超高效液相色谱法测定水体和沉积物中4 种硝基呋喃类抗生素

王强，王旭峰，赵东豪，黄珂，黎智广，李永贤，杨宏亮，李刘冬*
（中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，广东广州　510300）

摘要：建立超高效液相色谱法同时测定水体和沉积物中的呋喃妥因、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃唑酮4种硝基呋喃类抗生素。水体样品过滤后直接用混合型阳离子交换（mixed-mode cation exchange，MCX）固相萃取柱富集净化；沉积物样品经乙腈-0.1%甲酸溶液（8∶2，V/V）提取，MCX固相萃取柱净化。采用BEH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱分离，以0.1%甲酸溶液-乙腈为流动相梯度洗脱。4 种硝基呋喃类药物在10.0～200 μg/L质量浓度内范围线性关系良好，相关系数R 2均大于0.999。水体和沉积物中的加标回收率分别为81.5%～103.2%和73.3%～91.9%，相对标准偏差分别为2.0%～5.8%和3.4%～9.6%（n=5），检出限分别为0.03 μg/L和0.6 μg/kg，定量限分别为0.1 μg/L和2.0 μg/kg。该方法可应用于水体和沉积物中硝基呋喃类抗生素的残留检测。

硝基呋喃类抗生素是人工合成的广谱抗菌药物［1-2］，在水产养殖业中可作为饲料添加剂或外用消毒药直接投入水体防治病害，主要应用的品种包括呋喃唑酮（furazolidone，FZD）、呋喃它酮（furaltadone，FTD）、呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）和呋喃妥因（nitrofurantion，NFT）［3-4］。由于该类药物及其代谢物具有显著的致畸、致癌、致突变等毒性作用，我国和欧美等多个国家都明令禁止其在水产养殖中的应用［5-7］。尽管如此，近年来人为的非法添加使用依然屡禁不止，对我国水产品的养殖环境和消费者健康造成潜在的风险隐患［8-9］。

目前，硝基呋喃类药物及其代谢物的残留检测对象主要集中在饲料制品或鱼虾类水产品，分析手段包括免疫分析法［10-12］、高效液相色谱法［6，13-15］、液相色谱-质谱联用法［5，16-18］等。免疫分析法灵敏度高、方便快捷，但容易产生假阳性问题，一般作为初步的筛查手段。我国农业部1486号公告和783号公告分别采用高效液相色谱-紫外检测法和液相色谱-质谱联用法，测定了饲料中硝基呋喃类药物和水产品中的4 种硝基呋喃代谢物的残留量［19-20］。其中，高效液相色谱法在多残留检测过程中分离效率低，流动相试剂消耗量大，上述国标法单个样品的测定时间需要20 min。而液相色谱-质谱联用法灵敏度较高，可作为检测方法的确证手段，但仪器设备价格昂贵，技术要求相对较高，在基层实验室的配备率不高。

在水产养殖过程中硝基呋喃类药物往往是直接投喂使用，造成其可能未经过生物体代谢而直接在池塘的底泥沉积物中不断蓄积，随着外界环境的变化进一步向水体中缓慢释放，产生二次污染，由此导致的质量安全问题亟待解决［21-22］。而目前同时针对养殖环境中的水体和沉积物中4 种硝基呋喃类抗生素残留测定的方法相对较少，有必要建立准确、可靠的检测方法，从源头上对水产品的养殖环境进行安全监控。本研究采用MCX固相萃取柱进行富集净化，利用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）快速分离，建立了同时检测水体和沉积物中4 种硝基呋喃类药物的多残留分析法，为保障我国的水产品质量安全提供一种有效的风险监测技术手段。

1　材料与方法

水体和沉积物样品由农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（广州）提供。

NFT（CAS：67-20-9，纯度99.0%）、NFZ（CAS：59-87-0，纯度99.5%）　德国Dr.Ehrenstorfer公司；FTD（CAS：139-91-3，纯度99.8%）、FZD（CAS：67-45-8，纯度99.9%）、甲醇、乙腈和二氯甲烷（均为色谱纯）美国Sigma公司；Oasis HLB固相萃取柱（3 mL/60 mg）美国Waters公司；Poly-Sery MCX固相萃取柱（3 mL/60 mg）　德国CNW公司；Bond Elut C 18固相萃取柱（3 mL/200 mg）　美国Agilent公司；实验用水为Milli-Q超纯水，其他试剂均为分析纯。

Acquity TMUPLC仪（配紫外检测器和Empower色谱工作站）　美国Waters公司；MS3旋涡混合器　德国IKA公司；Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机　美国Thermo公司；N-EVAP氮吹仪　美国Organomation公司；R210型旋转蒸发仪　瑞士Büchi公司。

准确称取硝基呋喃类标准品各10.0 mg，乙腈溶解后，分别定容于50 mL棕色容量瓶中，制备成200 μg/mL的单标储备液，-18 ℃密封保存，有效期为6 个月。实验中取适量单标储备液，用初始流动相配制成混合标准工作液，现用现配。

水样预先经过0.45 μm滤膜处理，除去明显的固体杂质后，准确量取100 mL待测水样，使用MCX固相萃取柱进行富集净化处理。固相萃取：依次用3 mL甲醇、3 mL 1%甲酸溶液活化固相萃取柱，随后转移待测样品至萃取柱上，在自然重力下过柱，待样品流干后，依次用3 mL水、3 mL 50%甲醇溶液淋洗，真空泵抽1 min，加入4 mL 1%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，旋涡混合后置于40 ℃水浴，氮气吹至近干，用流动相定容至1.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤后待UPLC测试分析。

准确称取5.0 g沉积物样品，置于50 mL 聚苯乙烯离心管中，加入20 mL乙腈-0.1%甲酸溶液（8∶2，V/V），旋涡振荡2 min，超声波提取10 min，4 000 r/min离心5 min后收集上清液于150 mL鸡心瓶中，向离心管中加入20 mL乙腈-0.1%甲酸溶液（8∶2，V/V），重复提取一次。上清液合并后45 ℃旋转蒸馏至约10 mL，剩余液体旋涡混合后用MCX固相萃取柱净化处理。

色谱柱：A c q u i t y U P L C B E H C 1 8柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min；检测波长：365 nm；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸溶液；梯度洗脱程序：0～0.5 min，10% A；0.5～3.0 min，10%～15% A；3.0～5.0 min，15% A；5.0～6.0 min，15%～10% A；6.0～8.0 min，10% A。

2　结果与分析

Acquity UPLC BEH C 18色谱柱具有良好的保留能力和分离效率［23］，分别比较了水-甲醇、水-乙腈、5 mmol/L乙酸铵-甲醇、5 mmol/L乙酸铵-乙腈、0.1%甲酸溶液-甲醇和0.1%甲酸溶液-乙腈等流动相体系对目标物的分离度，色谱峰形及响应值等色谱行为的影响。结果显示甲醇的洗脱效果不如乙腈，有机相使用甲醇时NFZ、NFT和FZD 3种物质的目标峰难以实现基线分离，乙酸铵缓冲液的影响不明显，而流动相中加入一定比例的甲酸溶液有利于改善色谱峰形并提高分离度。柱温设定为25～40 ℃时，4 种硝基呋喃类药物的色谱行为差别不大，实验选取了仪器初始默认的柱温参数35 ℃。在0.1%甲酸溶液-乙腈流动相体系下进行梯度洗脱，4 种物质分在5 min内完全分离，峰形尖锐对称，响应值高，保留时间稳定，如图1所示。

图1　4 种硝基呋喃药物色谱图（50 μg/L）
Fig. 1　Chromatogram showing separation of 4 nitrofurans （50 μg/L）

由于待分析物质在水体中的含量极低，而沉积物样品的基质较为复杂，分别需通过固相萃取进行富集浓缩和净化处理，从而提高检测结果的准确度和精密度［24］。本研究主要考察了固相萃取柱类型、洗脱溶剂及洗脱剂用量对固相萃取柱萃取效率的影响，以水体样品的加标回收率为评价依据分别对这些实验条件进行了优化。

分别选用HLB、C 18和MCX固相萃取柱对4 种物质的提取效率和净化效果进行比较，加标水平为1 μg/L的100 mL水样。其中，HLB小柱和C 18小柱依次经过3 mL甲醇和3 mL水活化，待上样液体加载完毕后用3 mL水和3 mL 10%甲醇溶液淋洗，最后5 mL甲醇洗脱，MCX小柱按1.3.2节方法处理。结果表明（图2），C 18小柱的保留效果差异明显，其对NFT几乎无保留能力，无法满足同时检测的要求。而HLB和MCX小柱对4 种物质的保留效果较为均衡，其中MCX小柱的回收率和净化效果整体优于HLB小柱。因此实验选取MCX小柱对待测样品进行富集净化处理。

图2　固相萃取柱对4 种硝基呋喃药物回收率的影响
Fig. 2　Influence of different solid phase extraction columns on the recoveries of 4 nitrofurans

MCX固相萃取柱具有反相保留与阳离子交换的双重机制，选择性较强［25］。实验中MCX小柱经甲酸溶液活化，样品加载并淋洗完毕后，选择在甲醇洗脱液中加入一定比例的氨水，以破坏目标物和小柱填料之间的离子交换作用，进而使得目标物可以顺利洗脱下来。考察了洗脱剂中不同体积分数的氨水（0.5%、1%、2%、4%）的对洗脱效果的影响。结果表明，随着洗脱剂中氨水的添加，目标物不断从固相萃取柱上解离，回收率逐渐增加，氨水含量为1%时4 种物质整体回收率大于95.3%，可以满足检测要求。进一步氨水含量的增加则没有提升洗脱效率，过多的氨水可能影响后续的氮吹浓缩，回收率反而在一定程度有所下降。同时，在2～6 mL的范围内考察洗脱液用量对于回收率的影响，随着洗脱体积的增加，回收率不断增大，洗脱体积为4～6 mL时目标物的回收率无明显变化。综合考虑，本研究选择4 mL 1%氨化甲醇溶液作为固相萃取的洗脱剂。

分别用乙腈、甲醇、乙酸乙酯和乙腈-0.1%甲酸溶液作为提取溶剂，进行沉积物样品中4 种硝基呋喃类药物的加标回收实验。结果表明，甲醇对4 种物质提取能力弱，除NFZ外，其他3 种物质回收率较低（小于30%）。而使用乙酸乙酯作为提取溶剂时，样品非常容易变性成团，影响检测结果的精密度。使用乙腈提取时，样品分散比较均匀，减压除去有机溶剂后，整体回收率为59.4%～75.8%。同时，实验发现在提取溶剂中加入适当的甲酸溶液，可以在一定程度上提高检测回收率。随后，实验考察了不同比例乙腈-0.1%甲酸溶液（8∶2、5∶5、2∶8，V/V）对于目标物提取效果的差异，样品提取后只需将大部分的乙腈减压除去，余下的提取液直接转移至固相萃取柱上。结果显示（图3），提取溶剂中甲酸溶液在20%时，目标物整体回收率大于74.7%，检测结果优于单独的使用乙腈，进一步增加甲酸溶液的比例，回收率变化不明显，且水相过多会增加后续固相萃取处理时间。综合考虑采用乙腈-0.1%甲酸溶液（8∶2，V/V）作为提取溶剂。

图3　提取溶剂对4 种硝基呋喃药物回收率的影响
Fig. 3　Influence of extraction solvents on the recoveries of 4 nitrofurans

配制系列质量浓度的混合标准工作液，在优化的色谱条件下依次测定，以各组分的质量浓度为横坐标，各组分的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果（表1）显示，在10.0～200 μg/L质量浓度范围内标准曲线具有良好的线性，相关系数R 2均大于0.999。在空白水体和沉积物样品中分别添加硝基呋喃药物混合标准溶液，按照1.3节方法处理，以3 倍和10 倍信噪比计算出方法的检出限和定量限。水体中和沉积物中4 种硝基呋喃药物的检出限为0.03 μg/L和0.6 μg/kg，定量限为0.1 μg/L和2.0 μg/kg。

表1　4 种硝基呋喃药物的线性范围、线性方程和相关系数
Table 1　Linear ranges， linear equations and correlation coefficients for 4 nitrofurans

药物　线性范围/（μg/L）　线性方程　相关系数（R 2）FTD　10.0～200　Y=1.71×10 5X+88.9　0.999 6 NFZ　10.0～200　Y=2.47×10 5X+108　0.999 6 NFT　10.0～200　Y=2.51×10 5X+57.7　0.999 8 FZD　10.0～200　Y=2.14×10 5X-146　0.999 9

水样的添加量为0.1、0.5、1.0 μg/L，沉积物样的添加量为2.0、10.0、20.0 μg/kg，按照1.3节方法处理后上机测定，计算加标回收率和相对标准偏差。水体和沉积物的空白样及加标样色谱图见图4、5。结果（表2）显示，水体样品中4 种物质的加标回收率为81.5%～103.2%，相对标准偏差为2.0%～5.8%；沉积物样品中4 种物质加标回收率为73.3%～91.9%，相对标准偏差为3.4%～9.6%。

图4　空白水样（A）和加标水样加标水样（0.1 μg/L）（B）
Fig. 4　Chromatograms of blank water （A） and spiked blank water （0.1 μg/L）（B）

Fig. 5　Chromatograms of blank sediment （A） and spiked blank sediment （2.0 μg/kg）（B）

表2　方法的回收率与精密度（n= 5）
Table 2　Recoveries and precision of the method （n= 5）

药物水体　沉积物添加量/ （μg/L）回收率/%相对标准偏差/%添加量/ （μg/kg）回收率/%相对标准偏差/% FTD 0.1　89.1　5.1　2.0　76.6　6.7 0.5　84.7　5.2　10.0　87.2　4.0 1.0　82.1　3.3　20.0　80.1　9.6 NFZ 0.1　103.2　3.9　2.0　87.5　5.3 0.5　88.5　2.9　10.0　83.8　7.0 1.0　94.1　2.0　20.0　91.9　5.5 NFT 0.1　83.0　5.2　2.0　78.1　6.4 0.5　81.5　4.1　10.0　83.6　4.3 1.0　86.4　4.3　20.0　73.3　8.1 FZD 0.1　88.7　4.3　2.0　82.9　6.3 0.5　96.1　4.4　10.0　90.3　3.4 1.0　92.1　5.8　20.0　84.2　5.4

采用本方法对广东省内所采集的40 份养殖水样和沉积物样进行处理和测定，其中一份水样中测出含量为0.23 μg/L的FZD，一份水样中测出含量为0.14 μg/L的NFZ，而沉积物样品中则未检出硝基呋喃类药物。

3　结论

本研究采用MCX固相萃取柱富集净化，UPLC法分离，同时测定了水体和沉积物中4 种硝基呋喃类抗生素（NFT、NFZ、FTD和FZD）。该方法操作简便、快速，具有较高准确度和精密度，可用于水产品产地环境质量安全的风险监测，为进一步制定相关的国标检测法提供了一定的理论参考和实验数据。

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Determination of Four Nitrofurans in Water and Sediment Using Ultra Performance Liquid Chromatography

WANG Qiang， WANG Xufeng， ZHAO Donghao， HUANG Ke， LI Zhiguang， LI Yongxian， YANG Hongliang， LI Liudong*
（South China Sea Fisheries Research Institute， Key Laboratory of Aquatic Product Processing， Ministry of Agriculture，Laboratory of Quality and Safety Risky Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation， Ministry of Agriculture，Chinese Academy of Fishery Sciences， Guangzhou　510300， China）

Abstract：An ultra performance liquid chromatography （UPLC） method was developed for the simultaneous determination of 4 nitrofuran antibiotics （furazolidone， furaltadone， nitrofurazone and nitrofurantion） in water and sediment. Water samples were filtrated and cleaned up using mixed-mode cation exchange solid-phase extraction column （MCX）. Sediment samples were extracted with acetonitrile-0.1% formic acid solution （8:2， V/V）， and then cleaned up also with MCX solidphase extraction column. The analytes were separated on a BEH C 18column （100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm） utilizing gradient elution with a mixture of acetonitrile and 0.1% formic acid solution as the mobile phase. The method showed good linearity in the range of 10.0–200 μg/L with correlation coefficients （R 2） all above 0.999. The recoveries were 81.5%–103.2% and 73.3%–91.9% with relative standard deviations （RSDs， n = 5） of 2.0%–5.8% and 3.4%–9.6% for 4 nitrofurans in water and sediment， respectively. The limits of detection （LODs） were 0.03 μg/L and 0.6 μg/kg and the limits of quantitation （LOQ）were 0.1 μg/L and 2.0 μg/kg， respectively. The method can be applied to the determination of nitrofuran antibiotics residues in water and sediment.

Key words：ultra performance liquid chromatography （UPLC）； water； sediment； nitrofuran

王强，王旭峰，赵东豪，等. 超高效液相色谱法测定水体和沉积物中4 种硝基呋喃类抗生素［J］. 食品科学， 2016， 37（16）: 249-253. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201616040.　http://www.spkx.net.cn

WANG Qiang， WANG Xufeng， ZHAO Donghao， et al. Determination of four nitrofurans in water and sediment using ultra performance liquid chromatography［J］. Food Science， 2016， 37（16）: 249-253. （in Chinese with English abstract）

基金项目：国家农产品质量安全风险评估重大专项（GJFP2014009）；

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2013TS08；2014TS09；2015TS17；2015TS18）

作者简介：王强（1988—），男，助理研究员，硕士，研究方向为水产品检测与风险评估。E-mail：546056407@qq.com

*通信作者：李刘冬（1959—），男，研究员，本科，研究方向为水产品检测与风险评估。E-mail：168LLd@163.com

超高效液相色谱法测定水体和沉积物中4 种硝基呋喃类抗生素

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　结论