师仁丽 1，翟龙飞 1，于文龙 1，梁 娜 1，龚正斯 1，王向红 1，2，*
（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；2.河北省农产品加工工程技术研究中心，河北 保定 071001）
摘 要：采用二极管阵列高效液相色谱分离技术和液相色谱-质谱联用技术对金丝小枣中黄酮类物质进行分析和鉴别。液相色谱条件为：色谱柱为Hypersil BDS-C 18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速0.8 mL/min，进样量10 μL，采用270 nm和370 nm双波长检测。结果表明：金丝小枣中含有杨梅素、芦丁、槲皮素、异鼠李素4 种黄酮类物质，含量分别为40.90、8.40、32.60 μg/g和12.56 μg/g。并且在5～125 μg/mL范围内，该方法显示良好的线性关系和重复性，当信噪比为3时，检出限为1.23～1.73 ng/L。精密度实验的相对标准偏差为1.10%～4.31%，加标回收率为93.50%～106.70%（相对标准偏差为0.68%～2.90%）。由此可以看出：该方法样品前处理简单、回收率较高、精密度良好，是一种便捷且精确的分析方法，适用于金丝小枣中黄酮类化合物的检测。
关键词：高效液相色谱法；液相色谱-质谱联用；金丝小枣；黄酮
枣是鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus jujuba Mill.）植物的成熟果实，原产于中国，栽培已有4 000 a的历史 ［1］。红枣营养价值高，且有很高的药用价值，是很重要的食用材料和经济产品，享有“营养保健丸、木本粮食”的美誉 ［2］。由于其具有益心润肺、和脾健胃、益气生津、补血养颜之功能 ［3］以及抗氧化、抗炎、抗癌、保护心肌 ［4］的作用而被用作营养食品和传统药品。
大枣中化学成分复杂，自20世纪80年代以来，从大枣中发现的化合物已有70多种，主要有三萜酸、皂苷、生物碱、黄酮及糖苷类成分 ［5］。李进伟等 ［6］对5 种枣果进行了基本营养成分测定，结果表明5 种枣果中的还原糖、粗纤维、多酚含量均存在显著差异，矿物质、维生素含量也不同。王向红等 ［7］对尖枣等9 种枣进行了基本营养成分测定，发现不同枣品种间各种营养成分差异显著。金丝小枣是众多枣品种中的一大类，河北省沧州市被命名为“中国金丝小枣之乡” ［8］，金丝小枣具有果核细小、可食率达97%、可溶性固形物40%～45%、制干率55%左右、质脆细嫩、品质优良 ［9］等特点。
黄酮类化合物是植物产生的一类次生代谢产物，是一类重要的天然化合物，对人体健康起着重要的作用。大量研究表明黄酮类物质具有降血压、降血脂、增大心脏血流量、增强心脏收缩、减少心脏搏动数、止咳祛痰、抗菌消炎的功效 ［10］。对枣中黄酮类化合物的研究表明它具有清除超氧阴离子自由基、羟自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的能力 ［11-12］，金银花的花茎中黄酮类化合物能抑制猪油氧化，清除超氧阴离子自由基、羟自由基 ［13］。Georgetti等 ［14］用化学荧光法分析测定了不同的黄酮类化合物，并确定了它们具有较强的抗氧化性。有研究 ［15］表明，查尔酮、光果定对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉、毛霉有抑制作用。王尊民等 ［16］采用培养基打孔法研究了梧桐花总黄酮的体外抗菌、抗病毒作用。郭芳彬 ［17］在对蜂产品中的黄酮类化合物研究中得出槲皮素、芹菜素、山奈酚、木犀草素、鼠李素等物质具有抗癌作用。
以往较多的文献报道了枣中的黄酮类化合物，Li Jinwei等 ［18］对金丝小枣的多糖进行了纯化以及对其免疫活性进行研究。Liu Jingjing等 ［19］报道了酸枣中含有当药黄素。Pawlowska等 ［20］报道了叙利亚枣果中含有槲皮素和山奈酚。顾利红等 ［21］应用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法对7 种枣中芦丁含量进行了比较。本实验通过二极管阵列检测器-HPLC（diode array detector-HPLC，DAD-HPLC）法和液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法对金丝小枣中黄酮类化合物进行分离鉴定和分析，建立一种同时检测不同种黄酮类物质的快速、准确、灵敏的分析方法，为金丝小枣黄酮的开发和利用提供理论依据。
1.1 材料、试剂与仪器
金丝小枣 市购；8 种黄酮对照品 上海源叶生物科技有限公司；纯净水 乐百氏公司；甲醇（色谱纯） 美国Dikma公司；甲酸（色谱纯） 天津市标准科技有限公司。
BS-214D型电子分析天平 美国Sartorius公司；TGL-16G快速离心机 金坛市杰瑞尔电器有限公司；1200型HPLC仪、6420型HPLC-MS联用仪 美国安捷伦有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；KQ500DE型超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 金丝小枣样品溶液的制备
精密称取5 g干燥粉碎过40 目筛的金丝小枣粉，加入50 mL甲醇溶液，超声提取30 min，重复超声1 次。超声完毕后将滤液合并，3 500 r/min离心5 min，将离心后的上清液移入梨形瓶中，将离心液旋转蒸发至干，加入1 mL纯甲醇回溶，用有机微孔滤膜（0.45 μm）过滤，作为供试品溶液，储存在4 ℃条件下备用。
1.2.2 对照品溶液的配制
对照品储备液配制：分别精密称取2 mg芦丁、槲皮素、山奈酚、没食子酸、异鼠李素、木犀草素、儿茶素、杨梅素，用甲醇溶液定容至1 mL，配制成2 000 μg/mL对照品储备液。
混合对照品溶液配制：将配制好的8 种混合对照品溶液混合均匀，用移液管和移液枪分别吸取混合液0.02、0.10、0.20、0.25、0.50、1、2、2.50 mL，用甲醇定容至5 mL容量瓶中，配制成质量浓度1、5、10、12.5、25、50、100、125 μg/mL的混合对照品溶液，储存在4 ℃条件下，供HPLC分析。
1.2.3 DAD-HPLC和LC-MS检测
1.2.3.1 DAD-HPLC条件
色谱条件：Hypersil BDS-C 18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：流动相A为甲醇、流动相B为0.1%甲酸溶液，采用梯度洗脱程序，如表1所示；流速0.80 mL/min；检测波长270、370 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。
表1 DAD-HPLC流动相梯度洗脱程序
Table 1 Mobile phase gradient elution program for DAD-HPLC
时间/min 流动相A比例/% 流动相B比例/% 流速/（mL/min）0.00 28 72 0.80 5.00 40 60 0.80 7.00 50 50 0.80 8.00 54 46 0.80 10.00 56 44 0.80 15.00 56 44 0.80 17.00 80 20 0.80 22.00 28 72 0.80 32.00 28 72 0.80
1.2.3.2 LC-MS分析
LC条件：Hypersil BDS-C 18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：流动相A为甲醇、流动相B为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序见表2；流速0.20 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL；采样时间25 min。
表2 LC-MS流动相梯度洗脱程序
Table 2 Mobile phase gradient elution program for LC-MS
时间/min 流动相A比例/% 流动相B比例/% 流速/（mL/min）5.00 30 70 0.20 7.00 40 60 0.20 10.00 50 50 0.20 15.00 80 20 0.20 20.00 80 20 0.20 20.00 10 90 0.20 25.00 10 90 0.20
MS条件：电喷雾离子源；采用负电子电离方式；离子源温度200 ℃；雾化气体流速1.5 L/min；脱溶温度200 ℃；质量扫描范围m/z 100～1 000；扫描时间30 min。
1.3 数据处理
采用SPSS 17.0统计学软件对本次研究所得数据进行统计分析。每次测定均做3 个平行，实验数据表示为 ±s。
2.1 HPLC条件的优化
为了同时检测8 种黄酮类成分，并获得较好的分离效果，考察乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液和甲醇-0.1%甲酸溶液4 种流动相系统。在前3 种流动相条件下，8 种黄酮类化合物分离所需时间长，且效果不佳。在采用甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）作流动相洗脱时，选择不同的梯度条件进行分离，8 种黄酮类化合物分离效果较好，梯度洗脱条件见表1。
考察0.6、0.8、1 mL/min流速条件下对分离效果的影响。流速为1 mL/min时，8种黄酮类化合物所需的分析时间最短，但不同峰之间有叠加现象；流速为0.6 mL/min时，8 种黄酮类化合物所需的分析时间过长，且峰形不好；当流速为0.8 mL/min时，分离效果以及峰形最佳，故0.8 mL/min为最佳流速。
考察波长270、280、350、370、375、402 nm条件下测定8 种黄酮类化合物，单一波长均不能检测出所有8 种黄酮类物质，波长270 nm可以很好地检测出没食子酸、儿茶素、杨梅素；波长370 nm可以很好地检测出芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素，故选择270、370 nm双波长检测。改变柱温可以明显地优化峰的分离度，经过不同温度的测定，在柱温为30 ℃时各峰得到了较好的分离，故选择30 ℃为分析柱温。
2.2 HPLC-DAD和LC-MS分析黄酮对照品
图1 8 种黄酮混合对照品（A）和金丝小枣黄酮提取物（B）的HPLC图
Fig. 1 HPLC chromatograms of mixture of flavonoid standards （A）and flavonoids extracted from Ziziphus jujuba Mill. cv. Jinsixiaozao （B）
采用优化的HPLC条件，整个分离过程几乎在25 min后结束。如图1所示，8 种黄酮类化合物得到了完全分离，并且峰形良好，无拖尾等现象。
在负离子电离模式下，对黄酮类化合物的电离碎片进行研究。8 种标准黄酮类化合物在MS离子流的峰保留时间与HPLC峰一致。通过色谱峰的MS数据与相关文献报道进行比较分析，初步鉴定8 种黄酮对照品，依次是没食子酸、表儿茶素、杨梅素、芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素。表3列出了各化合物的出峰时间和MS数据。
通过将样品的HPLC图与对照标准品的LC图进行比较，如图1B所示，以保留时间为依据，化合物在3、4、5、8的位置出现了与对照标准品时间一致的色谱峰，结合MS数据的分析，确定该4 种物质分别为杨梅素、芦丁、槲皮素、山奈酚。而其他4 种黄酮类物质均未检测到。
表3 各黄酮对照品的HPLC出峰时间及各级质谱数据
Table 3 HPLC peak times and mass spectral data of flavonoid standards
序号 出峰时间/min ［M-H］ m/z MS 2m/z 化合物1 4.013 169 169→125 没食子酸2 5.315 289 207→165、147、139表儿茶素3 11.176 317 273→153、137 杨梅素4 11.597 609 465、301→273 芦丁5 15.001 301 273→255、201 槲皮素6 16.045 285 256→210、155 山奈酚7 18.572 285 241→151、133 木犀草素8 19.506 315 300→271、151 异鼠李素
化合物1的分子离子峰［M-H］ -m/z为169，说明它的相对分子质量为170，与没食子酸的相对分子质量一致，因此化合物1可能是没食子酸。化合物2的分子离子峰［M-H］ -m/z为289，所以得出其相对分子质量为290。并且有m/z 579的耦合离子［2M-H］，与文献［22］报道表儿茶素一致。由此可以初推测该化合物是表儿茶素。
化合物3的准分子离子峰［M-H］ -的m/z是317，故相对分子质量为318。m/z 465可能是该化合物结合鼠李糖碎片生成的离子峰，由此可以初步假设该化合物是杨梅素。化合物4的准分子离子峰［M-H］ -是m/z 609，说明该化合物的相对分子质量为610，与芦丁的相对分子质量相同。MS 2有m/z 465和m/z 301碎片，说明分别裂解脱去1分子葡萄糖和1分子鼠李糖，与文献［23］报道的芦丁一致。由此可以推测该化合物是芦丁。化合物5的准分子离子峰［M-H］ -为m/z 301，故相对分子质量为302，符合槲皮素的相对分子质量。且产生的二级质谱图中，出现了m/z 273、255，与文献［24］报道的槲皮素裂解特征一致，因此初步推断该化合物为槲皮素。化合物6的准分子离子峰［M-H］ -是m/z 285，相对分子质量为286，二级质谱图中碎片有m/z 256、210，与文献［25］报道的山奈酚的特征峰一致，所以该化合物可能是山奈酚。化合物7的准分子离子峰［M-H］ -是m/z 285，相对分子质量为286，二级碎片中有133的峰，符合文献［26］报道的木犀草素对照品的裂解峰，所以将此化合物初步假设为木犀草素。化合物8的准分子离子峰［M-H］ -是m/z 315，相对分子质量为316，与异鼠李素的相对分子质量一致。主要的碎片离子m/z为271、151，应该是异鼠李素苷元C环裂解产生的碎片，因此该化合物可能是异鼠李素。
2.3 方法验证结果
2.3.1 线性关系以及检出限的确定
以1.2.2节方法配制的对照品溶液，按上述LC条件分别取10 μL进行LC测定，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品溶液的质量浓度（X）为横坐标做线性回归，测得8 种黄酮类化合物的回归方程、相关系数、线性范围和检出限（信噪比为3），结果见表4。
表4 线性关系、检出限结果（n= 6）
Table 4 Linear relationships and limits of detection （n= 6）
化合物 回归方程 相关系数 线性范围/ （μg/mL）检出限/ （ng/L）没食子酸 Y=51.509X-36.09 0.999 6 5～125 1.25儿茶素 Y=6.094 9X-28.869 0.999 2 5～125 1.73杨梅素 Y=3.642 3X-3.529 0.999 7 5～100 1.71芦丁 Y=5.79X-2.345 0.999 7 5～100 1.38槲皮素 Y=16.087X-43.716 0.999 1 5～125 1.23木犀草素 Y=7.374 8-8.731 5 0.999 6 5～100 1.40山奈酚 Y=14.317X+0.795 7 0.998 7 5～125 1.63异鼠李素 Y=12.337X-15.223 0.999 9 5～100 1.52
由表4可知，该方法在测定8 种黄酮类化合物时，在5～125 μg/mL的范围内，8 种黄酮类物质经过线性分析之后，得出的线性回归方程中相关系数r 2均达到0.999 0以上，表明线性关系良好。在进样量为10 μL，信噪比为3时，得出各黄酮类物质的检出限范围为1.23～1.73 ng/L，表明该方法可行，结果真实可靠。
2.3.2 精密度和加标回收率
准确吸取100 μg/mL质量浓度的8 种对照品混合溶液10 μL，一日内重复进样6 次，记录各黄酮化合物的峰面积，从而计算各化合物的精密度及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
精密称取已知黄酮含量的样品1 g，精密加入对照品溶液适量，在1.2.3.1节的色谱条件下进行测定，做6 次平行实验，计算平均回收率。
表5 精密度、平均回收率与稳定性实验结果
Table 5 Average recovery， precision （RSD） and stability （RSD） for 8 flavonoid components
稳定性RSD/%没食子酸 100 105.70±1.21 1.10 105.70 2.59 1.45儿茶素 100 93.50±4.02 4.31 93.50 1.54 1.25杨梅素 100 96.70±1.33 1.30 96.70 2.79 2.01芦丁 100 102.90±1.81 1.73 102.90 0.68 1.67槲皮素 100 105.10±1.60 1.52 105.10 1.14 1.55木犀草素 100 96.90±1.20 1.28 96.90 0.86 1.89山奈酚 100 106.70±2.44 2.26 106.70 1.17 1.35异鼠李素 100 96.10±2.32 2.37 96.10 2.90 0.69化合物 质量浓度/ （μg/mL）测量值/ （μg/mL）精密度RSD/%平均回收率/%回收率RSD/%
如表5所示，根据峰面积得出测量值及RSD，测量值与实际值几乎一致，并且RSD较小，RSD为1.10%～4.31%，表明该仪器测定此8 种黄酮类物质准确度和精密度良好。回收率实验的测定结果显示，回收率范围在93.50%～106.70%之间（RSD为0.68%～2.90%），均较高，进一步证明了方法测定结果真实，可靠。
2.3.3 稳定性实验结果
取同一样品溶液，按上述色谱条件，每隔4 h进一次样，共进4 次样，进样量10 μL。记录峰面积考察其稳定性，并计算各化合物峰面积的RSD，结果见表5，表明样品溶液在24 h内稳定。
2.4 样品中黄酮类物质分析结果
在1.2节HPLC方法条件下对黄酮类化合物进行分析，根据与对照品的保留时间和质谱数据进行比较，从而识别样品中的类黄酮物质。根据线性回归方程对金丝小枣中的黄酮类物质进行定量分析。
利用线性回归方程对该4 种物质进行定量计算，结果测得杨梅素、芦丁、槲皮素、异鼠李素含量分别为40.90、8.40、32.60、12.56 μg/g。
本实验成功建立了一种运用DAD-HPLC和LC-MS联用技术的分析方法对金丝小枣中黄酮类化合物进行定性定量检测。研究表明，在负离子模式下对黄酮类化合物进行质谱分析是可行的。LC-MS联用技术适用于化合物的鉴定及定量分析，方法简便、可靠。通过对该方法的线性、精密度、稳定性、加标回收率进行验证，结果表明精密度和稳定性的RSD均较小，在5～125 μg/mL的范围内，相关系数（r 2）均大于0.999 0，表明线性关系良好，回收率范围在93.50%～106.70%之间，较高，说明该检测方法真实有效，并且能提供较高的灵敏度和重复性。
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Determination of Flavonoid in Ziziphus jujuba Mill. cv. Jinsixiaozao Fruits by DAD-HPLC and LC-MS
SHI Renli
1， ZHAI Longfei
1， YU Wenlong
1， LIANG Na
1， GONG Zhengsi
1， WANG Xianghong
1，2，*
（1. College of Food Science and Technology， Hebei Agricultural University， Baoding 071001， China；2. Agricultural Product Processing Engineering Technology Research Center of Hebei， Baoding 071001， China）
Abstract：In this study， the flavonoids in Ziziphus jujuba Mill. cv. Jinsixiaozao fruits were analyzed by using high performance liquid chromatography with diode array detector （DAD-HPLC） and liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS）. The chromatographic separation was achieved on a Hypersil BDS-C 18column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） using a mobile phase consisting of methanol and 0.1% formic acid aqueous solution at 0.8 mL/min flow rate by gradient elution. The column temperature was set at 30 ℃， and the injection volume was 10 μL. Dual-wavelength detection was carried out at 270 and 370 nm. Then LC-MS was employed to determine the flavonoids. Results demonstrated that Jinsixiaozao jujube contained four flavonoids， myricetin， rutin， quercetin， and isorhamnetin and their contents were 40.90， 8.40， 32.60 and 12.56 μg/g，respectively. In the range of 5–125 μg/mL， the method exhibited a good linear relationship and repeatability. The limits of detection （LODs） were in the range of 1.23–1.73 ng/L at a signal-to-noise ratio of 3. The relative standard deviation （RSD）values for precision were 1.10%–4.31%. The recoveries from spiked samples were 93.50%–106.70% （RSD = 0.68%–2.90%）. Conclusively， this method had the advantages of simple pretreatment， high recovery rate and good precision， and it could provide a convenient and precise method for the analysis of flavonoids in Ziziphus jujuba Mill. cv. Jinsixiaoza fruits.
Key words：high performance liquid chromatography （HPLC）； liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS）；Ziziphus jujuba Mill. cv. Jinsixiaozao； flavonoids
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201616020
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）16-0123-05
引文格式：
师仁丽， 翟龙飞， 于文龙， 等. 利用DAD-HPLC和LC-MS法检测金丝小枣中黄酮类化合物［J］. 食品科学， 2016， 37（16）: 123-127. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201616020. http://www.spkx.net.cn
SHI Renli， ZHAI Longfei， YU Wenlong， et al. Determination of flavonoid in Ziziphus jujuba Mill. cv. Jinsixiaozao fruits by DAD-HPLC and LC-MS［J］. Food Science， 2016， 37（16）: 123-127. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201616020. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-02-18
基金项目：公益性行业（林业）科研专项（201304708）
作者简介：师仁丽（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品工程。E-mail：15231228206@163.com
*通信作者：王向红（1973—），女，教授，博士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：wangxianghong73@sina.com