八公山腐乳酿制过程中毛霉和根霉的前期发酵比较研究

李 顺 1,顾永忠 2,杨 英 3,陈小举 4,郑 志 1,吴学凤 1,孙 婷 1,姜绍通 1,李兴江 1,*

(1.合肥工业大学生物与食品学院,安徽 合肥 230009;2.安徽八公山豆制品有限公司,安徽 淮南 232200;3.安徽建筑大学环境与能源工程学院,安徽 合肥 230601;4.巢湖学院化学与材料工程学院,安徽 巢湖 238000)

摘 要:八公山腐乳前期发酵工艺对其总体风味具有重要影响,围绕腐乳酿制中常用的总状毛霉(Mucor racemosus)和米根霉(Rhizopus oryzae)开展工艺探索具有重要意义。在单因素试验的基础上,选取发酵时间、发酵温度和接种量为影响因子,以蛋白酶活力为评价指标,采用响应面法优化总状毛霉和米根霉发酵腐乳的前期发酵条件,比较最优条件下二者前期发酵分泌酶系和氨基酸。研究结果表明总状毛霉的前期发酵条件为:发酵时间60 h、发酵温度24 ℃、接种量1.0×10 5CFU/mL,此时分泌产蛋白酶活力为42.79 μg/mL;米根霉的前期发酵条件为:发酵时间50 h、发酵温度32 ℃、接种量1.0×10 5CFU/mL,此时分泌产蛋白酶活力为33.51 μg/mL。通过对二者前期发酵的情况比较分析可知:总状毛霉发酵前期产物中蛋白酶活力高于米根霉,而淀粉酶、糖化酶、脂肪酶活力低于米根霉。总状毛霉发酵产物的氨基酸总量高于米根霉,但其中呈味氨基酸和疏水氨基酸差别不大。两种菌的前期发酵互有优势,为协同作用提供了一定的理论依据。

关键词:豆腐乳;前期发酵;总状毛霉;米根霉;氨基酸

李顺, 顾永忠, 杨英, 等. 八公山腐乳酿制过程中毛霉和根霉的前期发酵比较研究[J]. 食品科学, 2016, 37(17): 163-168.

LI Shun, GU Yongzhong, YANG Ying, et al. Comparative study of pre-fermentation with Mucor racemosus and Rhizopus oryzae in Bagongshan sufu during fermentation[J]. Food Science, 2016, 37(17): 163-168. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617027. http://www.spkx.net.cn

豆腐乳是在豆腐的基础上发展起来的大豆制品 [1]。豆腐乳发酵是以豆腐为原料,经前期发酵、腌制、后期发酵而成的大豆制品 [2-4]。豆腐乳前期发酵就是在豆腐坯上接种霉菌或者细菌,培养一段时间后,豆腐坯上长满菌丝,从而形成细致坚韧的皮膜并分泌产一系列酶 [5-8]。豆腐乳酿造过程的主要生化变化就是利用菌种发酵分泌产生蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶等酶系,分解豆腐中的蛋白质、淀粉、脂肪等并产生风味物质 [9-11]。前期发酵的好坏,直接影响豆腐乳块形的完整以及能否分泌产生大量酶系,从而影响豆腐乳的品质 [12-13]

目前腐乳工业化生产用的毛霉和根霉主要为:毛霉有五通桥毛霉、腐乳毛霉、总状毛霉和雅致放射毛霉;根霉有米根霉和少孢根霉等 [14-15]。本研究主要结合安徽地方特色食品——八公山腐乳,通过总状毛霉和米根霉的前期发酵条件优化,对二者前期发酵的情况,包括发酵条件、发酵分泌产酶系和氨基酸直观分析进行比较,从而对总状毛霉和米根霉的发酵优劣进行直观评价,以期为豆腐乳的研究和生产提供理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料、菌种与试剂

豆腐 安徽八公山豆制品有限公司。

总状毛霉(Mucor racemosus CICC40481) 中国工业微生物菌种保藏中心;米根霉(Rhizopus oryzae)合肥工业大学农产品加工研究院保藏菌种。

福林-酚试剂 上海振企化学试剂有限公司;磷酸氢二钠(分析纯) 天津市四友精细化学品公司;氯化钠、磷酸二氢钠、干酪素、碳酸钠、三氯乙酸、乙酸钠、氢氧化钠(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HH.B11420-BS型电热恒温培养 上海跃进医疗器械厂;SWO-CJ-1F超净工作台 苏静集团泰安公司;721G紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器公司;手提式压力蒸汽灭菌器 宁波开普电子仪表有限公司;L8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化和孢子悬液的制备 [16]

将总状毛霉和米根霉分别接种于PDA斜面,分别置于26 ℃和30 ℃培养5 d,置于4 ℃冰箱保存,使用前向斜面加入20 mL无菌水冲洗,并用接种环刮划,充分振荡,用4层擦镜纸过滤至三角瓶中,通过血球计数板计数并调节孢子悬液浓度。孢子悬液现配现用。

1.3.2 豆腐毛坯的制备

分别将总状毛霉和米根霉的孢子悬液均匀喷洒在豆腐白坯上,在适宜温度条件下培养一段时间,制得豆腐乳毛坯,测定酶活力。

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 蛋白酶活力的测定 [17]

采用福林-酚法测定,40 ℃、pH 7.2条件下,1 min水解酪蛋白产1 μg酪氨酸所需要的酶量,定义为1 个酶活力单位。

1.3.3.2 糖化酶活力的测定 [18]

采用碘量法测定,40 ℃、pH 4.6条件下,1 h分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖所需的酶量,定义为1 个酶活力单位。

1.3.3.3 脂肪酶活力的测定 [19]

采用聚乙烯醇-橄榄油乳化液水解滴定法进行测定,将在40 ℃、pH 7.5条件下,1 min水解底物产生1 μmol可滴定的脂肪酸所需要的酶量,定义为1 个酶活力单位。

1.3.3.4 α-淀粉酶活力的测定 [20]

采用3,5-二硝基水杨酸法进行测定,在40 ℃、pH 5.6条件下,1 min水解淀粉产1 μg麦芽糖所需要的酶量,定义为1 个酶活力单位。

1.3.3.5 氨基酸含量的测定 [21-25]

将腐乳坯样品进行冷冻干燥成均匀粉末,称取样品1 g,加入25 mL蒸馏水超声30 min,取悬浊液0.5 mL,加入8%的磺基水杨酸1.5 mL,静置10 min后,于12 000 r/min离心10 min,取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤后上机检测。氨基酸含量以每100 g腐乳中氨基酸的质量计,单位为g/100 g。

1.3.4 前期发酵条件优化

以发酵时间(总状毛霉和米根霉同为36、48、60、72、84 h)、发酵温度(总状毛霉22、24、26、28、30 ℃;米根霉28、30、32、34、36 ℃)、接种量(总状毛霉和米根霉孢子悬液浓度同为1.0×10 7、1.0×10 6、1.0×10 5、1.0×10 4、1.0×10 3CFU/mL)为单因素,发酵产蛋白酶活力为指标进行单因素试验,在单因素试验结果的基础上设计响应面试验优化前期发酵。

2 结果与分析

2.1 前期发酵单因素试验结果分析

2.1.1 发酵时间对蛋白酶活力的影响

图1 发酵时间对总状毛霉和米根霉前期发酵分泌蛋白酶活力的影响
Fig. 1 Effect of fermentation time on protease activity

将霉菌孢子悬液以喷洒的方式均匀接种至豆腐乳坯上,选定接种量为1.0×10 6CFU/mL的孢子悬液1 mL、总状毛霉发酵温度26 ℃、米根霉发酵温度30 ℃,考察不同发酵时间对总状毛霉和米根霉前期发酵分泌蛋白酶活力的影响,结果如图1所示。由图1可知,二者都在60 h时分泌蛋白酶活力达到最大值,分别为40.09 μg/mL和29.53 μg/mL。在60 h内,随着发酵时间的延长,由于霉菌开始大量生长繁殖,分泌产蛋白酶活力不断增加。发酵时间超过60 h之后,蛋白酶活力开始下降,发酵时间达到84 h后开始出现异味。二者发酵分泌产蛋白酶活力随时间变化的趋势基本一致,但是总状毛霉发酵产蛋白酶活力比米根霉高。

2.1.2 发酵温度对蛋白酶活力的影响

图2 发酵温度对总状毛霉和米根霉前期发酵分泌蛋白酶活力的影响
Fig. 2 Effect of fermentation temperature on protease activity

将霉菌孢子悬液以喷洒的方式均匀接种至豆腐坯上,选定接种量为1.0×10 6CFU/mL的孢子悬液1 mL、发酵时间72 h,考察不同发酵温度对总状毛霉和米根霉前期发酵分泌蛋白酶活力的影响,结果如图2所示。二者发酵的温度条件虽然相差比较大,但是发酵分泌蛋白酶活力随温度变化趋势基本一致,温度过高或者过低都会影响霉菌的生长繁殖,导致蛋白酶活力偏低。总状毛霉生长温度较米根霉而言偏低,而前者的蛋白酶活力较后者偏高,总状毛霉分泌蛋白酶活力在26 ℃时达到最高值为36.89 μg/mL,米根霉分泌蛋白酶活力在32 ℃时达到最高值,为29.29 μg/mL。

2.1.3 接种量对蛋白酶活力的影响

选定总状毛霉发酵温度26 ℃、米根霉发酵温度30 ℃、发酵时间72 h,考察不同接种量对总状毛霉和米根霉前期发酵分泌蛋白酶活力的影响。接种量是接种1 mL不同浓度的孢子悬液。结果如图3所示。

图3 接种量对总状毛霉和米根霉前期发酵分泌蛋白活力的影响
Fig. 3 Effect of inoculum amount on protease activity

由图3可知,接种量过高或者过低都会影响蛋白酶的活力,在接种量为1.0×10 3CFU/mL时,二者的蛋白酶活力均为最低,随着接种量的增加,在1.0×10 5CFU/mL时都达到最大值,此时总状毛霉蛋白酶活力为39.88 μg/mL,米根霉的为29.45 μg/mL,当接种量进一步增加时,二者都开始呈现下降趋势。

2.2 响应面优化毛霉前期发酵条件试验结果

表1 总状毛霉发酵条件响应面设计及结果
Table 1 Experimental design and results for response surface methodology for the optimization of Mucor racemosus pre-fermentation conditions

试验号X 1发酵时间/h X 2发酵温度/℃X 3接种量/(CFU/mL)10(60)1(28)1(1.0×10 6)37.16 2-1(48)10(1.0×10 5)37.34 3 0 0(26)041.82 41(72)-1(24)040.13 5 0-1-1(1.0×10 4)38.02 6 1 0 1 36.98因素Y 1蛋白酶活力/(μg/mL)41.81 8-1-1040.12 9-10137.38 10-10-135.38 1110-133.92 1201-134.03 130-1140.09 1400041.67 1500041.90 1600041.88 1711036.25 7 0 0 0

表2 米根霉发酵条件响应面设计及结果
Table 2 Experimental design and results for response surface methodology for the optimization of Rhizopus oryzae pre-fermentation conditions

试验号因素Y 2蛋白酶活力/(μg/mL)X 1发酵时间/hX 2发酵温度/℃X 3接种量/(CFU/mL)10(60)-1(30)-1(1.0×10 4)27.93 21(72)0(32)-127.52 3 1-10(1.0×10 5)29.45 4-1(48)-1031.72 5 1 0 1(1.0×10 6)29.29 6 1(34)-127.43 7-10-130.14 8 0 1 1 29.36 0-11031.67 1000032.93 1100033.02 1200032.89 1300032.93 14-10131.52 150-1129.53 1600032.96 1711028.89 9

表3 总状毛霉前期发酵条件回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic model of Mucor racemosus pr-fermentation conditions

注:**. P<0.01,差异极显著;*. P<0.05,差异显著。下同。

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型126.34914.041 536.15 <0.000 1** X 1发酵时间1.3111.31143.59 <0.000 1** X 2发酵温度24.08124.082 635.18 <0.000 1** X 3接种量0.1310.131 717.64 <0.000 1** X 1X 20.1610.1617.510.004 1** X 1X 30.2810.2830.740.000 9 ** X 2X 30.2810.2821.130.000 9 ** X 123.16123.16 2 534.71 <0.000 1** X2 2 53.23153.23 5 824.51 <0.000 1**残差0.06479.139×10 -3失拟项0.03130.0101.290.392 4不显著纯误差0.0334 8.130×10 -3总差126.4116相关系数R 20.999 5校正决定系数R 2 Adj0.998 8变异系数0.25 3.6813.68 403.22 <0.000 1** X3 22

表4 米根霉前期发酵条件回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic model of Rhizopus oryzae pre-fermentation conditions

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型66.2097.361 568.64<0.000 1** X 1发酵时间12.25112.252 613.00<0.000 1** X 2发酵温度0.2010.2043.68<0.000 1** X 3接种量5.5815.581 189.660.000 3** X 1X 20.06510.06513.870.007 4** X 1X 30.03810.0388.110.024 8* X 2X 30.02710.0275.810.046 8* X 12.2412.24 477.58<0.000 1** X2 2 28.45128.45 6 067.25<0.000 1**残差0.03374.689×10 -3失拟项0.02337.833×10 -33.360.136 0不显著纯误差9.320×10 -342.330×10 -3总差66.2316相关系数R 20.999 5校正决定系数R 2 Adj0.998 9变异系数0.22 13.40113.40 2 858.95<0.000 1** X3 22

使用响应面法分析软件对表1和表2中的数据进行处理,分析结果见表3和表4。

2.2.1 回归模型的建立

以发酵时间(X 1)、发酵温度(X 2)和接种量(X 3)为自变量,总状毛霉发酵蛋白酶活力(Y 1)和米根霉发酵蛋白酶活力(Y 2)为因变量,建立回归模型方程分别为:

2.2.2 回归模型方差分析

总状毛霉发酵条件回归模型方差分析:由表3可知,所选模型的不同处理间差异高度显著(P<0.000 1),说明用回归方程描述各因子与响应值之间的关系,其因变量与自变量之间的线性关系高度显著,即该试验方法可靠。X 1、X 2、X 3的差异高度显著(P<0.000 1); X 1X 2、X 1X 3、X 2X 3的差异分别为0.004 1、0.000 9和0.000 9,均高度显著。失拟项0.392 4>0.05,差异不显著,说明该方程对试验拟合的情况较好,试验的误差小;模型的较正决定系数 =0.998 8,说明该模型能解释99%响应值变化。变异系数为0.25,说明试验结果可靠性较高。通过F值可以看出,试验中各因素对总状毛霉分泌产蛋白酶效果的影响大小顺序为:发酵温度>接种量>发酵时间。

米根霉发酵条件回归模型方差分析:由表4可知,所选模型的不同处理间差异高度显著(P<0.000 1),说明用回归方程描述各因子与响应值之间的关系,其因变量与自变量之间的线性关系高度显著,即该试验方法可靠。X 1、X 2、X 3的差异高度显著(P<0.000 1);接种量显著(P=0.000 3<0.05);X 1X 2、X 1X 3、X 2X 3的差异显著分别为0.007 4、0.024 8和0.046 8,均为显著(P<0.05)。失拟项P=0.136 0>0.05,差异不显著,说明该方程对试验拟合的情况较好,试验的误差小;模型的校正决定系数 =0.998 9,说明该模型能解释99%响应值变化。变异系数为0.22,说明试验结果可靠性较高。通过F值可以看出,试验中各因素对米根霉分泌产蛋白酶效果的影响大小顺序为:发酵时间>接种量>发酵温度。

综上所述得出的总状毛霉前期发酵条件经圆整为:发酵时间60 h、发酵温度24 ℃、接种量1.0×10 5CFU/mL,此时分泌产蛋白酶活力为42.70 μg/mL,该值落在响应值的95%预测区间[42.158 4,43.241 7]内,说明该回归模型可用于发酵蛋白酶活力的预测。米根霉前期发酵条件为:发酵时间50 h、发酵温度32 ℃、接种量1.0×10 5CFU/mL,此时分泌产蛋白酶活力为33.53 μg/mL,该值落在响应值的95%预测区间[33.141 9,33.909 6]内,说明该回归模型可用于发酵蛋白酶活力的预测。

2.3 验证实验结果

为检验实验结果与真实情况的一致性,对上述最优条件进行验证实验。总状毛霉最优条件发酵时间60 h、发酵温度24 ℃、接种量1.0×10 5CFU/mL,此条件下进行3 次平行实验,测得蛋白酶活力的平均值为42.79 μg/mL;米根霉最优条件发酵时间50 h、发酵温度32 ℃、接种量1.0×10 5CFU/mL,此条件下进行3 次平行实验,测得蛋白酶活力的平均值为33.51 μg/mL。

2.4 发酵分泌产酶系的对比

在验证实验的过程中通过3 次平行实验分别测其蛋白酶活力、脂肪酶活力、α-淀粉酶活力和糖化酶活力,总状毛霉和米根霉在最优发酵条件下,前期发酵分泌酶系的比较如图4所示。

图4 总状毛霉和米根霉发酵分泌酶活力比较
Fig. 4 Comparison of enzyme activities produced by Mucor racemosa and Rhizopus oryzae

由图4可知,在最优发酵条件下,总状毛霉前期发酵分泌的蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力和脂肪酶活力分别为42.79、43.33、11.62、5.68 μg/mL;米根霉前期发酵分泌的蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力和脂肪酶活力分别为33.51、48.53、13.72、7.12 μg/mL。可以直观得出在前期发酵中总状毛霉分泌的蛋白酶活力比米根霉高,而淀粉酶、糖化酶和脂肪酶的活力比米根霉低。

2.5 氨基酸含量检测结果

图5 总状毛霉(a)和米根霉(b)发酵氨基酸检测图谱
Fig. 5 Analysis of amino acids in sufu fermented by Mucor racemosus (a) and Rhizopus oryzae (b)

通过氨基酸分析仪分别检测最优条件下总状毛霉和米根霉前期发酵产腐乳坯的氨基酸含量,检测结果如图5所示。

表5 总状毛霉和米根霉发酵腐乳坯中氨基酸成分分析结果
Table 5 Amino acid composition of sufu pehtze fermented with Mucor ucor racemosa mosa and and Rhizopus oryzae yzae g/100 g

氨基酸名称总状毛霉米根霉氨基酸名称总状毛霉米根霉天冬氨酸(Asp)0.0840.088异亮氨酸(Ile)0.1150.123苏氨酸(Thr)0.0930.111甲硫氨酸(Met)0.1170.084丝氨酸(Ser)0.1080.115亮氨酸(Leu)0.1140.208谷氨酸(Glu)0.0990.094酪氨酸(Tyr)0.0930.126甘氨酸(Gly)0.0680.124苯丙氨酸(Phe)0.1020.129丙氨酸(Ala)0.0880.013组氨酸(His)0.3680.343半胱氨酸(Cys)0.0590.011赖氨酸(Lys)0.3180.144缬氨酸(Val)0.1030.019精氨酸(Arg)0.2030.081

用全自动氨基酸分析仪分别对两种发酵方式的前期发酵腐乳坯中的氨基酸进行分析,从表5可以看出,两种方式发酵的腐乳坯中的氨基酸种类相同,都为16 种,其中必需氨基酸的种类也相同,均为7 种。总状毛霉发酵的腐乳坯中总氨基酸含量为2.132 g/100 g,其中必需氨基酸含量为0.962 g/100 g,米根霉发酵的腐乳坯中总氨基酸含量为1.813 g/100 g,其中必需氨基酸含量为0.818 g/100 g。腐乳发酵过程中主要的呈味氨基酸为谷氨酸和天冬氨酸,总状毛霉发酵的腐乳坯呈味氨基酸为0.183 g/100 g,米根霉为0.182 g/100 g。

3 结 论

通过单因素和响应面试验对总状毛霉和米根霉前期发酵条件进行优化,得到二者前期发酵的最优条件。总状毛霉前期发酵条件为:发酵时间60 h、发酵温度24 ℃、接种量1.0×10 5CFU/mL,此时分泌产蛋白酶活力为42.79 μg/mL;米根霉前期发酵条件为:发酵时间50 h、发酵温度32 ℃、接种量为1.0×10 5CFU/mL,此时分泌产蛋白酶活力为33.51 μg/mL。

通过两种发酵方式前期发酵情况的比较,结果表明米根霉的前期发酵温度比总状毛霉前期发酵温度高。总状毛霉前期发酵产物中蛋白酶活力高于米根霉,而淀粉酶、糖化酶和脂肪酶的活力则低于米根霉。通过对二者的氨基酸分析发现,总状毛霉前期发酵产物中产氨基酸总量比米根霉高。通过二者前期发酵的情况分析,发现二者在腐乳发酵上各有特点,后续将围绕两种菌的协同作用开展深入研究。

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Comparative Study of Pre-fermentation with Mucor racemosus and Rhizopus oryzae in Bagongshan Sufu during Fermentation

LI Shun 1, GU Yongzhong 2, YANG Ying 3, CHEN Xiaoju 4, ZHENG Zhi 1, WU Xuefeng 1, SUN Ting 1, JIANG Shaotong 1, LI Xingjiang 1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Anhui Bagongshan Co. Ltd., Huainan 232200, China; 3. School of Environment and Energy Engineering, Anhui Jianzhu University, Hefei 230601, China; 4. College of Chemistry and Material Engineering, Chaohu University, Chaohu 238000, China)

Abstract:Since the pre-fermentation of Bagongshan sufu has an important impact on its overall nutritional quality and flavor and the exploration of its fermentation process with two common strains (Mucor racemosus or Rhizopus oryzae) is of great significance for practical production. The conditions for pre-fermentation of either strain were optimized by the combined use of one-factor-at-a-time method and response surface methodology. Fermentation time, temperature and inoculum amount were selected as independent variables while protease activity was selected as response variable. This study also compared the enzyme systems and amino acids produced by the two stains under optimized fermentation conditions. Results showed that the optimal fermentation conditions of Mucor racemosus were found to be fermentation for 60 h at 24 ℃ with an inoculum amount of 1.0 × 10 5CFU/mL. Under these conditions, the activity of protease was 42.79 μg/mL. The optimal fermentation conditions of Rhizopus oryzae were determined as 50 h, 32 ℃ and 1.0 × 10 5CFU/mL, respectively. Under these conditions, the activity of protease was 33.51 μg/mL. Comparative investigations indicated that the activity of protease in Mucor racemosus was higher than that in Rhizopus oryzae, while α-amylase, glucoamylase and lipase from Mucor racemosus were lower than from Rhizopus oryzae. The content of total amino acids in sufu fermented by Mucor racemosus was higher than that in sufu fermented by Rhizopus oryzae while there was no obvious difference in fl avor amino acids or hydrophobic amino acids. Both Mucor racemosus and Rhizopus oryzae had their own advantages for the pre-fermentation of Bagongshan sufu, which may lay a theoretical foundation for synergistic fermentation.

Key words:sufu; pre-fermentation; Mucor racemosus; Rhizopus oryzae; amino acid

收稿日期:2015-12-12

基金项目:安徽省重大科技专项(15czz03096);国家自然科学基金面上项目(31470002/31601465);

国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102201);合肥工业大学应用成果培育计划项目(JZ2016YYPY0041)

作者简介:李顺(1991—),男,硕士研究生,研究方向为食品科学。E-mail:lishun@mail.hfut.edu.cn

*通信作者:李兴江(1978—),男,副教授,博士,研究方向为食品发酵工程。E-mail:lixingjiang1978@hfut.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617027

中图分类号:TS214

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)17-0163-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617027. http://www.spkx.net.cn

引文格式: