米曲霉Aspergillus oryzae M-4降解己烯雌酚的特性研究

胡凯弟 1，邓维琴 1，陈树平 1，柴先杜 1，刘爱平 1，卓文杰 1，刘书亮 1,2,*

（1.四川农业大学食品学院，四川雅安 625014；2.四川农业大学，食品加工与安全研究所，四川雅安 625014）

摘要：以1 株分离自酱油曲的米曲霉（Aspergillus oryzae）M-4为材料，初步研究其降解己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）的特性。米曲霉M-4对DES的降解率与菌体生物量呈正相关，在基础盐培养基（mineral salt medium，MM）中培养9 d对100 mg/L的DES降解率为93%。动力学研究表明，该菌株降解DES的过程符合一级动力学方程，在所测试的培养温度、初始pH值、底物质量浓度范围内，DES半衰期为1.645～5.295 d。培养温度30 ℃和偏酸性环境有利于其对DES的降解；底物质量浓度越高，其半衰期越长。

胡凯弟, 邓维琴, 陈树平, 等. 米曲霉Aspergillus oryzae M-4降解己烯雌酚的特性研究[J]. 食品科学, 2016, 37(17): 169-172. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617028.　http://www.spkx.net.cn

HU Kaidi, DENG Weiqin, CHEN Shuping, et al. Degradation characteristics of diethylstilbestrol by Aspergillus oryzae M-4[J]. Food Science, 2016, 37(17): 169-172. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617028. http://www.spkx.net.cn

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）是一种非甾体类、人工合成的雌激素，具有与天然雌激素如雌二醇等相同的生物活性。曾在20世纪40—60年代广泛针对女性内分泌失调、避孕等雌激素治疗和作为兽药用于畜牧业 [1-2]。但是随着研究发现DES具有免疫毒性、神经毒性 [3]、基因毒性、生殖毒性 [4]和内分泌毒性 [5]，属于“三致物”，且会殃及后代 [6]；美国和欧盟相继于1971年和1978年颁布法令禁止使用DES [7]，我国农业部随后也出台了相应规定 [2]，国际癌症研究中心已将其列为Ⅰ类人类致癌物 [1]。DES的大量使用，加之不易挥发且难降解，使其残留于土壤和水体中 [8-9]，如在中国和西班牙河流中均检出有DES [10]。同时DES可在水生生物中富集 [11]，并通过食物链传播，经胃肠道吸收滞留于脂肪组织中 [1]，对人体健康造成巨大损伤。已有报道称某些动物源食品检出DES [12-13]，因此如何消除环境及食品中的DES已成为亟需解决的问题。

消除DES的方法主要有化学氧化法 [14]、物理吸附法 [15]和生物降解法。相比于物化法处理，微生物降解由于其温和、有效、低成本、绿色且无二次污染等优点受到愈来愈多地关注，已被用于苯酚、有机磷类农药和拟除虫菊酯类农药等异生物质降解的研究中 [16-17]。筛选具有高效降解DES的功能微生物有望实现环境修复，但迄今为止关于降解DES的菌株及其降解特性的文献甚少，仅见Zhang Weiwei等 [18]筛选到一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）J51和徐冉芳等 [19]筛选到的沙雷氏菌（Serratia sp.）S，且分别来自于受污染的海水和污泥，而真菌还鲜见报道。米曲霉（Aspergillus oryzae）M-4是一株分离自酱油曲 [20]，可在基础盐培养基中降解DES的功能菌株，5 d　对25 mg/L的DES降解率为53.38% [21]。本实验对菌株M-4降解DES的特性进行初步研究，旨在为进一步探究DES降解机理和应用于食品中消除DES残留提供理论依据和数据参考。

1　材料与方法

米曲霉（Aspergillus oryzae）M-4，由四川农业大学食品微生物实验室分离并保存。

DES标准品（99.5%）德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇瑞典Oceanpak公司。

基础无机盐培养基（mineral salt medium，MM）：(NH 4) 2SO 41.5 g、K 2HPO 41.5 g、KH 2PO 40.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO 40.2 g、吐温-80 2 g，超纯水1 000 mL，pH 7.5。葡萄糖土豆培养基（potato dextrose medium，PD）：新鲜去皮土豆200 g、葡萄糖2 g，水1 000 mL，pH 7.0，固体培养基（potato dextrose agar，PDA）添加质量分数2%的琼脂。孢子洗脱液：吐温-80 0.2　g、琼脂0.1 g，蒸馏水100 mL。以上培养基和洗脱液均121 ℃灭菌15 min。DES母液配制：准确称取适量DES，用无水乙醇溶解并定容，配制成质量浓度为5 mg/mL的母液备用。

LC-10A2010CHT型液相色谱仪、LC-Solution工作站日本Shimazu公司；AS10200A超声波清洗器天津奥特赛恩斯公司；Milli-Q Gradient超纯水仪美国Millipore公司；Sorvall ST 16R冷冻离心机美国Thermo Fisher Scientifi c公司。

取菌株M-4划线于PDA斜面，28 ℃培养72 h进行活化。挑取活化好的菌株连续2 次划线于含DES的PDA斜面（DES质量浓度为50　mg/L）进行驯化（28 ℃，72 h）；用5 mL孢子洗脱液洗下菌体并调整孢子浓度为10 8CFU/mL，制成种子液。

取整瓶培养液，加入等体积甲醇；超声波（40 kHz，300 W）辅助提取30 min；吸取2 mL并用甲醇定容至10 mL，混匀后12 000 r/min离心15 min。取上清液过0.45 μm有机相滤膜，弃去初滤液，取续滤液供高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测DES残留质量浓度 [21]。

检测条件 [21]：色谱柱为Sepax GP-C 18柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相为甲醇-水（70∶30，V/V），流速0.7 mL/min；紫外检测器，其波长为242 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。DES降解率按式（1）计算。

式中：ρ 0为空白对照中DES总质量浓度/（mg/L）；ρ为样品培养液中DES残留质量浓度/（mg/L）。

将菌株M-4种子液按体积分数5%的接种量分别接种于PD培养基、PD＋DES培养基（100 mg/L DES）和MM＋DES培养基（100 mg/L DES）中，分装30 mL/250 mL锥形瓶中。于28 ℃、140 r/min振荡培养，分别在1、2、3、4、5、6、7、8、9 d取整瓶培养液，过滤后取菌丝体于80 ℃干燥至恒质量，结果以供试菌生物量表示。实验重复3 次，取平均值。

将菌株M-4种子液按体积分数5%的接种量接种于含100 mg/L DES的MM培养基中，分装30 mL/250 mL锥形瓶，设置添加等量无菌生理盐水为空白对照，于28 ℃、140 r/min振荡培养。　分别在1、2、3、4、5、6、7、8、9 d取整瓶培养液，检测培养液中DES残留质量浓度。检测重复3 次，取平均值。

固定DES反应体系中其他条件，改变菌株M-4降解DES体系中反应的某一环境条件（培养温度、初始pH值、底物质量浓度），定时取样，测定DES质量浓度，以一级动力学方程（the first-order kinetic equation）进行拟合，确定不同影响因素下的动力学特性。在Monod方程基础上，采用的微生物一级反应动力学方程为 [22]：

式中：K d为降解速率常数/（mg/（L·d））；t为降解时间/d；ρ为DES质量浓度/（mg/L）；ρ 0为初始DES质量浓度/（mg/L）。

将菌株M-4种子液按体积分数5%的接种量接种于含有100 mg/L DES的MM培养基（初始pH 7.5）中，分装30 mL/250 mL锥形瓶，不同温度（25、30、35 ℃）条件下140 r/min振荡培养；分别在1、2、3、4、5、6、7、8、9 d取整瓶培养液，测定DES残留量，并以一级动力学方程拟合实验数据。

将菌株M-4种子液按体积分数5%的接种量接种于含有100 mg/L DES，不同初始pH值（6.0、7.0、8.0）的MM培养基中，分装30 mL/250 mL锥形瓶，28 ℃、140 r/min振荡培养；分别在1、2、3、4、5、6、7、8、9 d取整瓶培养液，测定DES残留量，并以一级动力学方程拟合实验数据。

将菌株M-4种子液体积分数按5%的接种量接种于含有不同质量浓度（50、100、200 mg/L）DES的MM培养基（pH 7.5）中，分装30 mL/250 mL锥形瓶，28 ℃、140 r/min振荡培养；50 mg/L培养液取样时间为1、2、3、4、5 d；100 mg/L培养液取样时间为1、2、3、4、5、6、7、8、9 d；200 mg/L培养液取样时间为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 d；取整瓶培养液，测定DES残留量，并以一级动力学方程拟合实验数据。

2　结果与分析

图1　不同培养基中米曲霉M-4的生长曲线
Fig. 1 Growth curves of Aspergillus oryzae M-4 in different media

比较菌株M-4在PD、PD＋DES及MM＋DES培养基中的生长情况，结果如图1所示，M-4在3 种培养基中生物量略有不同，但总体趋势一致；1～2 d生长缓慢，3 d后生长迅速，7 d后基本进入稳定期，表现为生物量增长缓慢至趋于稳定，最终菌丝体生物量分别为5.47、7.59、4.97 g/L；在此期间，菌株M-4在MM＋DES培养基中细胞生物量较PD和PD＋DES小。对比PD和PD＋DES培养基中M-4生长曲线，可知一定质量浓度的DES可抑制菌株的初期生长，但并不影响其快速生长期的到来，且菌株M-4可利用DES及其代谢产物，从而使得加入DES后生物量较普通的更高，且差异显著（P＜0.05）。

图2　米曲霉M-4对DES降解的影响
Fig. 2 Biodegradation curve of DES by Aspergillus oryzae M-4

菌株M-4在MM＋DES培养基中（100 mg/L DES）经9 d培养后对DES降解情况如图2所示。除去空白对照组损失部分，菌株M-4在9 d内对DES的降解率达到93%；1～2 d时降解率较低，结合生长曲线可知此时菌株生长处于延滞期；3 d后伴随菌株M-4生物量的迅速增长，DES降解速率加快。

固定培养体系初始pH值和底物质量浓度，考察不同培养温度下菌株M-4对DES降解速率的影响。由表1可知，不同培养温度条件下菌株M-4对DES的降解符合一级动力学方程。30 ℃时半衰期最短，菌株对DES的降解能力最强；培养温度升高或降低，半衰期均延长。

表1　不同培养温度下米曲霉M-4对DES的降解动力学参数
Table 1 Kinetic equations for DES degradation at different culture temperatures by Aspergillus oryzae M-4

固定培养体系温度和底物质量浓度，考察不同初始pH值下菌株M-4对DES降解速率的影响。由表2可知，不同初始pH值下米曲霉M-4对DES的降解符合一级动力学方程。在初始pH值为6.0～8.0范围内，DES半衰期变化不大，pH 6.0时，半衰期最短。

表2　不同初始pH值条件下米曲霉M-4对DES的降解动力学方程
Table 2 Kinetic equations for DES degradation at different initial pH values by s by Aspergillus oryzae　zae M-4M-4

初始pH动力学方程半衰期t 1/2/d相关系数R 26.0ρ=97.22e －1.534t1.8361.5340.918 8 7.0ρ=99.70e －1.745t1.9161.7450.930 1 8.0ρ=98.47e －0.964t2.4630.9640.893 4降解速率常数/（mg/（L·d））

固定培养体系温度和初始pH值，考察不同底物质量浓度条件下菌株M-4对DES降解速率的影响，结果见表3。不同底物质量浓度条件下，菌株M-4对DES的降解符合一级动力学方程。底物质量浓度在50～200 mg/L范围内，DES半衰期变化较大，在1.645～5.295 d之间。

表3　不同底物质量浓度米曲霉M-4对DES的降解动力学方程
Table 3 Kinetic equations for DES degradation at different DES concentrations by s by Aspergillus oryzae yzae M-4 M-4

底物质量浓度/（mg/L）动力学方程半衰期t 1/2/d相关系数R 250ρ=50.32e －2.078t1.6452.0780.924 3 100ρ=100.41e －1.794t2.1761.7940.892 5 200ρ=198.68e －1.437t5.2951.4370.903 9降解速率常数/（mg/（L·d））

总体而言，菌株M-4降解DES受底物质量浓度影响较大，随着DES质量浓度的增加，半衰期也相应的延长，说明高质量浓度底物会对菌株产生一定的毒害作用 [23-24]；培养温度对半衰期有一定影响，30 ℃时降解速率最大，与徐冉芳等 [19]关于Serratia sp. S降解DES特性研究的结果相类似；初始pH值影响较小，偏酸性有利于菌株M-4降解DES。

3　结论

不同于分离自被污染地区的Pseudomonas sp. J51和Serratia sp. S [18-19]，本实验所用米曲霉M-4来源于酱油曲，安全性良好；菌株M-4对DES的降解率与菌体生物量呈正相关，在MM培养基中培养9 d对100 mg/L的DES降解率为93%，降解能力远强于上述2 株细菌。DES可通过运输、污水、药物丢弃或掩埋进入土壤并被强力吸附，也可进入水体，难以降解 [1]；菌株M-4对DES的降解过程符合一级动力学方程，在所测定的培养温度、初始pH值、底物质量浓度范围内，DES半衰期仅为1.645～5.295 d；培养温度30 ℃和偏酸性环境有利于DES的降解，底物质量浓度越高，其半衰期越长。综上所述，米曲霉M-4是一株可高效降解DES的有益真菌，具有良好的应用前景。

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HU Kaidi 1, DENG Weiqin 1, CHEN Shuping 1, CHAI Xiandu 1, LIU Aiping 1, ZHUO Wenjie 1, LIU Shuliang 1,2,*
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 2. Research Institute of Food Processing and Security, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Abstract：Aspergillus oryzae M-4, isolated from soy sauce koji, was applied in the present study to investigate its degradation characteristics for diethylstilbestrol (DES). The degradation rate of DES had a positive correlation with the biomass of Aspergillus oryzae M-4 and reached up to 93% when the strain was cultured in MM medium with 100 mg/L DES for 9 d. Kinetic studies indicated that the process of degradation fi tted well with a fi rst-order kinetic equation. The half-life of DES was 1.645–5.295 d under the tested conditions of culture temperature, initial pH and substrate concentration. Culture temperature of 30 ℃ and acidic environment were favorable for the degradation of DES, while high concentration of DES extended its half-life.

Key words：diethylstilbestrol (DES); degradation; Aspergillus oryzae; characteristics

作者简介：胡凯弟（1992—），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物。E-mail：kaidiminer@163.com

*通信作者：刘书亮（1968—），男，教授，博士，研究方向为食品微生物与发酵工程。E-mail：lsliang999@163.com

米曲霉Aspergillus oryzae M-4降解己烯雌酚的特性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　结论