类植物乳杆菌L-ZS9生物被膜态的黏附能力及形成影响因素

刘 蕾 1,武瑞赟 1,2,李 军 1,李平兰 1,*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100083;2.内蒙古大学生命科学学院,内蒙古 呼和浩特 010021)

摘 要:旨在探究生物被膜态类植物乳杆菌L-ZS9的黏附能力,并确定影响其形成的主要因素。通过体外黏附实验,比较L-ZS9浮游与生物被膜两种状态下的黏附能力。结果表明,被膜态L-ZS9黏附率为浮游态的1.5 倍,且黏附相关基因fbb、ropN和rrf2均上调表达,显示了被膜态的黏附优势。采用结晶紫染色法考察了培养时间、温度、营养物质、蛋白酶、群体感应自诱导信号分子(autoinducer-2,AI-2)对L-ZS9被膜形成的影响。结果显示,L-ZS9于37 ℃培养36 h被膜形成量最多,维持营养物质充足有利于被膜的形成,各营养物质在不同阶段发挥不同作用;低pH值和胆盐会破坏已经形成的生物被膜;胃蛋白酶和胰蛋白酶不仅抑制初始被膜的形成,且可以破坏成熟的被膜;体积分数0.5%的信号分子AI-2对被膜形成的促进作用最强,并可缓解胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用。

关键词:类植物乳杆菌L-ZS9;黏附;生物被膜;影响因素;信号分子AI-2

刘蕾, 武瑞赟, 李军, 等. 类植物乳杆菌L-ZS9生物被膜态的黏附能力及形成影响因素[J]. 食品科学, 2016, 37(15): 136-143.

LIU Lei, WU Ruiyun, LI Jun, et al. Adhesion ability of Lactobacillus paraplantarum L-ZS9 and influencing factors of its biofilm formation[J]. Food Science, 2016, 37(15): 136-143. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615023. http://www.spkx.net.cn

随着人们生活水平不断提高,许多严重的健康问题开始涌现,如心脏病、高血压、肠道紊乱和各种癌症。近年来的研究发现避免或消除这些疾病的一个新方法就是摄入益生菌 [1]。根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)对益生菌的定义,益生菌是一类活性微生物,达到足够数量时可以对宿主产生有利的作用。目前研究表明益生菌具有抵抗胃肠道感染,改善乳糖代谢,降低胆固醇,调节免疫系统,缓解腹泻,改善骨质疏松等诸多益生功效 [2-4]。然而,益生菌发挥益生功效的一个重要前提是需黏附定殖于胃肠道中,且黏附是定殖的先决条件。因此,研究如何增强益生菌的黏附能力具有重要意义。

研究发现,除了海洋中的细菌,大多数细菌都存在于生物或非生物表面,而非流体悬浮液环境 [5]。细菌在生物或非生物表面,常常会形成生物被膜,以多细菌组成的群体形态生存。胃肠道中的微生物若要存活,也需要附着在胃肠道黏膜表面。研究表明细菌在生物被膜态比其浮游状态时具有更强的抵抗不良环境因素的能力 [6-7],而且生物被膜的形成能力和黏附能力之间存在着紧密关系。但是关于益生菌被膜态与浮游态黏附能力的比较研究还非常缺乏。生物被膜虽然具有更强的抵抗能力,但是其形成也受到许多因素的影响 [8]。目前大多数研究集中在如何清除有害微生物的生物被膜,而对如何增强有益微生物生物被膜的研究还很匮乏。

本研究选择一株类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)L-ZS9为研究对象,该菌可产生多种细菌素,可有效抑制肠杆菌科微生物的生长 [9-10],具有开发成优良益生菌制剂或食品益生菌添加剂的潜力。本实验通过比较L. paraplantarum L-ZS9生物被膜及浮游态细胞的黏附能力及相关基因的转录水平,确定生物被膜态细菌的优势;对生物被膜形成影响因素进行测定,且检测了群体感应系统通用信号分子自诱导物(autoinducer-2,AI-2)对生物被膜的影响,为进一步研究增强益生菌黏附及生物被膜形成能力从而开发效果更好的益生菌功能食品提供新思路和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与细胞

类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)L-ZS9分离自比利时发酵肉Saucisson Sec Pur,现保藏于中国工业微生物菌种保藏中心(CICC 6262)和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC 11669)。该菌株的全基因组序列已递交,GenBank登录号为CP013130 [11]

HT-29细胞,即人结肠癌细胞,购自中国医学科学院基础医学研究所。

1.1.2 试剂

商品化AI-2(3.78 mmol/L,分装于细胞冻存管中置于-80 ℃待用) 美国OMM公司;反转录试剂盒TUREscript 1 stStrand cDNA Synthesis Kit和TRIpure北京艾德莱生物科技有限公司;DNase I(RNase-free)及RNase抑制剂 美国Thermo公司;SYBGreen 美国ABI公司;胃蛋白酶和胰蛋白酶 美国Sigma公司。

1.1.3 培养基

MRS培养基:蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、柠檬酸二铵2 g/L、葡萄糖20 g/L、MgSO 4·7H 2O 0.58 g/L、肉浸膏10 g/L、K 2HPO 42 g/L、乙酸钠5 g/L、吐温-80 1 mL/L、MnSO 4·4H 2O 0.25 g/L。

细胞培养基:DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培养基,含青霉素100 U/mL,链霉素100 U/mL和体积分数10%胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 浮游态和生物被膜态细菌制备

将活化的L. paraplantarum L-ZS9接种于MRS液体培养基中,37 ℃、200 r/min振荡培养36 h后,5 000 r/min离心10 min收集菌体,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤3 次,之后PBS重悬菌体至终浓度1×10 8CFU/mL,此为浮游态细菌。将活化的L. paraplantarum L-ZS9接种于MRS液体培养基中,置于6 孔细胞培养板,37 ℃静置培养36 h,之后重悬菌体并收集于1.5 mL离心管中,5 000 r/min离心10 min收集菌体,PBS洗涤菌体,并重悬至终浓度1×10 8CFU/mL,此为生物被膜态细菌。

1.2.2 浮游态和生物被膜态细胞对HT-29细胞黏附率的测定

将HT-29细胞接种于24 孔细胞培养板中,待其长满单层后(每孔约含2.5×10 5个细胞),每孔接种100 μL上述收集的浮游态及生物被膜态细菌悬液,轻微晃匀后置于37 ℃培养1.5 h,弃培养液,PBS洗涤5 次,加100 μL的0.1 g/100 mL胰酶-0.02 g/100 mL乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)室温处理10 min,消化细胞,再加900 μL DMEM,并用巴氏吸管吹打,取100 μL混合液进行10 倍稀释,各稀释度取100 μL接种于MRS平板,37 ℃培养,记录菌落数,计算黏附率。实验每组设3 个平行,且进行3 次重复。

1.2.3 浮游态和生物被膜态细胞黏附相关基因转录水平的测定

按上述方法收集浮游态和生物被膜态细菌,按照北京艾德莱生物科技有限公司的TRIpure提取总RNA步骤分别提取两者总RNA。cDNA的合成参照该公司TUREscript 1 stStrand cDNA Synthesis Kit说明书进行,方法如下:Total RNA 50~5 000 ng,Random Primer 1 μL,5×RT Reaction Mix 4 μL,TUREscript H -RTase 1 μL,之后用RNase free H 2O 定容至20 μL。25 ℃孵育10 min,42 ℃孵育30~50 min,65 ℃加热15 min失活TUREscript H -RTase。合成的cDNA经DNase I处理后置于-80 ℃待用。

参照L. paraplantarum L-ZS9全基因组序列,选取与黏附相关的基因fbb、ropN和rrf2,以16S rDNA为内参基因,运用Primer 3 Input(version0.4.0)设计引物,用于进行荧光定量聚合酶链式反应(real time-quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR),引物序列见表1。

表1 引物设计
Table 1 Primers used in this study

引物序列(5’→3’)fbb-FCATGCCATGGTCACCGAATT fbb-RATCATCGCAAAGTTCGTCGG ropN-FGCTGATTTCATTGAGCGGGT ropN-RAATAGTTCAATGGGCGTCGC rrf2-FCATTACTGATGTGGTCGCGG rrf2-RCATAATTGATCGGCTCGCGA 16S rDNA-FCAACGAGCGCAACCCTTATT 16S rDNA-RGCAGCCTACAATCCGAACTG

qRT-PCR的反应体系(20 μL)如下:1 μL cDNA,10 μL 2×SYBGreen,上游引物和下游引物各1 μL(10 μmol/L),加7 μL无RNase水。反应体系如下:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40 个循环。数据分析采用Livak法 [12]测定。

1.2.4 培养时间和温度对生物被膜的影响

将L. paraplantarum L-ZS9接种于MRS培养基中,置于96 孔细胞培养板中,37 ℃静置培养12、24、36、48、72 h和1 周,MRS空白培养基作为对照。培养结束后,采用结晶紫染色法检测OD 595 nm值,分析培养时间对生物被膜形成的影响。

将菌种接种于MRS培养基中,于25、37 ℃和42 ℃静置培养,每隔3 h检测OD 600 nm值,绘制生长曲线,检测不同培养温度对L-ZS9生长速率的影响。之后,将实验用菌种接种于MRS培养基置于96 孔细胞培养板中,于25、37 ℃和42 ℃静置培养36 h,培养结束后采用结晶紫染色法进行测定,检测培养温度对生物被膜形成的影响。

1.2.5 营养物质对生物被膜的影响

将L. paraplantarum L-ZS9接种于MRS培养基中,置于96 孔细胞培养板中,37 ℃静置培养36、48、72 h和1 周,每24 h添加新鲜的MRS培养基。培养结束后采用结晶紫染色法对生物被膜进行测定,检测营养物质充足时生物被膜的形成情况。

将L. paraplantarum L-ZS9分别接种于不含葡萄糖、MnSO 4、MgSO 4、乙酸钠、K 2HPO 4、吐温-80的MRS培养基中,置于96 孔细胞培养板,37 ℃静置培养48 h,在培养24、36、48 h检测MRS培养基中不同物质对L-ZS9生物被膜形成的影响。此外,将MRS中的葡萄糖以乳糖、半乳糖和蔗糖替代,对L-ZS9进行培养,37 ℃静置培养48 h,分别检测不同碳源对生物被膜形成的影响。

1.2.6 pH值、胆盐和渗透压对生物被膜的影响

将L. paraplantarum L-ZS9接种于MRS中,37 ℃静置培养36 h,使其形成成熟的生物被膜,吸出培养上清液,分别添加pH 2.0、3.0、4.0、5.0,含有0.1、0.2 g/100 mL胆盐以及0.3 mol/L NaCl的MRS,培养12 h后采用结晶紫染色法检测pH值、胆盐及渗透压对成熟生物被膜的影响。

1.2.7 胃蛋白酶和胰蛋白酶对生物被膜的影响

将L. paraplantarum L-ZS9分别接种于含有2 g/100 mL胃蛋白酶和胰蛋白酶的MRS培养基中,每隔3 h测定OD 600 nm值,绘制生长曲线,检测胃蛋白酶和胰蛋白酶对L-ZS9生长的影响。将接种的菌液置于96 孔细胞培养板,37 ℃静置培养12、24、36 h和48 h,检测胃蛋白酶和胰蛋白酶对生物被膜形成的影响。将L-ZS9接种于MRS中,37 ℃静置培养36 h,使其形成成熟的生物被膜,之后分别添加2 g/100 mL的胃蛋白酶和胰蛋白酶,培养12 h后检测胃蛋白酶和胰蛋白酶对成熟生物被膜的影响。

1.2.8 群体感应信号分子AI-2对生物被膜的影响

将L. paraplantarum L-ZS9接种于含有商品化AI-2(0%、0.1%、0.5%、1%、5%)的MRS培养基中,置于96 孔细胞培养板,37 ℃静置培养36 h。培养结束后检测生物被膜,分析AI-2对L-ZS9生物被膜形成的影响。

将L. paraplantarum L-ZS9分别接种于含有0.5% AI-2和2 g/100 mL胃蛋白酶,含有0.5% AI-2和2 g/100 mL胰蛋白酶,仅含有2 g/100 mL胃蛋白酶,仅含有2 g/100 mL胰蛋白酶的MRS培养基中,置于96 孔细胞培养板中,37 ℃静置培养36 h后测定生物被膜。

将L. paraplantarum L-ZS9接种于MRS中,37 ℃静置培养36 h,使其形成成熟的生物被膜,之后分别添加2 g/100 mL胃蛋白酶,2 g/100 mL胰蛋白酶,0.5% AI-2及2 g/100 mL胃蛋白酶,0.5% AI-2及2 g/100 mL胰蛋白酶,培养12 h后检测生物被膜形成量。

1.3 数据分析

所有测试重复进行平行实验3 次,用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析及作图。

2 结果与分析

2.1 浮游态和生物被膜态细胞黏附性能比较

2.1.1 浮游态和生物被膜态细胞对HT-29黏附率的比较将浮游态及生物被膜态L-ZS9对HT-29细胞进行黏附,结果如图1所示,被膜态细菌对HT-29的黏附率为浮游态细菌的1.5 倍,这表明生物被膜态细菌的黏附性能更强。对于益生菌,能够黏附到肠黏膜表面是其发挥益生作用的重要前提之一,只有能够进行黏附才有可能定殖在胃肠道中。关于益生菌生物被膜的相关研究还较少,如Cheow等 [13]于2013年报道称高密度生物被膜状态的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)比其浮游状态时具有更好的耐热性及耐冷冻干燥的能力。但是关于被膜态益生菌的黏附性能的研究还未见报道,因此,以上数据表明被膜态的L. paraplantarum L-ZS9具有更好的黏附性能,提示制备被膜态益生菌制剂及促进益生菌在肠道中形成生物被膜有利于益生菌更好地定殖于胃肠道中,从而发挥其益生功效。此外,多数细菌在自然环境中之所以选择以生物被膜状态生存,主要是由于无论单菌种生物被膜,还是多菌种复杂生物被膜均具有浮游状态时不可比拟的优势,且被膜态的细菌可启动一系列基因的表达来协调其群体性行为 [14]

图1 浮游态及生物被膜态L-ZS9黏附能力
Fig. 1 Adhesion abilities of planktonic and biofilm cells of L-ZS9

2.1.2 浮游态和生物被膜态细胞黏附相关基因转录水平的比较

图2 浮游态及生物被膜态L-ZS9相关基因转录水平差异比较
Fig. 2 Related genes transcription levels in planktonic and biofilm cells of L-ZS9

由2.1.1节可知L-ZS9被膜态细胞的黏附能力高于浮游态细胞,本研究通过qRT-PCR检测了浮游态和被膜态L-ZS9黏附相关基因(fbb、ropN和rrf2)的转录水平。fbb为纤黏蛋白编码基因,参与细胞的黏附作用。ropN和rrf2基因与细菌的运动性相关,从而间接影响细菌的黏附性。图2显示,生物被膜态细胞的fbb、ropN和rrf2的转录水平显著高于浮游态细胞,其中fbb和ropN转录水平上调大于1.5 倍,而rrf2的转录水平则超过2 倍。以上结果表明浮游态与被膜态细胞在转录水平上也存在差异,被膜态细胞fbb基因上调表达,促进黏附作用;ropN和rrf2也上调表达,运动性增强,可能以此来抵抗外界流体的冲刷作用,增强与肠黏膜的作用,从而促进其黏附。

2.2 培养时间和培养温度对生物被膜形成的影响

2.2.1 培养时间对生物被膜形成的影响

图3 培养时间(A)及培养温度(B)对L-ZS9生长、产酸(CC)及生物被膜(DD)的影响
Fig. 3 Effects of cultivation time (A) and temperature on the growth (B),pH (C) and biofilm formation (D) of L-ZS9

基于2.1节中生物被膜态细胞在黏附性方面所具有的优越性,本研究对L-ZS9生物被膜形成的各项因素进行了检测,以明确该菌株生物被膜形成的促进因素和抑制因素。图3A显示,L-ZS9在36 h形成生物被膜的量最多,在36 h之前,生物被膜生成量逐渐增多,36 h之后生成量开始下降,这可能是由于周围环境营养物质的消耗,导致生物被膜的逐渐脱落。与本研究结果类似,对于L. monocytogenes而言,当细菌生长至平台期后期时生物被膜形成量也最多 [15]

2.2.2 培养温度对生物被膜形成的影响

不同培养温度下L-ZS9的生长曲线及pH值曲线表明,42 ℃时该菌株不能生长,37 ℃时生长最快,但是当培养36 h时,25 ℃和37 ℃的OD 600 nm值及pH值达到一致(图3B和3C)。图3D显示,在25 ℃和37 ℃培养36 h后,菌株生物被膜的生成量没有差异,表明由培养温度引起的生长速率差异对生物被膜生成量没有影响。但是,培养温度引起的生长速率差异对生物被膜内部结构的影响还需进一步深入研究。

2.3 营养物质对生物被膜形成的影响

2.3.1 营养物质充足对生物被膜形成的影响

由2.2.1节可知,在营养物质一定时,L-ZS9在36 h时形成的生物被膜量最多。本实验进一步研究了当营养物质充足时L-ZS9生物被膜的形成情况。本实验每隔24 h添加新的MRS培养基,图4表明培养36 h和48 h时,是否添加新的培养基对生物被膜形成量没有影响,这可能是由于此时剩余的营养条件仍相对充足;培养72 h和168 h(1 周)时,添加新鲜培养基的处理组生物被膜生成量显著高于不添加培养基的对照组,这是由于营养条件的充足使得生物被膜的脱落减缓。对于生长在不同基质表面的菌体,营养物质充足程度对其生物被膜形成的影响不同,这取决于不同营养条件时微生物以生物被膜形态存在是否有利于群体生存 [16]。本研究结果表明,当类植物乳杆菌L-ZS9附着在非生物基质表面时,及时补充营养物质以维持营养充足有利于生物被膜的形成。

图4 添加新鲜培养基对L-ZS9生物被膜的影响
Fig. 4 Effect of fresh medium on biofilm formation of L-ZS9

2.3.2 不同营养物质及碳源对生物被膜形成的影响

为了进一步了解不同营养物质对L-ZS9生物被膜形成的影响,本实验按照1.2.5节中的方法对其进行了测定。图5A和5B显示,碳源显著影响L-ZS9的生长:无碳源时L-ZS9无法生长,碳源为葡萄糖或蔗糖时,L-ZS9生长良好,且生长速率无显著差异,碳源为乳糖和半乳糖时,L-ZS9的生长速率减慢;其余物质对L-ZS9的生长没有显著影响。生物被膜检测结果如图5C、D、E所示,培养24 h时,缺乏MgSO 4、乙酸钠、吐温-80可以促进生物被膜的形成,缺乏MnSO 4降低生物被膜的形成(图5C);培养36 h时,缺乏MgSO 4、乙酸钠、吐温-80对生物被膜形成没有显著影响,缺乏MnSO 4降低生物被膜的形成(图5D);培养48 h时,缺乏MgSO 4、乙酸钠、吐温-80、MnSO 4对生物被膜的形成没有显著影响(图5E);缺乏K 2HPO 4在以上培养时间时对生物被膜形成皆没有显著影响。值得注意的是,在培养24 h时,蔗糖为碳源可以显著促进生物被膜的形成,这说明蔗糖在L-ZS9生物被膜形成早期具有促进作用。以上结果表明,不同的营养物质在不同的培养时间及生物被膜形成发展阶段发挥着不同的作用。

图5 不同营养物质对L-ZS9生长(A)、产酸(B)及在不同时间(C~E)对生物被膜的影响
Fig. 5 Effect of nutrition on the growth (A), pH (B) and biofilm formation at 24, 36 and 48 h (C, D and E) of L-ZS9

2.4 胃肠道环境对生物被膜的影响

2.4.1 pH值、胆盐及渗透压对成熟生物被膜的影响

胃肠道环境中的胃酸、胆盐及渗透压会对其中的微生物产生拮抗作用,其中低pH值及胆盐会抑制L-ZS9的生长,因此本研究着重考察了胃肠道环境因素对L-ZS9成熟生物被膜的影响。研究结果如图6所示,成熟的L-ZS9生物被膜在pH 2.0~5.0时会被显著破坏,同时0.1 g/100 mL和0.2 g/100 mL的胆盐也会破坏成熟的生物被膜,而0.3 mol/L NaCl对成熟生物被膜没有影响。该结果表明,胃肠道中的胃酸和胆盐会破坏已经形成的L-ZS9生物被膜,从而对其黏附定殖产生不利作用。

图6 pH值、胆盐及渗透压对L-ZS9成熟生物被膜的影响
Fig. 6 Effect of pH, bile salt and osmotic pressure on the formed biofilm of L-ZS9

2.4.2 胃蛋白酶和胰蛋白酶对初始生物被膜及成熟生物被膜的影响

由于胃肠道中存在着胃蛋白酶和胰蛋白酶,因此检测二者对L-ZS9生物被膜的影响具有意义。图7A、B显示,胃蛋白酶和胰蛋白酶对L-ZS9的生长及产酸没有影响。图7C显示不同培养时间胃蛋白酶和胰蛋白酶对初始生物被膜形成的影响,结果表明在培养12、24、36 h和48 h时,胃蛋白酶和胰蛋白酶会显著抑制初始生物被膜的形成。图7D显示胃蛋白酶和胰蛋白酶对成熟生物被膜的影响,结果表明胃蛋白酶和胰蛋白酶会显著破坏成熟的生物被膜。以上结果说明,胃肠道中的胃蛋白酶和胰蛋白酶不仅会抑制L-ZS9在黏膜表面形成生物被膜,而且会破坏已经成熟的生物被膜。本研究结果与已有研究结果类似,Lebeer等 [17]曾对Lactobacillus rhamnosus的生物被膜形成能力与影响因素做了相关研究,发现被膜的形成受到培养基及胃肠道环境等多种因素的影响。

图7 胃蛋白酶和胰蛋白酶对L-ZS9生长(A)、产酸(B)、初始生物被膜形成(C)及成熟生物被膜(DD)的影响
Fig. 7 Effect of pepsin and trypsin on the growth (A), pH (B), biofilm formation (C) and formed biofilm (D) of L-ZS9

2.5 群体感应信号分子AI-2对生物被膜的影响

2.5.1 AI-2对生物被膜形成的影响

生物被膜作为细菌群体存在的形态,受到群体感应系统的调控 [18]。其中AI-2是介导LuxS/AI-2 QS系统的通用信号分子,参与调控多种细菌的生物被膜形成,因此,本研究检测了AI-2对L-ZS9生物被膜形成的影响。图8A、B表明,外源的AI-2对L-ZS9的生长和产酸没有影响。图8C表明,外源添加的AI-2对L-ZS9生物被膜的影响具有浓度依赖性,0.5% AI-2对生物被膜的促进作用最为显著。外源添加信号分子AI-2可促进绿脓杆菌PAO1 [19]、幽门螺杆菌 [20]、表皮葡萄球菌RP62A [21]等菌株的生物被膜形成;低体积分数AI-2可促进猪链球菌生物被膜的形成,而高体积分数AI-2则抑制猪链球菌生物被膜的形成 [22];外源添加AI-2可减弱金黄色酿脓葡萄球菌生物被膜的形成 [23]。也有研究发现血链球菌的生物被膜形成与AI-2没有关系 [24]。 而本研究表明,对于L. paraplantarum L-ZS9,一定体积分数范围的AI-2对其生物被膜的形成具有促进作用。

图8 信号分子AI-2对L-ZS9生长(A)、产酸(BB)及生物被膜形成(CC)的影响
Fig. 8 Effect of AI-2 on the growth (A), pH (B) and biofilm formation (C)of L-ZS9

2.5.2 AI-2影响胃蛋白酶和胰蛋白酶对生物被膜的作用

由2.4.2节可知,胃蛋白酶及胰蛋白酶对L-ZS9的生物被膜具有抑制和破坏作用,由2.5.1节可知,0.5%的AI-2对其生物被膜具有促进作用,因此本实验就AI-2与胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用对生物被膜的影响进行了检测。所得结果如图9所示,图9A显示添加AI-2可以缓解胃蛋白酶、胰蛋白酶及二者共存对L-ZS9初始生物被膜形成的抑制作用,图9B显示AI-2还可以缓解胃蛋白酶、胰蛋白酶及二者共存对成熟生物被膜的破坏作用。由以上结果推测,胃肠道中AI-2的存在可以增强L-ZS9在黏膜表面形成生物被膜的能力。近年来有报道 [25]称AI-2可以改善抗生素诱导的肠道生态失衡,AI-2水平升高可以增加厚壁菌(Firmicutes)和拟杆菌(Bacteriodetes)的数量,且AI-2可以促进双歧杆菌(Bifidobacteria)的生物被膜形成和对宿主的定殖。结合本研究结果,通过提升胃肠道中AI-2水平,有利于益生菌在黏膜表面生物被膜的形成及对宿主的黏附。

图9 信号分子AI-2削弱胃蛋白酶和胰蛋白酶对L-ZS9初始生物被膜形成的抑制(A)及对成熟生物被膜的破坏(B)B
Fig. 9 AI-2 relieves the inhibition (A) and destruction (B) of biofilm formation of L-ZS9 by pepsin and trypsin

3 结 论

L. paraplantarum L-ZS9生物被膜状态比浮游状态时对HT-29的黏附能力更高,前者为后者的1.5倍;此外,生物被膜态菌体的fbb、ropN和rrf2的转录水平显著高于浮游态菌体,其中fbb和ropN转录水平上调大于1.5 倍,而rrf2的转录水平则超过2 倍。L. paraplantarum L-ZS9在37 ℃静置培养36 h时,生物被膜形成量最多;此外,及时补充营养物质有利于其生物被膜的形成,而不同营养物质在不同时间及生物被膜形成不同阶段发挥不同作用。胃肠道中的低pH值及胆盐会破坏已经成熟的生物被膜;胃蛋白酶和胰蛋白酶不仅会抑制L. paraplantarum L-ZS9初始生物被膜的形成,而且会破坏已经形成的生物被膜。外源添加群体感应信号分子AI-2对L. paraplantarum L-ZS9生物被膜的形成具有影响,且该影响具有浓度依赖性,0.5%的AI-2对L. paraplantarum L-ZS9生物被膜的促进作用最强。添加0.5%的外源AI-2不仅可以缓解胃蛋白酶和胰蛋白酶对初始生物被膜的抑制作用,而且可以缓解二者对成熟生物被膜的破坏作用。

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Adhesion Ability of Lactobacillus paraplantarum L-ZS9 and Influencing Factors of Its Biofilm Formation

LIU Lei 1, WU Ruiyun 1,2, LI Jun 1, LI Pinglan 1,*
(1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

Abstract:Adhesion of probiotics to the gastrointestinal tract is prerequisite for its beneficial function. This study aims to investigate the adhesion ability of biofilm-like cells of Lactobacillus paraplantarum L-ZS9 and determine factors influencing the biofilm formation of this strain. The adhesion ability to HT-29 of biofilm cells of L-ZS9 was compared with its planktonic cells. In addition, the effects of culture time, temperature, nutrition, low pH, high bile salt, proteases and quorum sensing signal (autoinducer-2, AI-2) on biofilm formation were investigated by crystal violet staining method. The results showed that the adhesion ratio of biofilm cells of L-ZS9 to HT-29 was 1.5 times higher than that of its planktonic cells. The genes fbb, ropN and rrf2 were up-regulated in biofilm cells. The strain produced the largest number of biofilm cells when cultured at 37 ℃for 36 h. Sufficient nutrition promoted biofilm formation. Low pH and high bile salt destroyed the formed biofilm. Pepsin and trypsin inhibited biofilm formation and destroyed the formed biofilm as well. AI-2 (0.5%, V/V) had the strongest beneficial effect on biofilm formation and weakened the inhibition and destruction of pepsin and trypsin. This work can lay a foundation for producing functional foods containing biofilm probiotics with better adhesion to the gastrointestinal tract.

Key words:Lactobacillus paraplantarum L-ZS9; adhesion; biofilm; influencing factors; signal AI-2

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615023

中图分类号:Q939.99

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)15-0136-08引文格式:

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615023. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-03-23

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31271827;31471707);国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA100805-0-1)

作者简介:刘蕾(1988—),女,博士研究生,研究方向为食品微生物。E-mail:liulei0606@gmail.com

*通信作者:李平兰(1964—),女,教授,博士,研究方向为食品微生物。E-mail:lipinglan@cau.edu.cn