甘油添加量对兔皮明胶膜性能与结构的影响

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.西南大学国家食品科学与工程实验教学中心，重庆 400715）

摘要：以兔皮明胶为原料制备明胶膜，通过测定不同甘油添加量明胶膜的机械性能、水蒸气透过率、亚基组成及结构，明确了甘油添加量对明胶膜性能与结构的影响。结果表明甘油添加量对明胶膜厚度无显著性影响，而水蒸气透过率随甘油添加量的增加呈现上升趋势。力学性能结果表明当甘油添加量达22%（以明胶质量计，m/m）时，明胶膜的抗拉强度和断裂伸长率均显著增加（P＜0.05）。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示甘油并没有导致明胶分子的降解和聚集，膜内结构较稳定，并且当甘油添加量为30%时，膜的谱带强度增加，明　胶膜有较高的抗拉强度。傅里叶变换红外光谱分析结果表明随甘油添加量增加，酰胺A带吸收峰逐渐向低波数移动（3 446.9～3 398.9 cm －1），说明甘油分子进入到膜基质，与明胶分子侧链的N—H基团相互反应形成氢键；酰胺Ⅰ带曲线拟合结果表明随甘油添加量的增加，膜内无规卷曲含量逐渐减少，而三螺旋结构含量逐渐增加，说明甘油的添加可促进明胶膜形成更有序的空间结构，进而提升明胶膜的成膜性能和力学性能。

杨晖, 马良, 韩霜, 等. 甘油添加量对兔皮明胶膜性能与结构的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(17): 14-18. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201 617003.　http://www.spkx.net.cn

YANG Hui, MA Liang, HAN Shuang, et al. Effect of glycerol content on properties and structure of rabbit skin gelatin fi lm[J]. Food Science, 2016, 37(17): 14-18. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617003.　http://www. spkx.net.cn

在食品包装中，塑料制品因其阻气性、美观性和成本低等优点被广泛使用 [1]，但是这些材料在环境中很难被降解处理，会造成严重的污染问题。随着社会的发展，减少一次性包装材料和增加包装回收率已经成为了食品包装的发展趋势，生物可降解包装也随之成为食品包装领域的研究热点 [2]。

明胶是由动物的皮、骨、韧带等富含胶原蛋白的组织经过酸、碱处理或生物酶降解后制得的高分子混合物 [3]，具有良好的生物相容性和可降解性 [4]，由于其来源广泛且具有较好的成膜能力，现已成为制备生物可降解包装膜的主要原料之一 [5]，明胶的成膜机制主要是各肽链间通过氢键相互作用形成稳定的三维网络结构，内部体系脱水后形成明胶膜 [6]。

目前对于明胶膜的研究主要以水产明胶为原料，以猪、牛明胶为代表的哺乳动物明胶亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）含量较高，所以流变性能较优 [7]。同时制成的明胶膜的热稳定性较高，水蒸气透过率（water vapor permeability，WVP）较低 [8]。但是由于宗教信仰和疯牛病、口蹄疫等安全问题，其应用受到极大限制。我国作为世界兔肉生产大国之一，年产兔肉约占世界兔肉总产量的45%。兔皮作为兔肉加工过程中的主要副产物，丢弃会造成浪费和对环境的污染。将兔皮作为明胶提取的重要来源，不仅能够改变传统哺乳动物明胶在宗教和疫病方面的使用局限性，提高兔皮利用率、延长兔肉加工产业链，还能克服水产明胶膜在WVP和透明度等方面存在的缺陷。

研究表明单纯依靠明胶分子相互交联形成的膜力学性能较差，质地较脆，同时因其含有亲水性氨基酸，导致明胶膜耐水性能差，易受环境湿度的影响。明胶中含有羟基、羧基、氨基等反应活性较高的官能团，在一定条件下与高分子材料共混，不仅能保留高分子良好的生物降解特性，还能改善明胶膜的机械性能和阻水性能 [9]。明胶分子内或分子间存在大量氢键，当加入亲水性增塑剂例如甘油、丙二醇等对其改性时，原本的氢键会断裂并与增塑剂形成更强的氢键，机械性能和阻隔性能得到显著改善 [10]。

甘油是明胶膜制备过程中常用的增塑剂，Vanin等 [11]在研究猪皮明胶膜时发现甘油对明胶膜有较优的增塑作用，并且随甘油添加量的增加，膜的抗拉强度下降而断裂伸长率和WVP增加；Rivero等 [12]研究发现当甘油添加量为20%时，明胶膜的WVP最低；甘油添加量为80%时，明胶膜的抗拉强度最大。

本实验以兔皮明胶为原料制备明胶膜，通过测定抗拉强度、断裂伸长率、WVP等指标探究甘油添加量对明胶膜特性的影响，同时通过傅里叶变换红外光谱、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）研究明胶膜微观结构的变化。

1　材料与方法

兔皮，购于重庆阿兴记食品有限公司，原料获取后洗净冻藏于－20 ℃冰箱中备用。

盐酸、氯化钠、硫化钠、氢氧化钙、硅藻土成都市科龙化工试剂厂；甘油生工生物工程（上海）股份有限公司；过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）、SDS、Tris、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、考马斯亮蓝R-250 美国BioBasic公司；30 g/100 mL的丙烯酰胺工作液（丙烯酰胺29 g、甲叉双丙烯酰胺1 g）北京索莱宝科技有限公司；其中Tris、考马斯亮蓝R-250、30%丙烯酰胺为优级纯，其他试剂均为分析纯。

JA3003B电子天平上海精天电子仪器有限公司；PHS-25型数显酸度计杭州雷磁分析仪器厂；DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱上海齐欣科学仪器有限公司；8002 型温控水浴锅北京永光明医疗仪器厂；99-1磁力搅拌器金坛市科析仪器有限公司；Spectrun100红外光谱仪美国PerkinElmer公司；Power Pac TM基础电泳仪美国Bio-Rad公司；G:BOX EF型凝胶成像系统英国Syngene公司；紫外-可见光分光光度计上海菁华科技仪器有限公司；XLW-PC型智能电子拉力机、水蒸气透过率测试仪济南兰光机电技术有限公司；数显测厚规上海川陆量具有限公司。

兔皮明胶提取参考Yu Wei等 [13]方法的基础上稍加改动。具体提取工艺流程如下：新鲜兔皮→清洗、去除皮下脂肪→脱毛→清洗、剪切→除杂蛋白→清洗→稀酸处理→提胶→过滤→热风干燥→成品明胶。

为了提高明胶纯度，在提胶过程中，向提胶料液中加入硅藻土溶液与提胶液体积比为1∶50的6%硅藻土溶液，随后用孔径为1.2 µm的微滤膜真空过滤。

称取5 g兔皮明胶置于200 mL烧杯中并按质量分数22%（以明胶质量计，下同）加入甘油和100 mL去离子水，于室温条件下溶胀2 h后，60 ℃水浴加热，间断搅拌，使明胶完全溶解形成均匀的液体。40 W超声10 min，除去气泡，制得明胶成膜溶液（film-forming solution，FFS）。用量筒量取30 mL FFS均匀平铺于130 mm×130 mm的塑料培养皿上，在（45±1）℃条件下干燥24 h，揭下的膜置于干燥皿中平衡48 h后，作为待测样品。

在考察甘油添加量对膜性能的影响时，明胶添加量恒定为5 g，甘油添加量为明胶质量的0%、15%、22%、30%。

用测厚规在膜上随机选取10 个点，测定其厚度并计算平均值和标准差。

将膜剪切成50 mm×15 mm的矩形长条，用智能电子拉力机测定膜的抗拉强度和断裂伸长率。参数设置：速率50 mm/min；夹具间距15 mm；测试温度25 ℃；相对湿度65%。每个样品测定3 次，求取平均值。

用WVP测试仪测定膜的WVP。参数设置：时间间隔20 min；测试温度25 ℃；相对湿度60%。每个样品测定3 次，求平均值。

称取一定质量样品与溴化钾（KBr）混合研磨，于40 ℃条件下烘干后压片，用红外光谱仪进行检测。室内温度为25 ℃，扫描范围：450～4 000 cm －1；扫描次数：32；分辨率：4 cm －1。对波数1 700～1 600 cm －1范围内的图谱采用Origin 8.6数据处理软件进行基线校正、去卷积和做二阶导数图谱，再自动拟合直至残差最小，得到子峰图谱（各子峰峰位及峰面积），最后根据积分面积计算对应二级结构的含量。

称取10 mg明胶膜溶解于1 mL蛋白变性剂 [14]中，室温振荡24 h，离心取上清液，测定上清液蛋白质量浓度，并将蛋白质量浓度稀释到2 mg/mL，按体积比4∶1添加5×样品缓冲液，沸水浴5 min，冷却后上样，上样量为15 μL（Marker上样量为10 μL），其中6%分离胶和4%浓缩胶。15 mA恒流电泳，待溴酚蓝跑到分离胶中后，电流调至25 mA，电泳时间约1 h。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250进行染色，2 h后用脱色液于30 ℃条件下振荡脱色。背景蓝色脱净后用凝胶成像系统拍摄电泳图谱，用Gene Tools数据处理软件进行分析。

每次实验设置3 个平行实验，数据以±s表示，并用统计软件SPSS 17.0进行显著性分析（P＜0.05），用Origin 8.6软件作图。

2　结果与分析

由表1可知，随着甘油添加量增加，膜厚度虽有增加，但增长幅度不大，这是因为甘油与定量明胶基质相互反应，明胶网络结构不变，但是因为甘油分子具有吸水性，虽然多余的水分子会在成膜过程中蒸发，但仍有少数水分子会被锁定在明胶网络结构中，因而厚度略微增加。

表1　不同甘油添加量对甘油-明胶膜厚度的影响
Table 1 Effect of different glycerol contents on the thickness of gelatin film

甘油添加量/%0152230膜厚度/µm 81.60±8.3784.30±7.1391.30±1.7093.30±5.44

表2　不同甘油添加量对甘油-明胶膜力学性质的影响
Table 2 Effect of different glycerol c ontents on mechanical properties of gelatin film

注：同行小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

152230抗拉强度/MPa24.35±1.61 a21.28±1.54 a28.14±1.63 b35.13±1.57 c断裂伸长率/%1.05±0.16 a1.05±0.14 a2.94±0.28 b10.00±1.46 c力学性质甘油添加量/% 0

由表2可知，0%和15%的甘油添加量对明胶膜的机械性能影响不显著（P＞0.05），随着甘油添加量进一步增加，明胶膜的抗拉强度和断裂伸长率均显著增加（P＜0.05），30%时达到最大。因为甘油是亲水性小分子增塑剂，容易进入到膜基质中与明胶蛋白分子上的亲水基团形成氢键，明胶分子间和分子内的相互作用会大为减弱 [15]，膜的刚性结构被软化，膜的柔韧性和延展性提高 [16]。当甘油添加量大于15%时，抗拉强度和断裂伸长率显著增加，可能是因为当甘油用量增加到一定程度后，它在FFS中所占比例增加，明胶占比相对减少，过量的甘油和明胶分子没有相互作用，成膜溶液在成膜过程中需要蒸发掉多余的水分子才能成膜，因而膜质地较硬较脆，从而使抗拉强度增加 [17]。

图1　甘油添加量对甘油-明胶膜WVP的影响
Fig. 1 Effect of different glycerol contents on the water vapor permeability of gelatin film

由图1可知，甘油添加量增加，膜的WVP呈现上升趋势。甘油是一种小分子的亲水性增塑剂，能进入膜基质中降低其聚合物链间的作用力，使蛋白质的网络结构重组，自由体积增大，结构疏松，膜内分子流动性增加 [18]，因而甘油从环境中吸收的水分子在膜表面吸附溶胀后更容易通过明胶膜内部，使得明胶膜水分含量增多，即WVP增加。

图2　甘油添加量对明胶膜蛋白组分的影响
Fig. 2 Effect of different glycer ol contents on protein patterns of gelatin film

由图2可知，不同甘油添加量（0%、22%、30%）的明胶膜蛋白主要呈现3 条条带，即β肽链、α 1肽链和α 2肽链。用Gene Tools数据处理软件分析得，不同甘油添加量0%、22%、30%条件下，α 1肽链分子质量分别为121.98、122.64、123.98 kD，α 2肽链分子质量分别为110.61、110.29、111.67 kD，各组成之间并无明显差异，说明甘油并没有导致明胶分子的降解和聚集，膜内结构较稳定，分子间的氢键没有被破坏。但β肽链在不同甘油添加量的明胶膜中，分子质量从210.32 kD增加到212.12、219.17 kD，且甘油添加量为30%的膜谱带强度增加，从而导致明胶膜有较高抗拉强度 [19]，这与前面力学特性结果一致。

图3　不同甘油添加量明胶膜的傅里叶变换红外光谱
Fig. 3 FT-IR spectra of films with different glycerol contents

由图3可知，明胶膜的酰胺B带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带吸收峰分别位于2 926、1 453、1 236 cm －1左右，并且随着甘油添加量增加，甘油的特征吸收峰向低波数区域移动（1 045.9～1 043.8 cm －1）。酰胺A带主要是N—H伸缩振动，随着甘油添加量增加，明胶膜的酰胺A带吸收峰逐渐向低波数区域移动（3 446.9～3 398.9 cm －1），说明甘油分子进入到膜基质，与明胶分子侧链的N—H基团相互反应形成氢键。酰胺Ⅰ带是表征蛋白质二级结构的特征吸收峰，不同甘油添加量的明胶膜，酰胺Ⅰ带的吸收峰分别为1 635. 6、1 635.0、1 649.8cm －1，说明当甘油添加量达到30%时，膜内二级结构逐渐由α-螺旋转变为β-折叠 [20]。对红外光谱图进行去卷积和高斯拟合后可分离出相应的子峰，根据文献[21-23]将主要子峰峰位做如下归属：1 630、1 642、1 652、1 662 cm －1分别为β-折叠、无规卷曲、α-螺旋、三螺旋结构。由表3可知，当甘油添加量增加，二级结构中α-螺旋含量逐渐降低，β-折叠含量逐渐增加，证实了上述分析。无规卷曲和三螺旋结构含量的比值与明胶膜的特性有关 [24]，随着甘油添加量增加，两者的比例呈现下降趋势，即膜内的无规卷曲逐渐变为稳定的三螺旋结构，说明甘油的添加可促进明胶膜形成更有序的空间结构，进而提升明胶膜的力学性能，同时明胶的成膜性能也有所提高。

表3　不同甘油添加量下酰胺Ⅰ带子峰面积
Table 3 The peak area of amide I band with different glycerol contents　%

分子结构甘油添加量/% 0 2230 β-折叠含量5.767.428.73无规卷曲含量23.8514.448.46 α-螺旋含量8.237.447.03三螺旋结构含量7.2116.7319.75

3　结论

以上研究对甘油对明胶膜特性的影响做了初步探究，结果表明：0%和15%的甘油添加量对明胶膜的机械性能影响不显著（P＞0.05），随着甘油添加量进一步增加，明胶膜的抗拉强度和断裂伸长率均显著增加（P＜0.05），30%时达到最大。对于明胶膜微观结构的分析中，SDS-PAGE结果显示甘油并没有导致明胶分子的降解和聚集，明胶膜结构较稳定，并且当甘油添加量为30%时，明胶膜有较高的抗拉强度。酰胺Ⅰ带曲线拟合结果表明随甘油添加量的增加，膜内无规卷曲分子结构含量逐渐减少，而三螺旋结构含量逐渐增加，说明甘油的添加可促进明胶膜形成更有序的空间结构，进而提升明胶膜的成膜性能和力学性能。即各项研究表明，当明胶添加量恒定为5 g、甘油添加量为30%（以明胶质量计）时，明胶膜的力学性能较优，且明胶膜内结构相对稳定，可在食品包装等实际应用中进行初步尝试。

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Effect of Glycerol Content on Properties and Structure of Rabbit Skin Gelatin Film

YANG Hui 1, MA Liang 1, HAN Shuang 1, HUANG Dandan 1, ZHANG Yuhao 1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract：The effect of glycerol concentration on the properties and structure of rabbit skin gelatin film was studied by measuring its mechanical properties, water vapor p e rmeability, subunit composition and structure. The results showed that glycerol concentration had no signifi cant effect on thickness, and the water vapor permeability of gelatin fi lm increased with glycerol concentration. Tensile strength (TS) and elongation at break (EAB) signifi cantly increased (P ＜ 0.05) when glycerol content was increased to 22%. Sodium dod ecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) indicated that gelatin molecules did not degrade or aggregate and the band intensity and tensile strength of gelatin film increased when　glycerol concentration was 30%. FT-IR analysis showed that amide A band moved to low wave numbers (3 446.9–3 398.9 cm -1), which indicated that glycerol molecules reacted with NH groups in peptides to form hydrogen bonds in fi lm matrix. Curve-fi tting of amide I band showed that random coil decreased while triple helix increased gradually with glycerol concentration, suggesting that glycerol promoted gelatin film to form an ordered structure and in turn to improve its film-forming and mechanical properties.

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31301425）；中央高校基本科研业务费重大专项资金项目（XDJK2015A015）；中国博士后科学基金面上项目（2014M562267）；中国博士后科学基金特别资助项目（2015T80951）；重庆市基础科学与前沿技术研究专项重点项目（cstc2015jcyjBX0116）；第四批重庆市高等学校优秀人才支持计划项目

作者简介：杨晖（1991—），女，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养。E-mail：365363469@qq.com

*通信作者：张宇昊（1978—），男，教授，博士，研究方向为蛋白和生物活性肽。E-mail：Zhy1203@163.com

甘油添加量对兔皮明胶膜性能与结构的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　结论