伍伟健，董洁娴，饶美芳，詹屋强，王 弘*，孙远明
（广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）
摘 要：采用重叠延伸的方法成功将抗孔雀石绿（malachite green，MG）单克隆细胞的轻链VL和重链VH用连接肽(Gly 4Ser) 3连接，形成单链抗体（single chain variable fragment，scFv）基因，并将其酶切连接进入含有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，PhoA）基因的载体plip6/GN中，成功构建重组质粒plip6/GN-MG-scFv。随后重组质粒转入大肠杆菌BL21，经诱导表达后，十 二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting鉴定结果表明所获得的融合蛋白scFv-PhoA大小约72 kD。利用scFv与MG特异性结合的活性和PhoA催化对硝基苯磷酸二钠的显色机制，经过直接竞争酶联免疫吸附法测定融合蛋白scFv-PhoA的IC 50为9.81 ng/mL。本方法操作简单、灵敏度高且检测时间短，这为进一步进行MG免疫法快速检测提供了参考。
关键词：孔雀石绿；单链抗体；碱性磷酸酶；融合表达；直接竞争酶联免疫吸附法
伍伟健, 董洁娴, 饶美芳, 等. 抗孔雀石绿单链抗体-碱性磷酸酶融合表达和活性鉴定[J]. 食品科学, 2016, 37(17): 121-126.
WU Weijian, DONG Jiexian, RAO Meifang, et al. Fusion expression and characterization of single chain antibody against malachite green-alkaline phosphatase[J]. Food Science, 2016, 37(17): 121-126. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201617020. http://www.spkx.net.cn
孔雀石绿（malachite green，MG）是一种禁止使用的水产添加物。它在水生生物中残留时间长、毒性强，对人体具有致癌、致畸和致突变等副作用 [1-3]。很多国家已严令禁止其添加使用于水产生物中。但是，因其抑菌作用好、价格便宜，违禁乱用的现象仍时有发生。为有效控制其滥用情况，有必要对其进行持续的监控检测。
免疫检测方法具有快速、灵敏的特点，是一种高通量的筛选手段 [4-6]。其中，制备高质量的抗体是关键 [7]。作为第三代抗体——基因工程抗体，其具有制备周期短、花费少的优点。此外，基因工程抗体可对序列进行分析、修饰、突变以改进抗体亲和力 [8-10]，突破以往仅局限于半抗原分子设计的限制 [11]，具有更多的灵活性。因此，基因工程重组抗体逐渐成为各国科研学者研究的重点 [12-16]。
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，PhoA）是免疫检测中常用的标记酶之一。目前已有不少学者报道将重组抗体与PhoA融合表达，利用PhoA的显色活性，将其应用于酶联免疫检测方法中 [17-19]，可以避免使用二抗，减少操作步骤，更加经济省时。
本研究拟进行抗MG单链抗体（single chain variable fragment，scFv）和PhoA融合蛋白的制备、表达和活性鉴定——从分泌抗MG抗体的单克隆细胞中，扩增抗体重链可变区（variable region of heavy chain，简称VH）基因和轻链可变区（variable region of light chain，简称VL）基因，利用重叠延伸聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的方法将VH和VL用连接肽(Gly 4Ser) 3连接，酶切连接进入载体plip6/GN，转化进入大肠杆菌BL21融合表达scFv-PhoA，利用PhoA的显色机制鉴定重组蛋白的活性，从而为后续建立基于基因工程抗体的MG快速免疫检测方法提供参考。
1.1 材料与试剂
抗MG单克隆杂交瘤细胞株由广东省食品质量安全重点实验室制备；plip6/GN载体和大肠杆菌BL21由广东省食品质量安全重点实验室保存。
plip6/GN载体包含有一个PhoA基因，在其前面有酶切位点SfiⅠ和NotⅠ，通过这两个酶切位点可以将目的片段连接进入载体，并且在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导下，tac启动子能够使目的片段和PhoA融合表达 [17,20]。
Trizol试剂 日本TaKaRa公司；cDNA第一链合成试剂盒 美国Promega公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶 美国Thermo公司；质粒提取试剂盒、DNA切胶回收试剂盒 天根生化科技有限公司；抗PhoA抗体 美国Sigma公司；引物由上海Invitrogen公司合成。
1.2 仪器与设备
PCR扩增仪、GDS7500型凝胶成像系统、半干转印仪 美国Bio-Rad公司；5417R台式高速冷冻离心机德国Eppendorf公司；SW-CJ-IF型净化工作台 苏州净化设备厂；Multiskan MK3酶标仪 美国Thermo公司。
1.3 方法
1.3.1 RNA的提取
将培养好的约1×10 7个/mL杂交瘤细胞液于2 000 r/min离心2 min，弃上清后加入2 mL Trizol试剂，将此溶液各1 mL分装在两个1.5 mL无RNAase的离心管中，分别加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置3 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min（样品会分为3 层，上层水相含RNA、中间为蛋白质和DNA复合物、下层为有机相），小心吸取上层溶液，放到新的1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃、5 000 r/min离心5 min，弃上清液，干燥沉淀，用焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）处理过的无菌水溶解。
1.3.2 VH和VL基因片段的扩增
cDNA第一链的合成按照试剂盒说明书进行。VH、VL基因的扩增：参考Krebber等 [21]设计的引物，将轻链上下游引物和重链上下游引物一一配对，进行PCR反应。PCR反应体系如下：分别取cDNA第一链反应物2 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、VH（或VL）上下游引物各1 μL、无菌纯水37 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 个循环，72 ℃延伸10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳及DNA凝胶回收纯化，连接到T载体上测序。将测序结果上传至IMGT网站进行分析 [22]。
1.3.3 scFv的构建
根据分析后的VH和VL序列设计引物（表1）。用引物VH-back和VH-linker、VL-linker和VL-for分别扩增VH和VL，PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环，最后72 ℃延伸10 min，获得带有酶切位点和Linker的PCR产物VH和VL。再将两者以质量比1∶1混合，加入包含有dNTP、Pfu酶的反应体系中，PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，9 个循环，最后72 ℃延伸10 min。直接以此PCR产物为模板，以VH-back和VL-for为引物进行扩增，反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环，最后72 ℃延伸10 min。将PCR产物连接到T载体上，测序验证。
表1 重叠延伸PCR引物序列
Table 1 Primers used for overlap extension PCR
注：划横线部分为酶切位点。
引物序列（5’→3’）VH-back GTGGCATCGCGGCCGCACGTTTTATTTCCAACTTTG TAGTGCGGCCCAGCCGGCCGATGTAAAGCTTCAGGAGTC VH-linkerGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCGAGGAGACGGTGACTGAGGT VL-linkerGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTTCTCAACCAGTC VL-for
1.3.4 表达质粒plip6/GN-MG-scFv构建
用引物VH-back和VL-for扩增测序成功的scFv基因。用 Sfi Ⅰ和 NotⅠ限制性内切酶对PCR产物的scFv基因片段进行双酶切，用T4 DNA连接酶将酶切后的scFv基因和用同样的酶处理过的载体plip6/GN（图1）进行连接，并将连接产物转化进入大肠杆菌BL21。挑克隆菌落进行PCR验证，并测序鉴定。
图1 重组质粒构建流程
Fig. 1 Schematic diagram of recombinant plasmid construction
1.3.5 重组蛋白的表达、鉴定
重组蛋白表达：挑取单菌落，接种到5 mL的2×YT培养基（含50 μg/mL氨苄青霉素）中，37 ℃、250 r/min培养过夜。次日，以2%的接种量转接到100 mL的2×YT培养基（含50 μg/mL氨苄青霉素）中，37 ℃、250 r/min培养，直至光密度（OD 600 nm）值为0.8～1.0，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，28 ℃、250 r/min培养6 h，离心，收集上清液和沉淀。
重组蛋白鉴定：用冷冻法提取周质蛋白 [23]。对表达的scFv进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和Western blotting鉴定，Western blotting的抗体采用鼠源的抗PhoA抗体。
1.3.6 重组蛋白的活性鉴定（竞争酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法）
用碳酸盐溶液（pH 9.0）稀释包被原MG-卵白蛋白（ovalbumin，OVA）（MG与OVA偶联）至1 μg/mL，每孔加入100 μL，37 ℃孵育12 h。洗涤两次后，每孔加入120 μL含质量分数5%的脱脂奶粉的封闭液，37 ℃封闭3 h。弃封闭液后，每孔加入50 μL不同质量浓度的MG标准物，随后每孔再加入一定质量浓度的重组抗体scFv-PhoA 50 μL，37 ℃放置1 h。洗涤5 次后，加入PhoA底物对硝基苯磷酸二钠，37 ℃放置30 min。最后加入100 μL 3 mol/L氢氧化钠终止反应，在405 nm波长处测定吸光度。根据MG的不同质量浓度和其对应的吸光度，用Origin 8.5软件可以拟合出一条曲线，并且计算出MG的半抑制浓度（IC 50）（半抑制浓度定义为最大吸光度下降50%时对应的标准品质量浓度）。
2.1 VH和VL基因片段的扩增结果
将引物以一对一配对的形式，分别进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。抗体VH和VL的可变区基因大小约300 bp，因此将PCR产物凝胶电泳在300 bp出现的条带切胶回收，并将其分别连接T载体，依次测序，
并将序列上传至IMGT网站进行比对分析，确定合适的序列VH（351 bp）和VL（327 bp）（图2）。
图2 VH（a）和VL（b）的碱基序列和氨基酸序列
Fig. 2 Sequences of DNA and amino acids for VH (a) and VL (b)
2.2 重组质粒plip6/GN-MG-scFv的构建
根据分析的序列，设计重叠延伸PCR引物（表1），将VH和VL用连接肽(Gly 4Ser) 3连接起来。先用分别带有酶切位点和连接肽的引物（VH-back和VH-linker、VL-linker和VL-for）对VH和VL基因分别进行PCR扩增，获得带有酶切位点和部分Linker序列的PCR产物（图3泳道1、2）。将PCR产物以质量比1∶1的形式混合，进行9 个循环的PCR，VH和VL的第一轮PCR产物会利用互补序列，互为模板，进行少量扩增。最后，再加入引物VH-back和VL-for，以第二轮PCR产物为模板，进行扩增，获得带有酶切位点的全长scFv序列（图3泳道3）。用Sfi Ⅰ和 NotⅠ限制性内切酶将第三轮的PCR产物进行双酶切，连接到载体plip6/GN，转化进入大肠杆菌BL21。测序结果证明，重组质粒plip6/GN-MG-scFv构建成功。
图3 重叠延伸PCR产物电泳结果
Fig. 3 Electrophoregram of overlap extension PCR products
2.3 重组蛋白scFv-PhoA的表达鉴定
挑测序成功的单菌落，进行IPTG诱导表达，提取周质蛋白，并进行SDS-PAGE和Western blotting的分析。根据序列预测，scFv-PhoA融合蛋白分子质量约为72 kD。如图4a所示，泳道2（诱导周质蛋白）上在70～100 kD之间有一条带，而作为对照的泳道1（未诱导的周质蛋白）没有，初步判定这是表达的目的蛋白。为进一步验证，对样品进行Western blotting鉴定，抗体使用鼠源的抗PhoA抗体，二抗使用标记辣根过氧化物酶的羊抗鼠抗体，经过二氨基联苯胺（辣根过氧化物酶底物）显色液显色，泳道2出现明显的单一条带（图4b），而泳道1（图4b）未诱导的周质蛋白未出现条带，显然重组蛋白表达成功。
图4 重组蛋白SDS-PAGE（a）和Western blotting（b）结果
Fig. 4 Electrophoregram (a) and Western blotting pattern (b)
2.4 重组蛋白活性鉴定结果
通过固定的包被原MG-OVA和游离的MG对scFv-PhoA蛋白进行竞争，包被原的浓度固定，游离的MG质量浓度越高，结合在包被原上的scFv-PhoA蛋白越少，通过PhoA催化的底物反应越少，吸光度越低。
根据MG的不同质量浓度和其对应的吸光度，以质量浓度为横坐标，A/A 0值（A 0是MG质量浓度为0 ng/mL时的吸光度，A为MG某一质量浓度下的吸光度）为纵坐标，用Origin 8.5软件可以拟合出一条曲线（图5），并计算IC 50（A/A 0=0.50）值，以IC 50值反映方法的灵敏度，IC 50值越小，灵敏度越高 [24]。由图5可知，随着MG质量浓度的增加，A/A 0值均呈显著下降趋势，表明包被原MG-OVA和游离的MG都能与scFv-PhoA蛋白特异性结合。Origin 8.5软件拟合结果显示，IC 50值为9.81 ng/mL，最低检测限为1.34 ng/mL，表明根据scFv-PhoA建立的竞争ELISA法有较好的灵敏度。
和单克隆抗体抑制曲线（图5）的IC 50值（3.27 ng/mL）相比，scFv的灵敏度略有下降，可能是scFv和抗原的亲和力发生改变所致。Kramer等 [25]对基因工程抗体亲和力改变的原因进行过讨论，可能是因为基因工程抗体（scFv或者Fab）是单价的（一价位为一个抗原结合位点），而单克隆抗体（双价的IgG、四价的IgA和十价的IgM）都是多价的。基因工程抗体的抗原结合位点的减少导致了亲和力的改变。
虽然与对应的单抗相比，scFv灵敏度略有下降，但是scFv能在大肠杆菌中表达，无需细胞培养，可节约成本和大量生产时间，而亲和力则可通过后续基因的修饰、突变进行改进。因此，在免疫检测中，基因工程抗体仍然具有很大的研究价值。
而本研究另一个创新点是将scFv和PhoA融合表达成为一个蛋白，当竞争反应完毕，就可以直接利用PhoA的催化活性进行显色反应，无需加入二抗这一步骤，全过程反应时间约80 min，与普通单抗的间接竞争ELISA（约需130 min [19]）相比，操作步骤更简单，用时更短，为进一步进行MG免疫法快速检测提供了参考。
图5 单克隆抗体抑制曲线
Fig. 5 Standard inhibition curves
本研究成功地克隆出抗MG单克隆抗体的VL和VH可变区基因，并用重叠延伸的方法和酶切方法成功构建含有PhoA基因的重组质粒plip6/GN-MG-scFv。诱导表达，获得融合蛋白scFv-PhoA，利用SDS-PAGE和Western blotting法鉴定重组蛋白的表达，用直接竞争ELISA法鉴定重组蛋白的活性。实验结果表明，融合蛋白scFv-PhoA与MG具有良好的结合活性，为以后建立更省时的ELISA快速检测法提供了参考。
基于scFv-PhoA，不仅可以建立“一步法”直接竞争ELISA，且可以通过酶的显色反应，搭建一种新的快速检测试纸条。相比于酶标抗体，scFv-PhoA融合蛋白具有以下两方面优势：1）使用工程菌基因工程抗体的制备周期短、成本低，利于市面上产品的推广；2）在抗体制备过程中，scFv与PhoA融合表达，省却酶标记抗体步骤，使试纸条的制备更快捷。
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Fusion Expression and Characterization of Single Chain Antibody against Malachite Green-Alkaline Phosphatase
WU Weijian, DONG Jiexian, RAO Meifang, ZHAN Wuqiang, WANG Hong*, SUN Yuanmi ng
(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, Guangzhou 510642, China)
Abstract：The variable light and heavy chain genes from anti-malachite green (MG) monoclonal cells were cloned and linked with peptide (Gly 4Ser) 3to construct a single chain variable fragment (scFv) antibody gene. The gene was inserted into the vector plip6/GN containing alkaline phosphatase (PhoA) gene to construct the recombinant plasmid plip6/GN-MG-scFv. After the induction of E. coli BL21 containing the recombinant plasmid with isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG), the protein from the periplasm was detected by SDS-PAGE and Western blotting. The results demonstrated that the fusion protein scFv-PhoA (about 72 kD) was expressed successfully. A one-step enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed (IC 50= 9.81 ng/mL) by using scFv-PhoA fusion protein with disodium 4-nitrophenyl phosphate (pNPP) as the substrate. These results demonstrate that fusion protein scFv-Ph oA can be a homologous reagent which simplifi es and accelerates the detection of malachite green.
Key words：malachite green; single chain antibody; alkaline phosphatase; fusion expression; direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201617020
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）17-0121-06
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201617020. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-03-09
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31271866）；广东省自然科学基金项目（2014A030311043）；
广东省科技计划项目（2014A050503059）
作者简介：伍伟健（1990—），男，硕士研究生，研究方向为食品安全。E-mail：wwjxdy@163.com
*通信作者：王弘（1973—），女，教授，博士，研究方向为食品安全。E-mail：gzwhongd@163.com
引文格式：