过氧乙酸消毒液处理动物性食品后氨基脲的生成量变化

叶 刚 1,梁通雯 1,淮文蓓 2,谢冬冬 1,沈金灿 1,*,张 毅 1,康海宁 1

(1.深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,深圳市食品安全检测技术研发重点实验室,广东 深圳 518045;2.广东药科大学中药学院,广东 广州 528458)

摘 要:过氧乙酸作为一种高效、广谱的消毒剂在动物性食品的消毒中被广泛使用,但实验发现经过氧乙酸消毒液处理后的样品易产生氨基脲。为研究不同条件下经过氧乙酸消毒处理后食品中氨基脲生产量的差异,系统考察了过氧乙酸添加量、浸泡温度、浸泡时间、不同动物基质样品等因素对氨基脲生成量的影响。样品经过氧乙酸溶液处理后,加入过量的Na 2S 2O 3除去未反应的过氧乙酸,在酸性条件下采用2-硝基苯甲醛进行衍生,乙酸乙酯提取,液相色谱-串联质谱仪测定,同位素内标法定量。结果表明:过氧乙酸添加量、浸泡温度及浸泡时间与氨基脲的生成量呈明显的正相关性。

关键词:过氧乙酸;消毒;动物性食品;氨基脲

叶刚, 梁通雯, 淮文蓓, 等. 过氧乙酸消毒液处理动物性食品后氨基脲的生成量变化[J]. 食品科学, 2016, 37(17): 190-194.

YE Gang, LIANG Tongwen, HUAI Wenbei, et al. Differences of semicarbazide content in animal-derived foods disinfected by peroxyacetic acid disinfectant[J]. Food Science, 2016, 37(17): 190-194. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617032. http://www.spkx.net.cn

氨基脲(semicarbazide,SEM)属于联胺类化合物中的一种,它不仅具有致诱变性和潜在的致癌性,而且还可对神经系统、内分泌系统的功能产生影响 [1-2]。一直以来,SEM被当作是硝基呋喃类兽药呋喃西林的代谢产物 [3-4],因此常作为监测食品中非法使用呋喃西林的残留标志物。但近期的研究发现食品中SEM来源于多种途径,除了呋喃西林原药在动物体内代谢会产生SEM外 [3-5],食品或食品接触材料中偶氮甲酰胺(azodicarbonamide,ADC)的高温热解 [6-8],甲壳类动物自身的天然产物 [9-11],以及食品的化学消毒处理均易导致SEM的污染 [12-16]。近年来化学消毒作为一种快捷有效的消毒方式被越来越多的应用于食品的消毒处理 [17-18]。过氧乙酸消毒液是一种具有重要用途的广谱、高效杀菌剂,对各种微生物,包括细菌繁殖体、芽孢、霉菌、病毒具有高效和快速杀灭效果,且使用后不留残毒、对环境友好,在食品、医疗、防疫等领域上有广泛的应用 [19-21]。Hoenicke等 [13]的研究表明采用含氯的消毒剂次氯酸钠处理食品会导致SEM的生成,而对于过氧乙酸消毒液处理后食品是否会产生SEM目前鲜见报道。本实验在前期研究 [12-14]的基础上,以过氧乙酸消毒液为消毒剂对动物食品进行处理,在其消毒产物中发现有明显的SEM,并系统考察过氧乙酸添加量、浸泡温度、浸泡时间、不同动物基质样品等因素对SEM生成量的影响。研究结果对于指导食品企业控制和减少消毒食品中SEM的生成具有重要参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡爪、鸡肉、牛肉、猪肉、罗非鱼 广东省深圳市超市。

SEM盐酸盐和SEM同位素标准品( 13C 15N-SEM,纯度≥99%) 德国Dr.Ehrenstorfer公司;过氧乙酸溶液天津富宇精细化工有限公司;乙酸铵(分析纯,下同)、磷酸钠、氢氧化钠、氯化钠、硫代硫酸钠天津市福晨化学试剂厂;甲醇(色谱纯,下同)、乙酸乙酯、正己烷、乙腈 德国Merck公司;2-硝基苯甲醛(≥98.0%) 上海安谱科学仪器有限公司;实验用水由Milli-Q纯水仪制备。

1.2 仪器与设备

Milli-Q纯水仪 美国Millipore公司;Xevo TQ-S型液相色谱-串联质谱仪 美国Waters公司;Turbo Vap LV型吹氮浓缩仪 美国Zymark公司;旋涡振荡器 台湾Polytron公司;3-18K型高速冷冻离心机 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

1.3.1.1 过氧乙酸溶液消毒处理

称取样品1.00 g于10 mL离心管中,根据实验要求分别加入不同质量分数的过氧乙酸溶液2.0 mL,旋涡振荡30 s,置于25 ℃的振荡器上振荡2 h,反应结束加入1 mL 1.0 mol/L的Na 2S 2O 3溶液以除去未反应的过氧乙酸。

1.3.1.2 SEM的衍生与提取净化

SEM的衍生与提取净化参考GB/T 21311—2007《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相串联质谱法》 [22]和SN/T 1627—2005《进出口动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量测定方法 高效液相色谱串联质谱法》 [23]。经过氧乙酸溶液处理后的样液中加入3 mL 0.4 mol/L HCl溶液,再加入0.1 mL 20 mg/L内标工作液,涡旋混合30 s,使内标物完全渗透到样品中;再加入0.1 mL 30 mg/mL的2-硝基苯甲醛溶液,涡旋30 s后,置于37 ℃恒温振荡器中振荡衍生16 h。衍生后,溶液中加入0.5 mL 0.3 mol/L的Na 3PO 4溶液混匀,用0.2 mol/L HCl或NaOH溶液将pH值调至7.0~7.5;加入5.0 mL 乙酸乙酯,涡旋60 s,以10 000 r/min离心5 min,取上层清液至15 mL离心管;剩余残渣再加入5.0 mL乙酸乙酯进行提取,13 000 r/min离心5 min后合并上清液,提取液于40 ℃水浴条件下氮气吹干。准确加入1.0 mL 的5 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇溶液(9∶1,V/V)溶解残渣,再加入2.0 mL正己烷,涡旋混合1 min;10 000 r/min离心5 min,去除上层溶液后过0.22 μm滤膜,供液相色谱-串联质谱测定。

1.3.1.3 样品处理

以鸡爪为样品,取1.00 g鸡爪可食性部分,加入不同质量分数(0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%及2.0%)的过氧乙酸溶液2 mL,按1.3.1.1、1.3.1.2节进行样品处理及测定,考察不同质量分数过氧乙酸处理对鸡爪中SEM生成量的影响。

以鸡爪为样品,取1.00 g鸡爪可食性部分,加入不同质量分数(0.3%、0.5%、0.8%和1.0%)过氧乙酸2.0 mL后分别置于4、25、37 ℃这3 种不同温度的振荡器上振荡2 h,按1.3.1.1、1.3.1.2节进行样品处理及测定,考察不同温度对样品中SEM生成量的影响。

以鸡爪为样品,取1.00 g鸡爪可食性部分,加入0.5%过氧乙酸溶液2.0 mL,分别置于振荡器上振荡2、4、8、16 h,按1.3.1.1、1.3.1.2节进行样品处理及测定,考察不同处理时间对SEM生成量的影响。

选取鸡爪、鸡肉、牛肉、猪肉、罗非鱼5 种不同动物基质样品,分别取1.00 g可食性部分,以未经过氧乙酸溶液处理样品为空白对照组,样品中分别加入0.5%和1.0%过氧乙酸溶液各2 mL,按1.3.1.1、1.3.1.2节进行样品处理及测定,考察不同基质中SEM生成量。

1.3.2 液相色谱-串联质谱分析条件

1.3.2.1 液相色谱条件

色谱柱:Acquity Beh C 18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱温:25 ℃;流速:250 μL/min;流动相:A为0.1%甲酸(含5 mmol/L乙酸铵)溶液,B为甲醇;进样量:10 μL。梯度洗脱条件为:0~5 min内,90% A;5.1~6.0 min内,50% A;6.1~7.5 min内,0% A。

1.3.2.2 质谱条件

离子源:电喷雾离子源,正离子检测,多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式,采集离子对及对应参数设置见表1;离子源温度:120 ℃;去溶剂温度:350 ℃;锥孔气流流速:100 L/h;去溶剂气流流速:600 L/h;碰撞气体为氩气,碰撞气压:2.6×10 -4Pa;毛细管电压:3.5 kV。

表1 MRM所用的母离子与子离子
Table 1 Precursor/daughter ions used in MRM

碰撞能量/V SEM2091340.072512 2091660.072510 13C 15N-SEM2121680.071010化合物母离子(m/z)子离子(m/z)驻留时间/s锥孔电压/V

1.4 数据处理

采用Waters公司的Masslynx软件对结果进行分析。样品平行测定3 份,结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 质量控制

测定处理后的样品和标准工作溶液,以SEM质量浓度为横坐标,SEM峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标,绘制标准工作曲线。SEM质量浓度在0~10.00 μg/L范围内与其峰面积比值呈良好的线性关系,回归方程为y=-0.028 033 5+5.547 14x(R 2=0.999 1)。分别以3 倍和10 倍的信噪比作为方法的检出限和定量限,测得该方法检出限为0.03 μg/kg(R SN≥3),定量限为0.10 μg/kg(R SN≥10)。

采用未经过氧乙酸溶液处理的鸡爪为空白样品,分别添加0.5、1.0、2.0 μg/kg这3 个不同水平的SEM标准溶液,每个水平平行测定6 份样品,样品的平均回收率分别为107.1%、93.1%和98.9%,相对标准偏差分别为5.3%、4.7%和4.6%。

2.2 过氧乙酸质量分数对SEM生成量的影响

由图1可知,溶液中不含有过氧乙酸或者过氧乙酸的质量分数较低(≤0.1%)时,未有SEM检出;当溶液中过氧乙酸质量分数达到0.2%,SEM能明显被检测出来,且随着过氧乙酸质量分数的增加,SEM的生成量不断在增加,SEM的生成量与溶液中过氧乙酸质量分数呈正相关关系,线性相关系数为0.951 1。魏云计等 [24]在追溯宠物饲料中SEM的来源时发现,双氧水处理过的宠物饲料能检出SEM,可能主要是由于H 2O 2会使饲料中的动物组织成分分解游离出氨基酸,部分游离的氨基酸(如精氨酸、组氨酸)分解可以产生SEM,动物组织中的代谢物尿素和氨在双氧水存在条件下也可能反应生成SEM。由于过氧乙酸溶液为过氧化氢、乙酸、过氧乙酸、水的平衡混合液 [25],因此其中的H 2O 2可能是产生SEM的主要原因。

图1 过氧乙酸质量分数对SEM生成量的影响(n=33)
Fig. 1 Effect of peroxyacetic acid concentration on the production of SEM (n = 3)

2.3 浸泡温度对SEM生成量的影响

图2 浸泡温度对SEM生成量的影响
Fig. 2 Effect of soaking temperature on the production of SEM

由图2可知,随着温度的升高SEM的生成量逐渐增大,在过氧乙酸质量分数为0.3%、0.5%、0.8%、1.0%条件下,SEM的生成量分别从0.664、1.436、3.125、3.423 μg/kg(4 ℃)增加到1.164、2.387、3.548、4.369 μg/ kg(37 ℃)。尤其是对于低质量分数(≤0.5%)过氧乙酸溶液中SEM的生成量影响最为明显,0.3%过氧乙酸溶液中SEM的生成量在37 ℃条件下比在4 ℃条件下增加了75.3%,而1.0%过氧乙酸溶液中SEM的生成量在37 ℃条件下比在4 ℃条件下仅增加了27.6%。故温度对于低质量分数过氧乙酸溶液中SEM生成量的影响较高质量分数过氧乙酸的来说更为明显。由于过氧乙酸溶液不稳定,因此温度的升高虽然有利于SEM的生成,但在较高质量分数过氧乙酸下也可能导致其快速分解,因此浸泡温度对于高质量分数过氧乙酸溶液中SEM生成量的正相关性较低质量分数过氧乙酸不显著。

2.4 浸泡时间对SEM生成量的影响

图3 浸泡时间对SEM生成量的影响
Fig. 3 Effect of soaking time on the generation of SEM

由图3可知,在所考察的浸泡时间范围内,随着时间的延长,溶液中SEM的生成量不断增加,SEM的生成量与浸泡时间呈正相关性。该结果表明,为了尽量控制和减少食品中SEM的生成,应尽可能缩短消毒处理时间。

2.5 不同动物基质样品SEM生成量的差异

表2 不同动物基质样品经过氧乙酸溶液处理后SEM生成量
Table 2 Production of SEM in different animal samples after treatment with peroxyacetic acid solution µg/kg

注:ND.未检出。

样品鸡爪鸡肉牛肉猪肉罗非鱼空白对照组NDNDNDNDND 0.5%过氧乙酸1.2821.2571.0060.8800.487 1.0%过氧乙酸2.0802.1032.0341.4440.904

由表2可知,不同动物性基质样品经过氧乙酸溶液处理后都能产生SEM,但不同基质SEM的生成量存在一定差异。在5 种样品中,鸡爪与鸡肉SEM的生成量最高,牛肉次之,罗非鱼最少,罗非鱼中SEM生成量约为鸡肉SEM生成量的40%。此外,随过氧乙酸质量分数增高,不同动物基质样品的SEM生成量均有明显增加,该结果与2.2节的结论相符合。

Hoenicke等 [13]研究次氯酸钠处理食品中SEM的生成原因时发现,食品经消毒水处理后分解产生氨基酸或氨基酸衍生物,其中含有胍基的氨基酸(如精氨酸、组氨酸)可以与消毒剂反应产生SEM。过氧乙酸与次氯酸钠均为强氧化剂,可能存在类似产生机制。为了进一步证实SEM的来源与精氨酸和组氨酸有关,实验分别称取0.5 mmol精氨酸及组氨酸为样品,采用与动物性食品相同的样品处理方法及测定程序,分别在处理后的样品中检出8.37 μg/kg和26.9 μg/kg的SEM,该结果表明精氨酸、组氨酸可能是动物组织经过氧乙酸处理后产生SEM的一大来源,其具体反应机理有待进一步研究。

3 结 论

一直以来过氧乙酸消毒液被认为安全、无毒无害的高效消毒剂,但有关其消毒后是否会与食品基质反应产生有毒有害物质的研究较少,本研究发现经过氧乙酸溶液消毒处理动物性食品样品会产生SEM,并系统探究了过氧乙酸添加量、浸泡温度、浸泡时间及不同动物基质对SEM生成量的影响,结果表明,过氧乙酸添加量、浸泡温度、浸泡时间与SEM的生成量呈正相关性;动物性食品样品经过氧乙酸溶液处理后均会产生SEM,且其生成量存在明显差异,这可能与其含氮物质组成差异密切相关。该研究结果对于指导食品生产企业控制和减少采用过氧乙酸消毒液进行消毒而导致食品中SEM的生成、提高产品竞争力具有重要参考价值。

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Differences of Semicarbazide Content in Animal-Derived Foods Disinfected by Peroxyacetic Acid Disinfectant

YE Gang 1, LIANG Tongwen 1, HUAI Wenbei 2, XIE Dongdong 1, SHEN Jincan 1,*, ZHANG Yi 1, KANG Haining 1
(1. Shenzhen Key Laboratory of Detection Technology R&D on Food Safety, Food Inspection and Quarantine Center of Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China; 2. Traditional Chinese Medicine College, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 528458, China)

Abstract:Peroxyacetic acid is widely used in animal-derived foods disinfection since it is an effective and broad spectrum disinfectant; however, our experiments have found that semicarbazide could be detected in samples treated by peroxyacetic acid disinfectant. To study different contents of semicarbazide after treatment with peroxyacetic acid under different conditions, the effects of peroxyacetic acid concentration, temperature, treatment time and different animal-derived foods samples on the generation of semicarbazide were investigated. After samples were treated with peroxyacetic acid solution, excessive Na 2S 2O 3was added to remove the unreacted peroxyacetic acid for the derivatization of semicarbazide into 2-nitrobenzaldehyde under acidic conditions. The preparation was extracted with ethyl acetate, and then the extract was detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and quantifi ed by isotope internal standard method. The results showed that peroxyacetic acid concentration, temperature and treatment time had a signifi cant positive correlation with the yield of semicarbazide, respectively.

Key words:peroxyacetic acid; disinfection; animal-derived foods; semicarbazide

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617032

中图分类号:TS207.5

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)17-0190-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617032. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-01-07

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31201444)

作者简介:叶刚(1982—),男,工程师,本科,研究方向为食品检测。E-mail:358455081@qq.com

*通信作者:沈金灿(1978—),男,研究员,博士,研究方向为药物残留。E-mail:jincansh@263.net

引文格式: