜，用于色谱分析。为避免样品的光氧化降解，所有操作均在昏暗的灯光下进行。

叶黄素酯以全反式叶黄素的含量计算。准确称取1 mg反式叶黄素标准品，用丙酮溶解并定容至50 mL，混匀，制成质量浓度为20 μg/mL的标准液。再分别取0.1、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 mL标准液置于10 mL容量瓶中，用丙酮定容并混匀，制成质量浓度为0.2、1、3、5、7、9、11、13 μg/mL的系列标准液。

色谱条件［15］：色谱柱Agilent PURSUIT C 18（300 mm× 3.9 mm，10 μm）；柱温25 ℃；进样量20 ☒L；流速1.0 mL/min；检测波长450 nm；流动相：30 min内线性梯度洗脱，流动相A：乙腈-甲醇（9∶1，V/V），流动相B：乙酸乙酯（0%～100%）。

准确称取3.00 g面包冻干粉于250 mL磨口三角瓶中，加20 mL蒸馏水1 500 r/min磁力搅拌10 min溶解，50 mL石油醚溶液，160 mL 40 g/100 mL的氢氧化钾-甲醇溶液，60 ℃回流皂化3 h。将皂化液转移至分液漏斗后加30 mL正己烷，38 mL 10 g/100 mL的硫酸钠溶液，混匀后静置待分层后，收集有机相，30 ℃条件下真空旋干，用丙酮定容2.5 mL后过0.45 μm滤膜至样品瓶-20 ℃冻藏备用，用于色谱分析。为避免样品的光氧化降解，所有操作均在昏暗的灯光下进行。

色谱条件［16］：色谱柱YMC Carotenoid C 30（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：450 nm；DAD光谱收集范围：250～600 nm。流动相：甲醇-水（98∶2，V/V），70 min内等梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；进样量：20 ☒L。

按1.3.2节取样后，用色差仪分别测定面包皮和面包芯的L*、a*、b*值。对每种样品取3 次样，取平均值。CIE-L*a*b*表色系中的L*为明度，反应色泽的亮度；a*为Hunter标度中的a轴值，正数代表红色，负数代表绿色；b*为Hunter标度中的b轴值，正数代表黄色，负数代表蓝色。

实验数据结果均采用软件Origin 7.5和SPSS 17.0软件进行方差分析和标准差分析。

2　结果与分析

叶黄素酯是以叶黄素与脂肪酸结合成酯的形式存在。由于叶黄素与脂肪酸的酯化作用不影响光谱特征，叶黄素和叶黄素酯具有同样的光谱特征吸收和光谱形状。实验中叶黄素标准品和面包中叶黄素酯的液相色谱图见图1。通过与叶黄素标准品的保留时间比较，可以确定色谱峰a为游离的叶黄素。在用反相液相色谱分析叶黄素酯的研究中，Scalia等［17］用制备型反相液相色谱分离出5种脂肪酸酯，并采用气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析酯化的反式类胡萝卜素酯，表明万寿菊花中叶黄素二酯都由饱和脂肪酸组成，即为图1中c部分。从图1可以看出，面包中叶黄素酯各主要组分分离较清晰，与相同色谱条件下Tsao等［15］报道的谱图相一致。其中，色谱图b部分为叶黄素单酯，色谱图c部分峰面积较高，按照先后出峰时间它们可能依次为月桂酸-肉豆蔻酸酯、二肉豆蔻酸酯、肉豆蔻酸-棕榈酸酯、二棕榈酸酯、棕榈酸-硬脂酸酯、二硬脂酸酯［18］，对此成分的确定需要用质谱法进一步分析，本实验中叶黄素酯含量以总叶黄素酯含量计。

图1　面包中叶黄素酯的CC 1188-HPLLCC色谱图
Fig. 1 C 18-HPLC chromatogram of lutein esters in bread

本实验叶黄素酯含量采用C 18-HPLC分析方法依据全反式叶黄素标准曲线进行定量分析。按照C 18-HPLC分析方法，以进样量（ng）为横坐标，相应的吸收峰面积为纵坐标，得标准曲线回归方程为y=7.582 8x-36.02（R 2=0.999 6）。结果表明反式叶黄素含量在4～200 ng范围内峰面积和进样量成良好的线性关系。

图2　制作过程对面包叶黄素酯含量的影响
Fig. 2 Effects of bread processing steps on the contents of lutein esters

如图2所示，在面包制作过程中，不同制作工序对叶黄素酯含量的影响程度不同。和面和发酵对叶黄素酯的降解无显著作用（P＞0.05），烘烤引起面包皮和面包芯中叶黄素酯含量的显著下降（P＜0.05）。和面过程中，叶黄素酯含量由46.50 μg/g下降为45.53 μg/g，保留率为97.91%，此过程温度较低（＜20 ℃），说明搅拌作用对叶黄素酯的氧化降解作用影响很小。发酵过程中，叶黄素酯保留率为92.02%，叶黄素酯含量下降不显著，为42.79 μg/g（P＞0.05），有可能是因为在发酵过程中酵母消耗了氧气从而减弱了叶黄素酯的降解［19］。经过烘烤后，面包皮和面包芯中叶黄素酯含量分别为34.57 μg/g和20.07 μg/g，保留率为74.34%和43.16%。烘烤引起面包皮和面包芯中叶黄素酯含量显著下降（P＜0.05），并且面包芯中叶黄素酯含量显著高于面包皮中（P＜0.05）。

在面包制作过程中，面包中叶黄素酯皂化成叶黄素后总叶黄素和全反式叶黄素的含量变化如图3所示，和面、发酵、烘烤后的面包芯和面包皮中总叶黄素保留率依次为97.04%、94.28%、89.92%、73.12%，全反式叶黄素保留率依次为93.20%、84.32%、71.92%和50.40%。和面和发酵过程中，总叶黄素保留率仅下降了2.96%和2.76%，而全反式叶黄素下降了6.80%和8.88%，说明和面和发酵对叶黄素酯的降解影响较小。烘烤后的面包成品中面包皮和面包芯分别与发酵后的面团相比总叶黄素含量下降了21.26%和4.36%，全反式叶黄素含量下降了33.92%和12.40%。

图3　制作过程对面包中总叶黄素和全反式叶黄素含量的影响
Fig. 3 Effects of bread processing steps on the contents of total lutein and trans-lutein

图4　制作过程对面包中叶黄素顺、反异构体含量的影响
Fig. 4 Effects of bread processing steps on the contents of trans- and cis-lutein

叶黄素酯强化面包在制作过程中，叶黄素酯皂化成叶黄素后叶黄素顺、反异构体的生成与含量的变化如图4所示。和面过程中，先生成了0.56 μg/g和0.40 μg/g的13-顺式和13’-顺式叶黄素。发酵过程中，13-顺式和13’-顺式叶黄素含量继续累积，同时新生成了0.32 μg/g和0.29 μg/g的9-顺式和9’-顺式叶黄素。烘烤均引起面包皮和面包芯中13-顺式、13’-顺式、9-顺式和9’-顺式叶黄素含量的显著增加（P＜0.05）。此外，面包芯中各顺式叶黄素异构体含量均显著低于面包皮中（P＜0.05），与叶黄素强化面包烘烤后面包芯和面包皮中的结果刚好相反［20］。有可能是叶黄素酯比叶黄素耐热性更强，叶黄素酯强化面包在烘烤过程中面包皮和面包芯中叶黄素反-顺异构化反应高于各顺式叶黄素的热降解导致各顺式异构体的大量积累；而叶黄素强化面包烘烤过程中面包皮中全反式叶黄素及其顺式异构体的热降解反应高于叶黄素反-顺异构化反应导致，叶黄素各顺式异构体含量相对于叶黄素酯强化面包中显著降低。

图5　面包皮和面包芯中叶黄素酯含量在贮藏过程中的变化
Fig. 5 Contents of lutein esters in bread crust and core during storage

如图5所示，整个贮藏过程中面包芯与面包皮中叶黄素酯含量的变化趋势基本相同，都呈缓慢下降趋势。刚制备面包芯和面包皮中叶黄素酯的含量分别为34.57 μg/g和20.07 μg/g，贮藏7 d后分别为31.62 μg/g和17.67 μg/g，可以看出面包皮和面包芯中叶黄素酯的降解程度不同。Pott等［21］认为类胡萝卜素的物理状态也是引起类胡萝卜素降解的最主要因素。Hidalgo ［22］和Abdel-Aal ［23］等认为类胡萝卜素的降解与产品中叶黄素的含量成正相关。因此，这有可能是面包皮和面包芯中叶黄素的物理状态不同，也有可能是面包皮中叶黄素含量比面包芯中低，导致叶黄素酯的降解程度不同。

图6　叶黄素的CC 3300-HPLLCC色谱图
Fig. 6 C 30-HPLC chromatogram of lutein

图7　面包皮和面包芯中总叶黄素和全反式叶黄素含量在贮藏过程中的变化
Fig. 7 Contents of total lutein and trans-lutein in bread crust and core during storage

本实验按照C 30-HPLC分析方法得到叶黄素的色谱图如图6所示，叶黄素及其异构体含量采用C 30-HPLC分析方法依据全反式叶黄素标准曲线进行定量分析。叶黄素酯强化面包在贮藏过程中面包芯与面包皮中总叶黄素和全反式叶黄素的含量变化如图7所示。贮藏过程中，叶黄素酯强化面包中的总叶黄素和全反式叶黄素随着贮藏时间的增加呈缓慢下降趋势。叶黄素酯强化面包贮藏7 d后面包芯与面包皮中总叶黄素含量19.88 μg/g和16.20 μg/g，全反式叶黄素含量依次为16.32 μg/g和11.48 μg/g。贮藏过程中面包芯与面包皮中总叶黄素含量保留率分别下降了10.32%和8.32%，全反式叶黄素含量保留率分别下降了6.64%和4.48%，贮藏过程中叶黄素降解较慢。

叶黄素酯强化面包在贮藏过程中面包芯与面包皮中叶黄素顺反异构体含量变化分别如图8所示。贮藏过程中，叶黄素酯强化面包中的各顺反异构体含量随着贮藏时间的增加呈缓慢下降趋势。经7 d贮藏后面包芯中13-顺式、13’-顺式、9-顺式、9’-顺式叶黄素含量分别下降了0.22、0.24、0.20、0.26 μg/g，而面包皮中13-顺式、13’-顺式、9-顺式、9’-顺式叶黄素含量经7 d贮藏后分别下降了0.36、0.30、0.22、0.08 μg/g。这主要是因为面包皮和面包芯中叶黄素的物理状态不同导致叶黄素的异构化程度和降解程度不同。

图8　面包芯（A）和面包皮（B）中叶黄素顺、反异构体含量在贮藏过程中的变化
Fig. 8 Contents of trans- and cis-lutein in bread core （A） and crust （B）during storage

叶黄素酯强化面包贮藏过程中色泽的变化如表1所示。贮藏过程中，面包皮的L*值在64.06～64.99之间，面包芯的L*值在75.08～75.45之间。面包皮a*值在15.49～15.87之间，面包芯a*值在9.33～9.82之间，面包皮比面包芯红值大。Hidalgo等［24］研究了热处理对不同品种小麦面粉制成饼干的色泽影响，结果均表明面粉的热损伤与L*成负相关，与a*成正相关。因此面包皮的L*值比面包芯中的小，a*值比面包芯中的大。面包芯b*值在45.20～45.67之间，面包皮的b*值在35.43～36.24之间，面包芯比面包皮黄值高。文献［25］表明，小麦中b*值和叶黄素浓度成正相关，L*值和a*值几乎与叶黄素、（α+β）-胡萝卜素含量没有关系。分析原因是面包芯中叶黄素酯含量比面包皮中高。贮藏1、4、7 d后的面包皮和面包芯中的L*、a*、b*值分别与刚制备出的面包皮和面包芯的L*、a*、b*值相比，均无显著性差异（P＞0.05）。在整个贮藏过程中，面包色泽基本无变化。在整个贮藏期中面包皮和面包芯的L*、a*和b*值无显著性变化（P＞0.05）。

表1　面包贮藏期色泽的变化
Table 1 Color changes of bread during storage

贮藏时间/d面包芯面包皮L*a*b*L*a*b* 075.26±0.09 9.82±0.11 45.20±0.3064.99±0.5015.49±0.8036.13±0.11 175.08±0.35 9.84±0.07 45.25±0.2364.10±0.2815.87±0.0836.23±0.18 475.28±0.11 9.93±0.11 45.75±0.0464.21±0.0715.77±0.1135.53±0.18 775.45±0.06 9.92±0.23 45.67±0.3664.06±0.4115.75±0.1235.43±0.32

3　结论

叶黄素酯主要以叶黄素月桂酸-肉豆蔻酸酯、二肉豆蔻酸酯、肉豆蔻酸-棕榈酸酯、二棕榈酸酯、棕榈酸-硬脂酸酯、二硬脂酸酯的形式存在。采用C 18-HPLC方法检测强化面包制作和贮藏过程叶黄素酯含量的变化，发现和面和发酵对叶黄素酯的降解影响不明显，烘烤引起面包皮和面包芯中叶黄素酯含量显著下降（P＜0.05），贮藏过程中面包皮和面包芯中叶黄素酯含量略有下降。皂化测得的叶黄素含量呈现同样的变化规律。

叶黄素酯强化面包在整个制作和贮藏过程都伴随着叶黄素异构体的生成和含量变化。和面过程中生成了少量的13-顺式和13’-顺式叶黄素，发酵过程新生成了少量的9-顺式和9’-顺式叶黄素，焙烤过程面包皮和面包芯中13-顺式、13’-顺式、9-顺式和9’-顺式叶黄素含量显著增加，贮藏过程中叶黄素顺式异构体含量变化较制作过程变化不明显，但仍略有下降。

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LIU Chunju 1，2， XIE Xiaoye 1，3， LI Dajing 1，2，*， LIU Chunquan 1，2
（1. Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China；2. National Vegetable Processing Technology R&D Sub-centers， Nanjing 210014， China；3. College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：Lutein exists in nature mostly in the form of lutein esters. Fortification of bread with lutein esters can improve dietary lutein intake. To investigate the stability of lutein esters in fortified bread during processing and subsequent storage，lutein and its stereoisomers as well as lutein esters were analyzed during dough processing， fermentation， baking and storage. The results showed that lutein esters were stable， and the retention rates of total lutein and trans-lutein after saponification were higher during dough processing and fermentation process. Baking caused a slight decrease in lutein esters in bread crust and core and a significant decline in the retention rates of total lutein and trans-lutein after saponification. The generation of cis-isomers was found during the whole processing and storage process of fortified bread. A small amount of 13-cis- and 13’-cis-lutein were generated during dough making， and a small number of 9-cis- and 9’-cis-lutein were detected during fermentation. Similarly， baking caused a significant increase in 13-cis-， 13’-cis-， 9-cis- and 9’-cis-lutein. The contents of lutein esters， lutein， trans-lutein and its cis-isomers declined slightly throughout the whole storage period.

Key words：lutein esters； fortified bread； processing； storage； stability

作者简介：刘春菊（1979—），女，助理研究员，硕士，主要从事果蔬加工与质量控制研究。E-mail：cjliu0306@163.com

*通信作者：李大婧（1976—），女，研究员，博士，主要从事果蔬加工与综合利用研究。E-mail：lidajing@163.com

叶黄素酯在强化面包制作和贮藏中的稳定性

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　结论