家蚕1-脱氧野尻霉素含量与体内糖苷酶活性的相关性

陈红霞 1，2，刘月琴 2，潘 刚 3，赵 明 2，欧阳臻 1，2，*

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江苏大学药学院，江苏 镇江 212013；3.中国农业科学院蚕业研究所，江苏 镇江 212018）

摘 要：为研究家蚕富集1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）的机制，本实验分析了不同品种家蚕体内DNJ含量并研究其与蚕体内糖苷酶的关系。选择了25 个不同的家蚕品种，用相同条件的桑叶饲喂不同品种的家蚕，采用柱前衍生高效液相色谱法分析不同品种蚕体DNJ含量并研究其与体内蔗糖酶、乳糖酶及淀粉酶3 种糖苷酶活性之间的相关性。结果表明：不同品种家蚕体内DNJ含量差异显著，DNJ含量最高种是最低种的7 倍，蚕体DNJ含量与体内的蔗糖酶、乳糖酶等二糖酶活力成显著负相关，与淀粉酶的活力相关性相对较弱。

关键词：家蚕；1-脱氧野尻霉素；糖苷酶；相关性

陈红霞， 刘月琴， 潘刚， 等. 家蚕1-脱氧野尻霉素含量与体内糖苷酶活性的相关性［J］. 食品科学， 2016， 37（15）: 156-159.

CHEN Hongxia， LIU Yueqin， PAN Gang， et al. Correlation between 1-deoxynojirimycin content and glucosidase activities in silkworm （Bombyx mori L.）［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 156-159. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615026. http://www.spkx.net.cn

在中国，桑、蚕自古以来就是药食两用的材料，用以预防和治疗糖尿病。1997年，韩国学者Ryu等 ［1］首次报道了用家蚕（Bombyx mori L.）5 龄幼虫制成的全蚕粉治疗糖尿病，引起了广泛关注和研究 ［2-6］。现代药理学研究进一步证明，桑、蚕中以1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）为主的多羟基生物碱类成分 ［7-8］，可抑制餐后血糖升高，具有预防和治疗糖尿病的作用 ［9-10］。目前用桑叶或蚕粉制作的降血糖产品，在韩国、日本、中国等东南亚国家深受糖尿病患者的欢迎。

天然DNJ由Yoshiaki等 ［11］于1976年首次从桑树中分离获得，且研究发现桑树中的DNJ含量远高于其他植物（如鸭跖草、风信子等）或微生物 ［12-14］。家蚕以桑叶为食，在食桑阶段蚕体对DNJ有奇妙的富集作用 ［15］。本课题组前期研究的结果证明：家蚕在幼虫期，除不吃桑叶的蚁蚕和熟蚕外，其他任一时期蚕体中DNJ含量均大大高于桑叶中的DNJ含量 ［16］，且用不含桑叶的人工饲料饲养家蚕，蚕体检测不到DNJ，这些结果充分说明蚕体DNJ来源于桑叶，且蚕体具有高效富集DNJ的功能 ［17］。由此，利用家蚕这个天然的生物反应器获取天然来源的DNJ，将是非常便捷有效的新途径。

DNJ是强效的α-葡萄糖苷酶抑制剂 ［18］，能够竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，阻碍二糖同酶的结合，致使二糖无法降解吸收，从而降低血糖，因此DNJ在治疗糖尿病方面具有独特作用。然而家蚕富集DNJ的机理及其与体内糖苷酶的关系尚无明确报道 ［19-21］。本课题组在前期研究的基础上，选择25 个不同的家蚕品种，在相同条件下饲喂至5 龄第3天，比较不同品种蚕体中DNJ含量和3 种主要的糖苷酶（蔗糖酶、乳糖酶和淀粉酶）的活性，分析其相关性，旨在揭示家蚕体内DNJ与糖苷酶活性的关系，为进一步寻找家蚕高效富集DNJ的相关酶，阐明家蚕富集DNJ的分子机理奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

7021、2042、菁松、白玉、秋丰等25 个家蚕品种（表1）均由中国农业科学院蚕业研究所（镇江）提供。

乙腈（色谱纯） 江苏汉邦科技有限公司；芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl） 美国Sigma公司；甘氨酸 华美生物工程有限公司；DNJ对照品（纯度＞98%） 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2　仪器与设备

HHS-1恒温水浴锅 上海浦东跃欣科学仪器厂；LC1500高效液相色谱系统 日本分光公司；N2000色谱工作站 浙江大学智能信息工程研究所；LC 2000液相色谱仪 美国安捷伦公司；UV-2102PCS型紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）分析仪器有限公司。

1.3　方法

1.3.1　家蚕饲养及蚕体酶液制备

所有品种的家蚕在相同蚕室条件下（（25±1） ℃，相对湿度（80±2）%，12 h白昼交替），以相同的新鲜桑叶喂食至5 龄第3天，收集蚕体，饥饿24 h后分为两部分：一部分蚕体冷冻、干燥、粉碎，过80 目筛后，-70 ℃冷冻保存，备用；另一部分（每品种各取2 头家蚕，称质量）于冰浴中迅速解剖，去表皮，加预冷的pH 6.0磷酸盐缓冲液冰浴中匀浆蚕体剩余组织，匀浆液在4 ℃、16 099×g离心10 min，取上清液作为酶液，迅速测定酶的活性。

1.3.2　蚕体DNJ含量测定 ［22-24］

1.3.2.1　色谱条件

色谱柱：HiQSiL C 18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）及ODS3预柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%醋酸（55∶45，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长254 nm，发射波长322 nm；进样量10 μL。

1.3.2.2　样品处理及蚕体DNJ含量计算

准确称取1.3.1节制备的蚕体冻干粉末0.1 g于15 mL的离心管，加入10 mL 0.05 mol/L的盐酸溶液超声提取2 次，合并2 次提取液于50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至50 mL，取10 μL于1.5 mL的离心管中（另取10 μL 76 μg/mL的DNJ标准溶液同步衍生化处理），加10 μL pH 8.5硼酸盐缓冲液，再加入5 mmol/L FMOC-Cl-乙腈溶液20 μL，混匀后于20 ℃水浴反应20 min，加入0.1 mol/L的甘氨酸10 μL，让剩余的衍生化试剂反应，最后加入950 μL体积分数0.1%的醋酸水溶液，过滤后，取10 μL注入高效液相色谱柱进行分析。

1.3.3　蚕体糖苷酶活性的测定

分别量取0.2 mL质量分数2%底物（淀粉、蔗糖和乳糖）的水溶液，将0.8 mL的0.2 mol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液和80 μL蚕体酶液混匀，室温下反应10 min后，置于37 ℃水浴60 min，加1.0 mL 3，5-二硝基水杨酸终止反应，然后沸水浴5 min，于540 nm波长处测光密度（OD）值。无酶反应体系用80 μL 0.2 mol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液代替酶液，作为对照。OD值越高，表明酶活性越强。

2　结果与分析

2.1　不同品种蚕体DNJ的含量及3 种糖苷酶的活性

25 个家蚕品种蚕体DNJ含量（从高到低排序）及3 种糖苷酶活性结果见表1和图1。由表1可知，各品种蚕体DNJ含量（占蚕体干质量，下同）在0.08%～0.56%之间，不同品种蚕体DNJ含量有 明显差异，最高品种（2042）DNJ含量是最低品种（‘洞庭×碧波’）DNJ含量的7.0 倍；由图1可知，随家蚕品种所含DNJ含量的逐渐降低，各品种蚕体内3 种糖苷酶（淀粉酶、蔗糖酶和乳糖酶）的活性均呈逐渐上升的趋势，即蚕体DNJ含量与3 种糖苷酶的活性成负相关。

表1　25 个家蚕品种编号及蚕体DNJ含量
Table 1 DNJ contents of 25 strains of silkworms

品种编号品种名称DNJ含量/%品种编号品种名称DNJ含量/% 120420.56±0.02 14P500.23±0.02 270210.38±0.0215菁松×皓月0.23±0.02 370200.37±0.0216秋丰0.21±0.01 4菁松0.37±0.0117秋丰×白玉0.20±0.02 520500.35±0.0218白玉×秋丰0.18±0.02 6皓月0.35±0.0119皓月A×B0.17±0.01 7碧×波0.33±0.0120 野三元日×中0.14±0.01 8丰l0.30±0.0221洞×庭0.12±0.02 9150.28±0.0122野三元中×日0.10±0.02 10白玉0.27±0.0223碧波×洞庭0.10±0.02 1170100.27±0.0124日系784×84 0.09±0.02 1254A0.26±0.0125洞庭×碧波0.08±0.01 13皓月×菁松0.24±0.02

图1　25 个家蚕品种蚕体DNJ含量及3 种糖苷酶的酶活性
Fig. 1 DNJ contents and the activities of 3 glucosidases in 25 strains of silkworms

2.2　DNJ含量与糖苷酶活性的相关性分析

进一步分析蚕体DNJ含量与糖苷酶活性的相关性（表2），结果发现DNJ含量与3 种糖苷酶的活性不仅成负相关，其中与二糖酶即蔗糖酶和乳糖酶的相关性极强，相关系数均大于0.9，与淀粉酶的相关性相对较弱。

表2　蚕体DNJ含量与糖苷酶活性的相关性
Table 2 Correlation between DNJ content and the activities of glucosidases in silkworms

注：*. 在0.01水平（双侧）上显著相关；**. 在0.001水平（双侧）上极显著相关。

糖苷酶 DNJ含量蔗糖酶活性相关性方程y = -0.275 5x+0.148 5，r= -0.907**显著性（双侧）P=0.000 2乳糖酶活性相关性方程y = -0.262 7x+0.149，r= -0.922**显著性（双侧）P=0.000 2淀粉酶活性相关性方程y= -0.551 1 x+0.623 8，r= -0.846**显著性（双侧）P=0.000 3

3　讨 论

桑叶中含有以DNJ为主的多羟基生物碱，该类物质是一种强效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，也是桑树的一种抗逆性物质，用来防御植食性昆虫的啃食 ［25］。有研究报道 ［20］，非食桑昆虫（如蓖麻蚕、毛虫等）在食用了含有DNJ的食物后，由于体内二糖酶活性受到抑制，导致单糖的吸收减少，影响了虫体的生长，而对于家蚕来说，蚕体的生长则不受影响。

家蚕一生食桑，且对DNJ具有奇妙的富集作用，本课题组前期研究及文献报道 ［15-17］均发现，家蚕的任一成长发育阶段（蚁蚕和熟蚕不吃桑叶除外），其蚕体DNJ含量均大大高于桑叶中的DNJ含量，且用不含桑叶粉的人工饲料饲养家蚕，则体内不含DNJ，证实了家蚕体内DNJ来源于桑叶，而家蚕自身不能产生DNJ，这一结果充分说明蚕体具有高效富集DNJ的功能。因此，利用家蚕生物反应器获取DNJ，很可能成为一种更加便捷有效的新途径。

本实验研究结果显示，不同品种的家蚕体内DNJ含量差异显著，DNJ含量高的家蚕品种其体内蔗糖酶和乳糖酶的活性较低，DNJ含量低的品种其体内蔗糖酶和乳糖酶的活性则较高，蚕体DNJ含量与体内这两种主要的二糖酶的活性存在显著的负相关（P＜0.01），但家蚕食桑后仍能正常生长，蚕体内糖的吸收并未受到DNJ的影响，由此说明家蚕长期食用含有DNJ的桑叶，与桑树共进化，逐渐演化形成了一种体内二糖酶对DNJ抑制性不敏感的体质，其原因可能是家蚕体内含有一种未知的酶类物质，这种酶类物质抵抗DNJ的二糖酶抑制性，不使DNJ与二糖酶作用在体内被转化吸收，从而使DNJ逐渐在体内富集，具体机制及相关酶类物质本课题组正在进一步研究中。对家蚕富集DNJ机制的研究，对于选育出高效富集DNJ的优良蚕种资源具有重要的指导性意义，可帮助找到一条更加有效地获得DNJ活性物质的新途径，为开发新的降血糖药物和功能食品提供基础研究依据，同时为桑蚕资源的深度开发利用开拓新的方法和技术手段。

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Correlation between 1-Deoxynojirimycin Content and Glucosidase Activities in Silkworm （Bombyx mori L.）

CHEN Hongxia 1，2， LIU Yueqin 2， PAN Gang 3， ZHAO Ming 2， OUYANG Zhen 1，2，*
（1. School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China； 2. School of Pharmacy，Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China； 3. The Sericultural Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhenjiang 212018， China）

Abs tract：In ord er to reveal the mechanism of 1-deoxynojirimycin （DNJ） enrichment in silkworm （Bombyx mori L.）， we studied and analyzed the correlation between DNJ content and glucosidase activities in silkworm. Towards this goal， 25 strai ns of silkworms were selected and raised with the same mulberry leaves. Pre-column derivatization high performance liquid chromatography （HPLC） was applied to determine the DNJ content of different strains of silkworms， and the activities of 3 major glucosidases （sucrase， lactase and amylase） were measured， respectively， for the analysis of correlation between DNJ content and glucosidase activities in silkworms. Our results indicated that different strains of silkworms had significant differences in DNJ content， and the highest DNJ content （which was found in the strain 2042， 0.56%） was 7 times higher than the lowest one （in ‘DongTing × BiBo’， 0.08%）. DNJ content had significantly negative correlations with the activity of either of two disaccharidases， sucrase and lactase， and had a relatively weaker correlation with amylase activity. Key word s: Bombyx mori L.； 1-deoxynojirimycin； glucosidase； correlation

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201615026

中图分类号：R932

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2016）15-0156-04

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201615026. http://www.spkx.net.cn

收稿日期：2015-12-24

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81072985；81573529）；江苏省博士创新计划项目（CXLX13_684）

作者简介：陈红霞（1975—），女，副教授，博士研究生，研究方向为中药资源开发。E-mail：chhx2011@ujs.edu.cn

*通信作者：欧阳臻（1964—），女，教授，博士，研究方向为中药资源活性成分及新药开发。E-mail：zhenouyang@ujs.edu.cn

引文格式：