液压压榨澳洲坚果粕酶解制备多肽工艺优化

（1.云南省热带作物科学研究所，云南景洪 666100；2.文山学院化学与工程学院，云南文山 663000；3.云南农业大学热带作物学院，云南普洱 665000）

摘要：以液压压榨澳洲坚果粕为原料，分析了其常规营养成分含量与氨基酸组成。采用碱性蛋白酶与中性蛋白酶催化酶解澳洲坚果粕蛋白制备多肽。以水解度为指标，利用单因素试验与正交试验考察了各因素对澳洲坚果粕蛋白水解度的影响。结果表明：液压压榨澳洲坚果粕中含有32.25%的蛋白质，17 种氨基酸，含量为25.05%。碱性蛋白酶各因素对澳洲坚果粕蛋白水解度影响的主次顺序为：酶解时间＞酶解温度＞加酶量＞酶解pH值＞底物质量浓度，最佳工艺条件为：酶解温度60 ℃、酶解时间3.5 h、底物质量浓度110 g/L、酶解pH 8.0、加酶量2 400 U/g，在此条件下水解度达到了22.83%。中性蛋白酶各因素影响水解度的主次顺序为：加酶量＞酶解时间＞底物质量浓度＞酶解温度＞酶解pH值，最佳工艺条件为酶解温度55 ℃、酶解时间3.5 h、底物质量浓度100 g/L、酶解pH 7.0、加酶量3 200 U/g，水解度达到了22.78%。碱性蛋白酶与中性蛋白酶各因素对澳洲坚果粕蛋白水解度的影响均达到了极显著水平（P＜0.01）。在最佳工艺条件下，碱性蛋白酶酶解液压压榨澳洲坚果粕制备多肽的效果优于中性蛋白酶。

郭刚军, 邹建云, 胡小静, 等. 液压压榨澳洲坚果粕酶解制备多肽工艺优化[J]. 食品科学, 2016, 37(17): 173-178.

GUO Gangjun, ZOU Jianyun, HU Xiaojing, et al. Optimizing the preparation of crude peptides from hydraulic macadamia nut meal by enzymatic hydrolysis[J]. Food Science, 2016, 37(17): 173-178. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617029.　http://www.spkx.net.cn

澳洲坚果又名昆士兰栗、夏威夷果、巴布果、澳洲胡桃等，是山龙眼科澳洲坚果属（Macadamia ternifolia F. Muell）植物的成熟果实，其果仁含油量高、营养丰富、可生吃，烤制后酥脆可口，质地细腻，带有奶油清香，风味极佳，经济价值高，在国际市场上深受青睐，被誉为“坚果之王” [1-3]。云南在1981年引进澳洲坚果品种，进行环境适应性与商业化种植实验，1996年开始生产性规模种植，2009年省政府出台政策将澳洲坚果作为木本油料作物进行产业化发展，至2013年底全省种植面积已达90万亩以上。随着《云南省澳洲坚果产业规划（2013—2020）》的实施，我国澳洲坚果壳果产量有望达到100万 t/a，澳洲坚果油将成为重要的产品形式 [4-5]，而榨油后的副产物澳洲坚果粕含有较高含量的蛋白质、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸与赖氨酸 [6]，通过酶法制备多肽是提高澳洲坚果粕蛋白利用率的有效途径之一 [7]。

多肽是指分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，分子质量集中在300～3 000 D之间 [8-9]。多肽除了具有易被人体消化吸收的特性外，还有多种对人体有益的生理功能，如抗氧化性、降血压、降低胆固醇含量、促进钙吸收等 [10-11]。相对于化学法，酶解法水解蛋白质具有反应条件温和、反应时间短、产品营养价值高等优点 [12-13]。目前，利用碱性蛋白酶水解碱法提取澳洲坚果蛋白制备多肽已有文献报道 [14]。本实验采用液压压榨方式制备出品质优良的澳洲坚果粕，测定了其常规营养成分含量与氨基酸组成，研究了碱性蛋白酶与中性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白的工艺条件优化，以期为进一步开发和利用这一资源、生产高附加值的多肽产品提供一定的理论参考。

1　材料与方法

液压压榨澳洲坚果粕西双版纳云垦澳洲坚果科技开发有限公司。

碱性蛋白酶、中性蛋白酶广西南宁东恒华道生物科技有限公司；甲醛、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、酪蛋白标准品、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、考马斯亮蓝G-250、85%浓磷酸等试剂均为分析纯。

QYZ-550型液压榨油机泰安市良君益友机械有限公司；电热鼓风干燥箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DZKW-4电子恒温水浴锅上海科析试验仪器厂；FE20型pH计、ME4002E型电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；紫外-可见分光光度计上海仪电分析仪器有限公司；离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司；25 mL型数字瓶口滴定仪德国Brand公司。

取澳洲坚果碎仁10 kg，采用液压榨油机在压榨温度60 ℃、压力30～40 MPa的条件下压榨80 min，出油率65.75%，制得颜色呈乳白色、品质优良的液压压榨澳洲坚果粕。

水分含量：直接干燥法，按GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》进行测定；蛋白质含量：凯氏定氮法，按GB　5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》进行测定；粗脂肪含量：索氏抽提法，按GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》进行测定；灰分含量：灼烧法，按GB 5009.4— 2010《食品中灰分的测定》进行测定；膳食纤维含量：酶重法，按GB/T 5009.88—2008《食品中膳食纤维的测定》进行测定；碳水化合物含量：差减法，参照文献[15-16]进行测定；总糖含量：酸水解法，按GB/T 5009.8—2008《食品中蔗糖的测定》进行测定；还原糖含量：直接滴定法，按GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》进行测定；能量：按GB/T 24154—2009《运动营养食品通则》进行测定。

氨基酸组成及含量分析参照AOAC1995方法测定，样品处理采用6 mol/L的HCl溶液水解，水解完成后采用6 mol/L的NaOH溶液调pH值至中性，然后用0.45 μm滤膜过滤后进行上机测定 [17]，检验方法为GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》。

液压压榨澳洲坚果粕→粉碎→过60 目筛→加水调浆→沸水预热10 min→冷却至酶作用合适温度→加入蛋白酶→调pH值至恒定→恒温酶解→沸水灭酶5 min→冷却至室温→4 000 r/min离心10 min→取上清液→测定水解度→调pH 4.6（澳洲坚果蛋白等电点）→4 000r/min离心10 min→取上清液→测定多肽含量→冷冻干燥→澳洲坚果多肽

将100 g/L澳洲坚果粕碱性蛋白酶解液pH值调为8.5，加酶量1 200 U/g；中性蛋白酶pH值调为7.0，加酶量2 400 U/g，分别在35、40、45、50、55、60 ℃条件下恒温酶解2.0 h，测定水解度。

将100 g/L澳洲坚果粕碱性蛋白酶解液pH值调为8.5，加酶量1 200 U/g；中性蛋白酶pH值调为7.0，加酶量2 400 U/g，在50 ℃条件下恒温酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，测定水解度。

将澳洲坚果粕碱性蛋白酶酶解液pH值调为8.5，加酶量1 200 U/g；中性蛋白酶酶解液pH值调为7.0，加酶量2 400 U/g，然后分别在温度50 ℃，底物质量浓度20、40、60、80、100、120 g/L条件下恒温酶解2.0 h，测定水解度。

将100 g/L澳洲坚果粕碱性蛋白酶酶解液pH值分别调为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，加酶量1 200 U/g；中性蛋白酶pH值调为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，加酶量2 400 U/g，在50 ℃恒温酶解2.0 h，测定水解度。

将100 g/L澳洲坚果粕碱性蛋白酶解液pH值调为8.5，加酶量分别为400、800、1 200、1 600、2 000、2 400 U/g，中性蛋白酶调pH值为7.0，加酶量分别为800、1 200、1 600、2 000、2 400、2 800 U/g，然后在50 ℃恒温酶解2.0 h，测定水解度。

在碱性蛋白酶与中性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白制备多肽单因素试验的基础上，分别选择酶解温度（A）、酶解时间（B）、底物质量浓度（C）、酶解pH值（D）和加酶量（E）5 个因素，每个因素选择4 个水平，以水解度为指标，选用L 16（4 5）进行正交设计来选择最佳酶解工艺条件。

澳洲坚果粕蛋白酶水解制备多肽水解度的测定采用甲醛滴定法 [18-19]。

水解液中多肽含量测定：双缩脲法 [20-22]，以标准酪蛋白为标样，采用最小二乘法作线性回归，得酪蛋白标准液质量浓度x（mg/mL）与吸光度y的关系曲线的回归方程：y=0.013 2x＋0.003 5，相关系数R 2=0.999 4。然后取澳洲坚果粕蛋白酶解液1 mL，加入4 mL双缩脲试剂，混匀，室温条件下放置30 min，在540 nm波长处测定吸光度，对照标准曲线，换算得出液压压榨澳洲坚果粕蛋白酶解液中可溶性多肽含量。按下式计算多肽产率。

2　结果与分析

表1　液压压榨澳洲坚果粕常规营养成分含量
Table 1 The contents of major nutritional components in hydraulic macadamia nut meal

项目水分灰分脂肪蛋白质碳水化合物总糖粗多糖还原糖膳食纤维含量/%3.80±0.223.94±0.3521.11±0.5632.25±0.8217.92±0.7414.50±0.550.90±0.062.80±0.1620.98±1.12

由表1可知，液压压榨后的澳洲坚果粕很好地保留了澳洲坚果果仁的营养物质，富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、总糖、还原糖等多种营养物质，具有1 802 kJ/100 g能量，其中蛋白质含量最高为32.25%，且压榨温度低，蛋白质不变性，适于澳洲坚果粕多肽的制备。

2.2　液压压榨澳洲坚果粕氨基酸组成与含量分析评价食物营养价值高低的重要指标之一是氨基酸的组成与含量 [23]。由表2可知，液压压榨澳洲坚果粕中含有组氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸与蛋氨酸等17 种氨基酸（因色氨酸未测定），总氨基酸含量为

表2　液压压榨澳洲坚果粕氨基酸组成与含量
Table 2 Amino acid composition of hydraulic macadamia nut meal

注：*.人体必需氨基酸。

氨基酸名称组氨酸丝氨酸精氨酸甘氨酸天冬氨酸谷氨酸苏氨酸*丙氨酸脯氨酸相对含量/%0.57±0.061.12±0.183.40±0.141.25±0.102.42±0.246.18±0.360.84±0.061.16±0.121.33±0.26氨基酸名称胱氨酸赖氨酸*酪氨酸蛋氨酸*缬氨酸*异亮氨酸*亮氨酸*苯丙氨酸*总氨基酸相对含量/%0.44±0.001.23±0.081.13±0.170.18±0.020.82±0.110.64±0.031.54±0.0.300.80±0.0925.05±0.75

25.05　%，其中谷氨酸质量分数最高，为6.18%，其次是精氨酸，为3.40%，再次是天冬氨酸，为2.42%。谷氨酸是食物中重要的鲜味物质，与澳洲坚果具有良好的口感和风味有重要关系。其含有亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸等7 种人体必需氨基酸，相对含量为6.05%，其中亮氨酸与赖氨酸含量较高，分别为1.54%与1.23%。液压压榨澳洲坚果粕中含有丰富的氨基酸，适于多肽产品的制备。

由图1可知，碱性蛋白酶在酶解温度35～55 ℃、中性蛋白酶在35～50 ℃范围内，水解度随温度升高而增加。碱性蛋白酶在温度55～60 ℃范围内，水解度缓慢下降，中性蛋白酶在50～60 ℃的范围内，水解度下降较快。这是由于在一定范围内，温度的升高有利于酶分子催化性能的提升，所以提高温度时，酶催化反应速率持续增加，体现为酶解能力的不断加强，水解度不断升高，多肽产率相应增加 [9]。当超过最适酶解温度后，酶的活力受到抑制，甚至使得酶蛋白的结构发生改变，导致酶失活 [24]。因此，碱性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白的适宜温度为55 ℃左右，在此条件下水解度为17.45%；中性蛋白酶为50 ℃，水解度为21.46%。

图2　酶解时间对澳洲坚果粕蛋白水解度的影响
Fig. 2 Effect of hydrolysis duration on the degree of hydrolysis

由图2可知，酶解前2.0 h内，酶活力高，产物抑制小，水解度增幅很大。2.0 h后随着酶解时间的延长，游离的氨基酸与多肽增多，产物的抑制作用增大，酶的活力受到抑制而减弱，水解度增加趋势渐缓 [24]。从水解度与节省能耗方面考虑，碱性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白的适宜时间为3.0 h左右，在此条件下水解度为19.40%；中性蛋白酶为2.5 h，水解度为22.49%。
2.3.3 底物质量浓度对澳洲坚果粕蛋白水解度的影响

由图3可知，随着底物质量浓度的增加，水解度也随之增加，碱性蛋白酶和中性蛋白酶分别在底物质量浓度为100 g/L和80 g/L时，水解度达到最大值，当底物质量浓度再增大时，水解度反而呈下降趋势。这主要是由于当底物质量浓度很低时，酶的水解效率受底物质量浓度的限制。当底物质量浓度很高时，澳洲坚果粕溶液黏度变大，蛋白的溶出率下降，过多的底物分子堆积于酶的活动中心，酶已达到饱和时所需底物质量浓度，从而会影响酶催化速率及产物分子的扩散。因此，碱性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白的适宜底物质量浓度为100 g/L左右，在此条件下水解度为17.32%；中性蛋白酶为80 g/L，水解度为22.45%。

由图4可知，碱性蛋白酶与中性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白时，水解度均随着pH值升高先增加后减少，碱性蛋白酶在pH 9.0、中性蛋白酶在pH 6.5时，水解度达到最大值。这主要是由于酶分子是种特殊的蛋白质分子，由一个或者若干个活性部位组成，酶的活性部位只有与蛋白酶保持一定的空间构象才能存在，其催化功能才能实现，过低或过高的pH值都会对酶的空间构象造成破坏，使酶的活性降低，甚至丧失，只有在适宜的pH值条件下酶解才能得到较高的水解度 [25]。因此，碱性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白适宜pH值为9.0左右，在此条件下水解度为17.70%；中性蛋白酶pH值为6.5，水解度为22.22%。

由图5可知，碱性蛋白酶加酶量在400～1 600 U/g、中性蛋白酶在800～2 000 U/g的范围内，水解度增幅很大，碱性蛋白酶在1 600～2 400 U/g、中性蛋白酶在2 000～2 800 U/g范围内，水解度增加趋势渐缓。这是由于随着加酶量的增加，底物与酶的接触面积增大，酶解反应的速率也相应提高，表现为多肽产率的增加。但加酶量超过最佳值后，过量的酶没有底物作用，导致多肽产率增加缓慢。因此，碱性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白的适宜加酶量为1 600 U/g左右，在此条件下水解度为17.48%；中性蛋白酶为2 400 U/g，水解度为22.53%。

2.4　碱性蛋白酶酶解澳洲坚果粕制备多肽正交试验分析由表3可知，碱性蛋白酶各因素对澳洲坚果粕蛋白水解度影响的主次顺序为B＞A＞E＞D＞C，即酶解时间＞酶解温度＞加酶量＞酶解pH值＞底物质量浓度，最优工艺条件组合为A 4B 4C 3D 1E 4，在此条件下，进行了3 组平行验证实验并测定其多肽含量，水解度达到了22.83%，优于正交表中其他组合，多肽产率达到60.25%。范方宇等 [14]利用碱性蛋白酶酶解纯度为82.24%的澳洲坚果蛋白制备多肽，水解度达到了52.50%，高于本研究结果，这可能是由于其蛋白质含量较高，酶活性中心与底物作用更为充分的缘故。

表3　碱性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白正交试验结果
Table 3 Orthogonal array design with experimental results for hydrolysis with alkaline protease

E加酶量/（U/g）11（45）1（2.0）1（90）1（8.0）1（1 200）16.87 212（2.5）2（100）2（8.5）2（1 600）11.50 313（3.0）3（110）3（9.0）3（2 000）19.03 414（3.5）4（120）4（9.5）4（2 400）19.94 52（50）123418.41 62214318.12 72341220.12 82432119.04 93（55）134218.02 103243116.87 113312421.43 123421321.79 134（60）142318.36 144231422.52 154324117.65 164413220.80 K 167.3471.6677.2281.3070.43 K 275.6969.0169.3570.3370.44 K 378.1178.2378.6175.1177.30 K 479.3381.5775.2973.7382.30 R11.9912.569.2610.9711.87较优组合A 4B 4C 3D 1E 4试验号A酶解温度/℃B酶解时间/h C底物质量浓度/（g/因素水解度/% D酶解pH

表4　碱性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白试验方差分析结果
Table 4 Analysis of variance for hydrolysis with alkaline protease

注：**.差异极显著（P＜0.01）。下同。

方差来源离均差平方和自由度均方F值显著性校正模型300.9601520.0642 555.92** A酶解温度65.638321.8792 787.18** B酶解时间75.433325.1453 203.13** C底物质量浓度37.434312.4781 589.55** D酶解pH47.302315.7672 008.56** E加酶量75.152325.0513 191.19**误差2.512320.079

由表4可知，碱性蛋白酶的酶解温度、酶解时间、底物质量浓度、pH值与加酶量5 个因素对澳洲坚果粕蛋白水解度的影响达到了极显著水平（P＜0.01），酶解时均应将其控制在最优水平上。故确定酶解温度60 ℃、酶解时间3.5 h、底物质量浓度110 g/L、酶解pH 8.0、加酶量2 400 U/g为碱性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白制备多肽的最佳工艺条件。

2.5　中性蛋白酶水解澳洲坚果粕制备多肽正交试验分析由表5可知，中性蛋白酶各因素对澳洲坚果粕蛋白水解度影响的主次顺序为E＞B＞C＞A＞D，即加酶量＞酶解时间＞底物质量浓度＞酶解温度＞酶解pH值，最优工艺条件组合为A 4B 4C 4D 3E 4，在此条件下，进行了3 组验证实验取平均值并测定其多肽含量，水解度达到了22.78%，优于正交表中其他组合，多肽产率达到了58.85%。在最佳工艺条件下，中性蛋白酶水解液压压榨澳洲坚果粕的水解度与多肽产率低于碱性蛋白酶。

表5　中性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白正交试验结果
Table 5 Orthogonal array design with experimental results for hydrolysis with neutral proteasec

试验号E加酶量/（U/g）11（40）1（2.0）1（70）1（6.0）1（2 000）16.88 2 12（2.5）2（80）2（6.5）2（2 400）18.64 3 13（3.0）3（90）3（7.0）3（2 800）20.84 4 14（3.5）4（100）4（7.5）4（3 200）22.34 52（45）123420.06 6 2 2 1 4 319.07 A酶解温度/℃B酶解时间/h C底物质量浓度/（g/因素水解度/% D酶解pH 7 220.88 8 2 4 3 2 119.81 2 3 4 1 93（50）134219.46 103243120.08 113312420.68 123421321.84 134（55）142321.08 144231422.56 154324119.39 164413222.00 K 179.7077.4878.6382.1676.16 K 279.8280.3579.9380.2180.98 K 382.0281.7982.6782.9881.83 K 485.0386.9985.3881.2686.64 R5.339.516.752.7710.48较优组合A 4B 4C 4D 3E 4

表6　中性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白试验方差分析结果
Table 6 Analysis of variance for hydrolysis with neutral protease

方差来源离均差平方和自由度均方F值显著性校正模型101.146156.743139.99** A酶解温度17.54935.850121.44** B酶解时间28.26739.422195.61** C底物质量浓度15.24535.082105.50** D酶解pH4.34231.44730.05** E加酶量35.742311.914247.34**误差1.541320.048

由表6可知，中性蛋白酶的酶解温度、酶解时间、底物质量浓度、酶解pH值与加酶量5 个因素对澳洲坚果粕蛋白水解度的影响达到了极显著水平（P＜0.01），酶解时均应将其控制在最优水平上。故确定酶解温度55 ℃、酶解时间3.5 h、底物质量浓度100 g/L、酶解pH 7.0、加酶量3 200 U/g为中性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白制备多肽的最佳工艺条件。

3　结论

液压压榨澳洲坚果粕中蛋白质含量为32.25%、17 种氨基酸总含量为25.05%，品质优良，适于多肽的制备。通过单因素试验与正交试验确定的碱性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白最佳工艺条件为：酶解温度60 ℃、酶解时间3.5 h、底物质量浓度110 g/L、酶解pH 8.0、加酶量2 400 U/g，在此条件下，水解度达到了22.83%，多肽产率达到了60.25%；中性蛋白酶最佳工艺条件为：酶解温度55 ℃、酶解时间3.5 h、底物质量浓度100 g/L、酶解pH 7.0、加酶量3 200 U/g，水解度达到了22.78%，多肽产率达到了58.85%。

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Optimizing the Preparation of Crude Peptides from Hydraulic Mac　adamia Nut Meal by Enzymatic Hydrolysis

GUO Gangjun 1, ZOU Jianyun 1, HU Xiaojing 2, HUANG Yanli 3, HUANG Kechang 1
(1. Yunnan Institute of Tropical Crops, Jinghong 666100, China; 2. School of Chemistry and Engineering, Wenshan University, Wenshan 663000, China; 3. College of Tropical Crops, Yunnan Agricultural University,　Puer 665000, China)

Abstract：Proximate nutritional components and amino acid composition were analyzed in hydraulic macadamia nut meal. Further, crude p eptides were prepared by enzy　matic hydrolysis of macadamia nu t meal with either alkaline or neutral protease. The effects of fi ve processing conditions on the degree of hydrolysis were explored by single factor and orthogonal array design methods in order to optimize these conditions. Results showed that hydraulic macadamia nut meal contained 32.25% protein consisting of 17 amino acids with a total content of 25.05%. The effect of fi ve processing conditions on the degree of hydrolysis of macadamia nut meal protein with alkaline protease was in the descending order of hydrolysis time, reaction temperature, enzyme dosage, pH, and substrate concentration. The optima l hydrolysis conditions were found to be reaction at 60 ℃ and pH 8.0 for 3.5 h with a substrate concentration of 110 g/L and an enzyme dosage of 2 400 U/g, giving a degree of hydrolysis as high as 22.83%. In the case of hydrolysis with neutral protease, the decreasing order of five processing conditions was enzyme dosage, hydrolysis time, substrate concentration, temperature, and pH, and their optimal levels that provided maximum degr ee of hydrolysis as high as 22.78% were determined as 3 200 U/g, 3.5 h, 100 g/L, 55 ℃, and 7.0, respectively. In both cases, the effect of fi ve processing conditions on the degree of hydrolysis reached up to a signifi cant level (P ＜ 0.01). Under the optimized hydrolysis conditions, alkaline protease was superior to neutral protease in preparing crude peptides from macadamia nut meal prot ein.

Key words：macad amia nut meal; protease; degree of hydrolysis; crude peptide

基金项目：云南省热带作物科技创新体系建设专项（RF2014-17；RF2015-2-2；RF2016-7）；

作者简介：郭刚军（1980—），男，助理研究员，硕士，研究方向为食品加工和植物中天然产物提取分离与功能。

液压压榨澳洲坚果粕酶解制备多肽工艺优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　结论