一磷酸腺苷与肌动球蛋白相互作用的荧光光谱研究

张 淼 1,2,王道营 1,*,张牧焓 1,杨玉玲 2,卞 欢 1,吴海虹 1,诸永志 1,耿志明 1,徐为民 1,3

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014;2.南京财经大学食品科学与工程学院,江苏 南京 210046;3.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心,江苏 南京 210095)

摘 要:目的:采用荧光分光光度法研究了一磷酸腺苷(adenosine 5’-monophosphate,AMP)与肌动球蛋白相互作用的情况。方法:根据分子间的相互作用力与相关热力学参数间的关系,结合AMP与肌动球蛋白相互作用的焓变和熵变,讨论AMP对肌动球蛋白荧光的猝灭机理,测定AMP与肌动球蛋白的猝灭常数、结合常数和作用力类型,考察AMP对肌动球蛋白构象的影响。结果:Western blotting证明了不同浓度AMP对肌动球蛋白解离的促进作用;AMP与肌动球蛋白结合反应中ΔG<0,ΔH>0,ΔS>0,两者之间结合主要通过疏水相互作用,且AMP的存在使得肌动球蛋白的构象发生变化,疏水环境极性降低;荧光光谱分析表明AMP与肌动球蛋白的结合使肌动球蛋白内源荧光发生了有规律的猝灭,298 K和313 K温度条件下AMP与肌动球蛋白的静态猝灭常数分别为8.70×10 2、4.07×10 2L/ mol,结合常数K LB分别为9.253×10 2L/mol和3.142×10 2L/mol。结论:AMP通过疏水相互作用力和肌动球蛋白形成复合物,从而促进肌动球蛋白的解离。

关键词:肌动球蛋白;一磷酸腺苷;荧光猝灭;解离

张淼, 王道营, 张牧焓, 等. 一磷酸腺苷与肌动球蛋白相互作用的荧光光谱研究[J]. 食品科学, 2016, 37(17): 32-37.

ZHANG Miao, WANG Daoying, ZHANG Muhan, et al. Fluorescence spectroscopic study of the molecular interaction between adeno sine 5’-monophosphate and actomyosin[J]. Food Science, 2016, 37(17): 32-37. (in Chinese with English abstract)

嫩度是衡量肉品食用品质的重要指标,受肌原纤维和结缔组织的共同影响,而肌原纤维收 缩是造成嫩度下降的主要原因 [1]。肌原纤维是肌肉的伸缩装置,主要的蛋白质成分为肌动蛋白和肌球蛋白,肌动蛋白和肌球蛋白结合形成肌动球蛋白。Takahashi [2]和Wheeler [3]等研究指出由于肌动球蛋白的形成,使得宰后僵直期肌肉收缩,肌原纤维结构紧密,嫩度下降;而在解僵、成熟过程中,肌动蛋白和肌球蛋白的结合减弱,肌动球蛋白紧密结构遭到破坏,处于更易于解离的状态,嫩度增加。所以肌原纤维的变化一般与肌动球蛋白状态有关 [4],肌动球蛋白解离与肉品的嫩度密切相关。

一磷酸腺苷(adenosine 5’-monophosphate,AMP)是三磷酸腺苷的分解产物。AMP是一种内源性嘌呤核苷酸,是一种参与所有生命代谢的DNA和RNA的结构组件 [5]。近年来在食品加工中,AMP通常用在肉类和家禽汤作为增味剂(风味改性剂),或作为食品添加剂的特定营养目的 [6]。据Okitani等 [7]研究报道,用AMP处理从动物骨骼中提取的肌动球蛋白溶液,可检测到肌动蛋白的存在。邓少颖等 [4]使用AMP处理鸭肉后,发现AMP可显著促进肌动球蛋白的解离,进而改善肉的嫩度。

荧光分光光度法应用于蛋白质的测定是近年来新兴起的课题,测定蛋白质的自身荧光,利用外加物质使蛋白质自身荧光猝灭是荧光技术测定蛋白质和配体相互作用的一种很重要的方法 [8]。如程姗等 [9]使用同步荧光法测定生物样品中蛋白质的含量。Cui Fengling等 [10]应用荧光法进行了AMP与人血清白蛋白相互作用的研究。本实验采用荧光光度法研究AMP与肌动球蛋白之间的相互作用,根据不同温度下AMP与肌动球蛋白的相互作用光谱,推测探讨了猝灭机理,并计算出了AMP与肌动球蛋白的相关参数等重要信息及AMP对肌动球蛋白构象的影响,为解析AMP促进肌动球蛋白解离进而改善肉品嫩度提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉用麻鸭购自南京市农贸市场;实验用水为二次去离子水。

AMP、三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl) metyl aminomethane,Tris,超级纯) 美国Sigma公司;Weber-Edsall缓冲溶液(pH 7.2)、辣根过氧化物酶显色试剂盒 南京巴傲得生物科技有限公司;脱脂奶粉 内蒙古伊利集团;预染宽范围标准蛋白(分子质量大小范围14.4~116 ku) 加拿大Fermentas公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

台式冷冻离心机 德国Herolab公司;UV1102型紫外-可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司;FM-4 P-TCSPC型荧光分光光度计 法国Horiba Jobin Yvon公司;台式冷冻振荡器 太仓市华美生化仪器厂;M124A 电子分析天平 意大利BEL公司;Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直电泳系统、Semi-Dry转 印仪美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 肌动球蛋白的提取

取鸭肉胸大肌,去除表面肌膜、结缔组织等,切碎成肉糜待用。

取2 g肉糜溶于20 mL Weber-Edsall溶液中,12 000 r/min冰浴匀浆2 次,每次30 s。匀浆后将溶液置于冷冻振荡器内,4 ℃恒温振荡24 h。加两倍体积的蒸馏水,振荡,离心(4 ℃、12 000×g)20 min,取沉淀加入15 mL Tris-HCl溶液,搅拌均匀后用两层纱布过滤,调整溶液质量浓度为6 mg/mL,记作样品1 [11]

1.3.2 Western blotting法测定肌动球蛋白解离

样品处理:取2 mL样品1于6 支10 mL试管中,分别加入浓度为0(对照组)、8、16、24、32 mmol/L的AMP溶液,4 ℃静置反应24 h。每管取1 mL混合溶液,加入2 mL蒸馏 水稀释,反应振荡30 min,离心(4 ℃、15 000×g)20 min。取上清液0.2 mL,加入Weber-Edsall缓冲液0.4 mL,95 ℃加热5 min后待用。

Western blotting:由肌动蛋白的含量变化来观察肌动球蛋白的解离程度 [12]。采用变性不连续电泳,12%分离胶,5%浓缩胶(m(丙烯酰胺)∶m(甲叉双丙烯酰胺)=36.5∶1)。每孔等体积上样20 µL,200 V恒压约50 min。电泳结束后,将分离胶中所需蛋白条带切割下来并在转膜液中浸泡约15 min后,转印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,转印后的PVDF膜用Tris-HCl-吐温(Tris-HCl+Tween,TBST)(50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,体积分数0.05%吐温-20,pH 7.4)溶液漂洗3 次,每次5 min。然后将带有蛋白的PVDF膜用含有5 g/100 mL脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2 h,再漂洗3 次,每次5 min,后与一抗(一抗为抗兔骨骼肌肌动蛋白多克隆抗体,TBST溶液1∶1 000稀释)结合,4 ℃摇床孵育过夜,孵育结束后,TBST漂洗3 次,每次5 min。再与二抗(二抗为辣根过氧化酶连接的羊抗兔IgG, TBST溶液1∶5 000稀释)结合,室温摇床孵育2 h,将膜用TBST漂洗后使用DAB显色剂显色,显色后蒸馏水彻底冲洗停止反应,并使用凝胶成像仪拍照。

1.3.3 荧光光谱测定AMP与肌动球蛋白作用

取1 mL样品1于100 mL容量瓶中,以pH 7.2的Weber-Edsall缓冲溶液稀释,定容至刻度,摇匀。放置一段时间后,移取2 mL于比色皿中,加入1 mL AMP溶液,混合均匀。设定仪器温度分别为298 K和313 K,激发波长为285 nm,狭缝均为20.0 nm,恒温下扫描300~500 nm波长范围内的荧光发射光谱。

1.3.4 紫外光谱测定AMP与肌动球蛋白作用

取1 mL样品1于100 mL容量瓶中,以pH 7.2的Weber-Edsall缓冲溶液稀释,定容至刻度,摇匀。放置一段时间后,移取2 mL溶液于比色皿中,加入1 mL AMP溶液,混合均匀。扫描200~400 nm范围内的紫外吸收光谱。

1.3.5 同步荧光光谱测定AMP与肌动球蛋白作用

取1 mL样品1于100 mL容量瓶中,以pH 7.2的Weber-Edsall缓冲溶液稀释,定容至刻度,摇匀。放置一段时间后,移取2 mL于比色皿中,加入1 mL AMP溶液,混合均匀。在荧光分光光度计中,改变发射波长λ em与激发波长λ ex之间的波长差Δλ,λ em=λ ex+Δλ,令发射波长在200~500 nm范围内扫描,得到肌动球蛋白与不同浓度AMP的混合液中色氨酸色团和酪氨酸色团的荧光光谱图。

2 结果与分析

2.1 AMP对肌动球蛋白解离的影响

图1 肌动球蛋白解离的Western blotting电泳
Fig. 1 Western blotting of dissociated actomyosin

由图1可知,在298 K条件下,采用8、16、24、32 mmol/L的AMP处理组的肌动球蛋白条带含量均明显高于对照组,随着AMP浓度升高,各条带变化明显,证明AMP可以促进肌动球蛋白的解离。

2.2 荧光光谱特征

2.2.1 AMP对肌动球蛋白的荧光光谱的影响

图2 AMP对肌动球蛋白的荧光猝灭光谱
Fig. 2 Effect of AMP on fluorescence spectra of actomyosin

蛋白质的荧光猝灭是荧光物质与蛋白质分子间相互作用从而导致荧光强度下降的过程,导致蛋白质分子荧光强度降低的荧光物质称为猝灭剂。蛋白质中由于氨基酸残基的存在而具有内源荧光 [13-14]。图2为温度298 K时的肌动球蛋白荧光光谱图,实验中固定肌动球蛋白的浓度不变,AMP的浓度逐渐增大。在300~500 nm范围内,随着AMP浓度的增加,肌动球蛋白的荧光强度逐渐减小,最大发射波长有明显的红移,∆λ=26.5 nm。由于AMP本身并无荧光,说明AMP作为猝灭剂,在与肌动球蛋白作用的过程中对肌动球蛋白的荧光有猝灭作用 [15]

2.2.2 荧光猝灭机理的确定

蛋白质的荧光猝灭过程分为静态猝灭和动态猝灭,静态猝灭是生成配合物的过程,而动态猝灭是分子间碰撞的过程。由于猝灭过程和温度变化关系密切,所以一般情况下,可以通过改变温度来判断荧光猝灭的类型。一方面,升高温度会降低静态猝灭中形成的配合物的稳定性,使分子间的作用力减弱,荧光猝灭常数会随温度的升高而减小。另一方面,动态猝灭过程中的有效碰撞、电子的转移会随温度的升高加剧,所以荧光猝灭常数会随温度的升高而增大。

首先假定AMP与肌动球蛋白的结合为动态猝灭过程,分别测定温度298 K和313 K、pH 7.2时AMP与肌动球蛋白的荧光光谱。并用Stern-Volmer动态猝灭方程 [16-17]进行处理。

式中:[Q]为猝灭剂(AMP)的浓度/(mol/L);K q为动态猝灭过程中荧光物质与猝灭剂的猝灭速率常数(最大扩散速率常数为2.0×10 10L/(mol·s))/(L/mol·s);K sv为动态猝灭常数/(L/mol);τ 0为无猝灭剂存在时荧光分子的平均寿命(τ 0=10 -8s);F 0和F分别为AMP加入前后肌动球蛋白的荧光强度。

根据Stern-Volmer方程,以AMP浓度为横坐标,F 0/F为纵坐标,作肌动球蛋白荧光的Stern-Volmer曲线,结果见图3。所得方程中猝灭常数及相关系数见表1。

图3 不同温度时AMP对肌动球蛋白的Stern-Volmer 曲线
Fig. 3 Stern-Volmer plots for fluorescence quenching actomyosin by AMP at various temperatures

由图3可知,在同一温度条件下,增大AMP的浓度,对肌动球蛋白的荧光猝灭效应不断增大,这与荧光猝灭光谱图的结论相吻合;另外升高温度,AMP对肌动球蛋白的猝灭曲线的斜率降低,即K sv(动态猝灭常数)随温度的升高而减小。由此可以初步推断结合方式不是动态猝灭,而是生成了复合物的静态猝灭过程 [15]

表1 不同温度下AMP与肌动球蛋白相互作用的Stern-Volmer猝灭常数及相关系数
Table 1 Stern-Volmer quenching constants and correlation coefficients for AMP-actomyosin system at different temperatures

pHT/KK sv/(L/mol)(mol·s))R相对标准偏差/% 7.22988.70×10 28.703×10 100.998 35.01 3134.07×10 24.071×10 100.995 97.95 K q/(L/

K q值大于最大扩散速率常数时,判断该猝灭过程为静态猝灭 [18]。由表1可知,不同温度条件下K q的值均大于2.0×10 10L/(mol·s),结合K sv值随温度升高而减小和荧光猝灭光谱图出现的红移,说明AMP对肌动球蛋白的猝灭方式不是由于动态碰撞而引其的动态猝灭,而是形成复合物的静态猝灭 [18],作用中的荧光能量转移应属于非辐射能量转移 [19]

在静态猝灭中,结合常数K LB和结合位点数n的相互关系可由Lineweaver-Burk双倒数函数得到,Lineweaver-Burk双倒数方程 [20]为:

以猝灭剂(AMP)浓度的对数为横坐标,(F 0/F-1)的对数为纵坐标,作肌动球蛋白荧光猝灭的双倒数曲线。

图4 不同温度时AMP对肌动球蛋白的Lineweaver-Burk双倒数曲线
Fig. 4 Lineweaver-Burk plots for AMP-actomyosin interaction at various temperatures

由图4可知,图线有较好的线性关系,且温度变化、斜率变化不大,说明结合较为稳定。求得双倒数方程,298、313 K温度条件下AMP与肌动球蛋白的结合常数K LB分别为9.253×10 2L/mol和3.142×10 2L/mol,K LB值较大,可以推断AMP和肌动球蛋白之间存在较好的结合力。

在热力学中,不同的物质与蛋白质分子间的作用力不同,主要有疏水相互作用、氢键作用力、范德华力和静电引力等。一定条件下,结合反应能否自发进行取决于体系的ΔG,ΔG<0有利于反应的自发进行 [21]

根据热力学方程(3)~(5)可以求得相关参数(表2)。

式中:ΔG为自由能变/(kJ/mol);ΔH为焓变/(kJ/mol);ΔS为熵变/(J/(mol·K));R为气体常数8.314 J/(mol•K);K LB为结合常数/(L/mol);T为温度/ K;K 1、K 2分别为T 1、T 2温度条件下的结合常数/(L/mol)。

表2 不同温度下AMP与肌动球蛋白结合的相应常数及方程相关系数
Table 2 Relevant constants and correlation coefficients at different temperatures for AMP-actomyosin s ystem

pHT/KK LB/ ΔS/(J/(mol·K))7.22989.253×10 20.992 9-1.418×10 35.98×10 280.694 3133.142×10 20.972 3-1.922×10 3(L/mol)nΔG/(kJ/mol)ΔH/(kJ/mol)

由表2可知,ΔG<0,说明AMP和肌动球蛋白的结合反应是一个自发进行的过程。又ΔH>0,ΔS>0,n≈1,推测AMP与肌动球蛋白结合的主要作用力为疏水作用力,近似形成一个结合位点 [22]

2.3 AMP对肌动球蛋白的紫外吸收光谱的影响

紫外光谱法在蛋白质与配体相互作用研究中可用来研究荧光猝灭的机制。当有配体结合在蛋白上,就会使得蛋白质在波长280 nm左右的特征吸收峰发生改变,而最终配体与蛋白作用的发生与否可通过吸收峰的峰形以及峰位的改变来判断 [23]

分别扫描一定浓度的AMP和肌动球蛋白溶液,其紫外吸收光谱见图5。

图5 AMP及肌动球蛋白的紫外吸收光谱
Fig. 5 UV spectra of actomyosin and its complex with AMP

由图5可知,肌动球蛋白在278 nm波长处有一个特征吸收峰,该吸收峰主要是由于蛋白质肽链上色氨酸和酪氨酸的芳杂环π→π*跃迁的结果 [24]。当0.2 mmol/L的AMP加入后,278 nm波长处的吸收峰明显增高,且吸收蓝移至260 nm。说明AMP诱导肌动球蛋白分子,使其内部包裹的氨基酸残基裸露出来,肌动球蛋白的构象发生改变。进一步说明AMP与肌动球蛋白之间发生了相互作用,形成了较为稳定的配合物,其猝灭机理为静态猝灭,这也符合荧光光谱研究的结果 [25]

2.4 AMP对肌动球蛋白同步荧光的影响

猝灭剂作用于蛋白质,不仅使蛋白质内源荧光降低,还可能作用于其他氨基酸残基,使氨基酸残基构象和所处微环境发生变化。通过了解氨基酸残基环境的变化,同步荧光光谱可以进一步了解分子对蛋白质构象的影响。当Δλ为15、60 nm时,可以分别测得酪氨酸和色氨酸的同步荧光光谱 [21]。氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境的极性有关,发射波长的红移表示猝灭剂的加入使得环境的疏水性降低,肽链趋向伸展状态,蓝移则相反,大分子趋向于折叠状态 [26]

图6 AMP与肌动球蛋白相互作用的同步荧光光谱
Fig. 6 Synchronous fluorescence spectra of actomyosin in the absence and presence of AMP

由图6可知,随着AMP浓度的升高,酪氨酸残基和色氨酸残基的荧光强度都有所降低,产生的最大荧光强度相似。且AMP对酪氨酸的荧光仅有猝灭作用(图6a),而对于色氨酸残基来说,不仅荧光强度猝灭明显,最大发射波长也发生了红移,表明AMP的加入使得色氨酸微区的疏水性降低(图6b) [27]

结合荧光猝灭光谱图看,AMP几乎不改变酪氨酸的最大发射波长,却使肌动球蛋白和色氨酸的最大发射波长红移,说明AMP与肌动球蛋白的结合,几乎不影响酪氨酸微区的构象。AMP作用于肌动球蛋白时,发生作用的结合位点可能更接近色氨酸残基微区,使该微区环境肽链伸展程度增大,从而影响整个肌动球蛋白的疏水腔的疏水环境 [28]

3 结 论

研究结果表明,AMP可使肌动球蛋白解 离,随着AMP浓度的增高,肌动球蛋白的解离明显。荧光光谱分析表明,AMP促进肌动球蛋白解离是因为两者之间形成了复合物,两者结合使肌动球蛋白的内源荧光发生了有规律的猝灭,猝灭以静态猝灭为主。结合反应中ΔG<0,ΔH>0,ΔS>0,故两者之间结合是一个自发进行的过程,主要通过疏水相互作用结合,且AMP的存在使得肌动球蛋白的构象发生变化,疏水环境极性降低。

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Fluorescence Spectroscopic Study of the Molecular Interaction between Adenosine 5’-Monophosphate and Actomyosin

ZHANG Miao 1,2, WANG Daoying 1,*, ZHANG Muhan 1, YANG Yuling 2, BIAN Huan 1, WU Haihong 1, ZHU Yongzhi 1, GENG Zhiming 1, XU Weimin 1,3
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210046, China; 3. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Quality and Safety Control, Nanjing 210095, China)

Abstract:Objective: To study the interaction between adenosine 5’-monophosphate (AMP) and actomyosin by fluorophotometry. Methods: Based on the correlation between intermolecular interaction and related thermodynamic parameters, as well as enthalpy change (ΔH) and entropy change (ΔS) for their interaction, the fluorescence quenching mechanism of actomyosin by AMP was discussed. Quenching constant, binding equilibrium constant and the number of binding sites were determined. The effect of AMP on the conformation of actomysin was also analyzed using synchronous fluorescence spectrometry. Results: Western blotting demonstrated the promotion effect of different concentrations of AMP on the dissociation of actomyosin; the combination between them were mainly via hydrophobic interaction, since ΔG < 0, ΔH > 0, ΔS > 0 were found in the binding reaction of AMP and actomyosin, and the presence of AMP changes the conformation of actomyosin, reduce the polar of hydrophobic environment; Fluorescence spectroscopy showed that the combination of AMP and actomyosin makes the regular quenching of intrinsic fl uorescence of actomyosin. At 298 K and 313 K, the K SVof combination were 8.70 × 10 2and 4.07 × 10 2L/mol, K LBwere 9.253 × 10 2L/mol and 3.142 × 10 2L/mol respectively. Conclusion: Different concentrations of AMP can promote the dissociation of actinmyosin as demonstrated by Western blotting.

Key words:actomyosin; adenosine 5’-monophosphate; fl uoresence quenching; dissociation

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617006

中图分类号:TS251.68

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)17-0032-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617006. http://www.spkx.net.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617006. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2015-10-16

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31571863)

作者简介:张淼(1991—),女,硕士研究生,研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail:zhangmiao_0729@163.com

*通信作者:王道营(1979—),男,副研究员,博士,研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail:wdy0373@aliyun.com

引文格式: