图1 染料木黄酮对3T3-L1细胞存活率的影响
Fig. 1 Effect of genistein on the survival rate of 3T3-L1 cells
胡文敏，张 岭，李林子，张丽婧，胡志航，陈建国，刘冬英，刘 臻，王 茵 *
（浙江省医学科学院，浙江 杭州 310013）
摘 要：目的：研究染料木黄酮是否通过雌激素受体介导影响3T3-L1前脂肪细胞成脂分化，并探讨其可能的机制。方法：以不同浓度染料木黄酮处理3T3-L1细胞，四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法测定细胞存活率；在3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中分别加入不同浓度染料木黄酮、染料木黄酮和ICI182780（一种雌激素受体抑制剂）混合物及不同浓度雌二醇，油红染色观察分化结果，测定细胞甘油三酯（triglyceride，TG）含量；染料木黄酮、染料木黄酮和ICI182780混合物及不同浓度雌二醇处理诱导成熟后的脂肪细胞，测定培养液甘油含量；分别用染料木黄酮（30 μmol/L）、染料木黄酮（30 μmol/L）和ICI182780混合物干预细胞成脂分化，Western blotting法检测细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p-ERK、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）、p-AMPK、激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase，HSL）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）蛋白表达量。结果：3T3-L1细胞存活率随染料木黄酮浓度的升高而降低，50～200 μmol/L染料木黄酮能抑制细胞生长（P＜0.01）；染料木黄酮能负向调节成脂分化后细胞胞浆内TG含量，在0～50 μmol/L浓度范围内呈剂量依赖关系，高剂量雌二醇（100 nmol/L）能下调TG含量；染料木黄酮能促进成熟脂肪细胞脂解，提高细胞培养液甘油浓度；染料木黄酮（30 μmol/L）能上调p-AMPK、HSL蛋白表达，下调FAS蛋白表达（P＜0.01），对ERK、p-ERK、AMPK表达量无明显影响（P＞0.05）。ICI182780（1 μmol/L）能部分阻断染料木黄酮（30 μmol/L）对p-AMPK的调节作用（P＜0.05）。结论：染料木黄酮能抑制3T3-L1细胞成脂分化，其机制可能是染料木黄酮一方面下调FAS蛋白表达，抑制脂肪合成，另一方面激活AMPK-HSL途径促进脂肪分解；染料木黄酮还可能通过非雌激素受体途径抑制3T3-L1细胞成脂分化。
关键词：染料木黄酮；3T3-L1细胞；磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶；激素敏感性脂肪酶；脂肪酸合成酶
胡文敏, 张岭, 李林子, 等. 染料木黄酮抑制3T3-L1细胞成脂分化机制[J]. 食品科学, 2016, 37(17): 219-224. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201617037. http://www.spkx.net.cn
HU Wenmin, ZHANG Ling, LI Linzi, et al. Anti-adipogenic effect of genistein in 3T3-L1 cells and its mechanism[J]. Food Science, 2016, 37(17): 219-224. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617037. http://www.spkx.net.cn
肥胖是脂肪代谢紊乱的结果，表现为脂肪大量沉积及脂肪分布失衡。更年期肥胖已成为重要的公共卫生问题，与绝经前女性相比，更年期女性身体脂肪沉积量呈明显上升趋势，尤其表现为腹部脂肪增多，脂肪肝患病率升高，雌激素替代治疗能改善更年期女性脂肪代谢，减少脂肪合成，改善腹型肥胖症状 [1-2]。在细胞层面上，肥胖的产生表现为脂肪细胞体积增大及脂肪细胞数量增多 [3]，因此抑制前脂肪细胞增殖分化也是预防和治疗肥胖的方法之一。
染料木黄酮（genistein，Gen）是大豆异黄酮中的主要活性成分，与内源性雌激素结构相似，具有植物雌激素样作用。染料木黄酮能延缓更年期，减少更年期相关疾病的发生率，其机制可能与其雌激素效应有关 [4]，现有研究已证明染料木黄酮能抑制3T3-L1前脂肪细胞成脂分化，改善大鼠脂代谢，降低去势雌鼠体质量，促进去势雌鼠脂肪细胞凋亡及脂肪分解代谢 [5-7]。吴丹等 [8]研究表明染料木黄酮（10～50 μmol/L）能减轻HepG2细胞脂肪变状态，并呈剂量依赖关系。本实验将探讨染料木黄酮对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的作用是否由雌激素受体介导，并通过检测脂肪代谢相关信号蛋白的表达，进一步分析染料木黄酮抑制脂肪细胞分化的机制。
1.1 材料与试剂
小鼠3T3-L1成纤维细胞，由中国科学院上海细胞库提供。
胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、染料木黄酮、油红、雌二醇 美国Sigma公司；胰酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） 杭州吉诺公司；新生牛血清（130105）杭州四季青公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）以色列Biological Industries公司；组织细胞甘油三酯（triglyceride，TG）酶法测定试剂盒、液体样本甘油含量酶法测定试剂盒 北京普利莱基因技术有限公司；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（KGA312） 南京凯基生物发展有限公司；激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase，HSL）抗体 美国Santa Cruz公司；腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）抗体、p-AMPK、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p-ERK、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）抗体美国Cell Signaling公司；磷酸甘油醛脱氢酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase） 杭州贤至生物科技有限公司；荧光二抗 美国Licor公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；BB150二氧化碳培养箱 美国Thermo Sciencetifi c公司；5417R低温高速离心机 德国Eppendorf公司；TDL-4低速离心机 上海安亭科学仪器厂；DKS22型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；SpectraMax M4多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司。
1.3 方法
1.3.1 3T3-L1细胞培养
3T3-L1细胞用含10%新生牛血清的DMEM完全培养基培养于37 ℃、5% CO 2的恒温培养箱中，当细胞密度达到70%时用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化，1∶5传代，取对数期细胞用于实验。
1.3.2 MTT细胞增殖实验
将3T3-L1细胞接种于96 孔板，接种密度为5×10 4个/mL，每孔100 μL，设空白组（未接种细胞）、对照组和Gen（5、10、20、30、50、100、200 μmol/L）组，置于37 ℃、5% CO 2的恒温培养箱中培养12 h。弃培养基，空白组及对照组加100 μL完全培养基，Gen组分别加等体积含各剂量染料木黄酮的完全培养基，调整各组二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）体积分数至0.01%。培养48 h后每孔加50 μL MTT液，于培养箱中孵育4 h后取出，2 000 r/ min离心5 min，小心吸去培养液，每孔加150 μL DMSO，避光摇床振摇15 min使紫色结晶充分溶解，用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度，计算细胞存活率。
1.3.3 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化
取对数生长期的3T3-L1细胞接种于6 孔板，接种密度为2×10 4个/mL，每隔2 d换液一次。细胞接触性抑制2 d后（d0）加诱导剂Ⅰ进行诱导，培养60 h后换诱导剂Ⅱ，诱导剂Ⅱ培养3 d后（d6），约90%的3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。诱导剂Ⅰ组成：1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（0.5 mol/L）、地塞米松（1 μmol/mL）、胰岛素（insulin，INS）（10 μg/mL）、10% FBS；诱导剂Ⅱ组成：INS（10 μg/mL）、10% FBS。药物干预组诱导剂Ⅰ、Ⅱ含各剂量干预药物。
1.3.4 油红染色
将0.6 g油红溶于200 mL异丙醇中，过滤，配制成油红贮备液，染色前取一定量油红贮备液加双蒸水以3∶2的比例混匀，过滤，静置10 min，取配制好的油红上清液用于染色。染色前用10%的甲醛溶液固定细胞1 h，弃固定液，用60%异丙醇溶液小心漂洗细胞，加当天配制的油红上清液染色20 min，弃油红染液，双蒸水小心漂洗3 遍，至倒置显微镜下观察分化结果。
1.3.5 细胞TG含量测定
取对数生长期的3T3-L1细胞接种于6 孔板，接种密度为2×10 4个/mL，按1.3.3节方法进行分组诱导分化。取d6期细胞，用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞两次，细胞刮收集细胞，按组织细胞TG酶法测定试剂盒测定TG含量，剩余裂解后的细胞用二辛可宁酸（butyleyanoacrylate，BCA）法测定蛋白含量用于校正TG值。
1.3.6 脂肪分解测定
取对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞，按2×10 4个/孔的密度接种到24 孔板中进行诱导分化（方法如1.3.3节中对照组），诱导分化成熟后，小心吸去培养基，用37 ℃预热的无酚红DMEM培养基洗涤细胞，分别加1 mL含各剂量组干预药物的无酚红培养液（无血清），作用7 h后吸取上层培养基，按照普利莱基因技术有限公司的液体样品甘油含量甘油磷酸氧化酶（glycerol-3-phosphate oxidase，GPO）-过氧化物酶（peroxidase，POD）酶法测定试剂盒测定甘油含量。各组培养液DMSO体积分数均为0.01%。
1.3.7 蛋白印记分析
取对数生长期的3T3-L1细胞接种于6 孔板进行分组诱导（方法如1.3.3节中对照组），取d6期细胞，用4 ℃预冷的PBS洗涤两次，加细胞裂解液裂解，4 ℃摇床20 min后，13 000 r/min离心10 min，取中间层清液，重复离心一次。取10 μL样品蛋白用BCA法测定蛋白含量，将剩余样品用裂解液稀释到同一蛋白浓度，加入5×Loading Buffer于100 ℃煮样变性5 min，冷却后涡旋混匀，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，转膜，30 ℃封闭1.5 h，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜，30 ℃荧光二抗孵育1 h，洗膜，用Odyssey荧光扫描仪扫描荧光信号。
1.4 数据统计分析
两组间比较用t检验，组间多重比较用最小显著差法。P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。
2.1 染料木黄酮对3T3-L1细胞增殖的影响
3T3-L1细胞分别在含0、5、10、20、30、50、100、200 μmol/L染料木黄酮的培养液中培养48 h。如图1所示，与对照组（0 μmol/L）相比，50、100、200 μmol/L染料木黄酮能明显抑制3T3-L1细胞增殖，差异有统计学意义（P＜0.01）；5、10、20、30 μmol/L染料木黄酮对3T3-L1细胞增殖无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05）。
图1 染料木黄酮对3T3-L1细胞存活率的影响
Fig. 1 Effect of genistein on the survival rate of 3T3-L1 cells
2.2 3T3-L1细胞成脂分化结果
图2 3T3-L1细胞诱导至d6期的油红染色结果
Fig. 2 Oil red staining results for 3T3-L1 cells at d6 stage
对照组3T3-L1细胞诱导分化至d6期90%的细胞分化成熟，油红染色后可见密集的红色圆环状脂肪细胞群（图2）。30 μmol/L染料木黄酮干预组d6期细胞分化率明显低于对照组，油红染色后红色圆环状脂肪细胞分布较稀疏，仍有许多未着色细胞群。
2.3 细胞胞浆内的TG含量
在3T3-L1细胞成脂分化过程中分别加0、5、10、20、30、50 μmol/L染料木黄酮（表示为G0～G50）及雌二醇（1、100 nmol/L，表示为E1、E100）。如图3所示，与对照组（G0）相比，100 nmol/L雌二醇能使3T3-L1细胞TG含量降低10%（P＜0.05），20、30、50 μmol/L染料木黄酮能明显抑制3T3-L1成脂分化，降低细胞胞浆中TG含量，抑制率分别为12%、22%、64%，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），而雌激素受体抑制剂ICI182780能部分阻断染料木黄酮对细胞胞浆中TG的调节作用（G30＋IC）。因此，染料木黄酮可抑制3T3-L1前脂肪细胞成脂分化，并呈剂量依赖关系，雌激素受体抑制剂不能完全阻断染料木黄酮对细胞胞浆中TG的调节作用，而高剂量的雌二醇（100 nmol/L）也可降低3T3-L1细胞TG含量。
图3 染料木黄酮和雌二醇对3T3-L1细胞TG含量的影响（分化至d6期）
Fig. 3 Effect of genistein and estradiol on triglyceride levels (d6)
2.4 培养液中的甘油浓度
对分化成熟的脂肪细胞进行分别进行染料木黄酮干预和雌二醇干预，染料木黄酮干预浓度分别为0、10、20、30、50 μmol/L，雌二醇干预浓度分别为1、100 nmol/L。如图4所示，与对照组（G0）相比，20、30、50 μmol/L的染料木黄酮显著或极显著促进脂肪细胞脂解（P＜0.05或P＜0.01），分别使细胞培养基中甘油含量上调14%、17%、31%；高剂量的雌二醇（100 nmol/L）使培养液中甘油含量上调12%，差异有统计学意义（P＜0.05）。雌激素受体抑制剂ICI182780不能完全阻断染料木黄酮对培养液甘油的调节作用，与G30组相比，差异无统计学意义。以上结果提示染料木黄酮促进脂肪细胞脂解，并呈剂量依赖关系，高剂量雌二醇能促进脂肪细胞脂解。
图4 染料木黄酮和雌二醇对成熟脂肪细胞脂解作用的影响
Fig. 4 Effect of genistein and estradiol on adipocyte lipolysis
2.5 染料木黄酮对ERK、p-ERK表达的影响
图5 染料木黄酮对ERK、p-ERK表达的影响
Fig. 5 Effect of genistein and estrogen on the expression of ERK and p-ERK
如图5所示，与对照组（G0）相比，30 μmol/L染料木黄酮干预对ERK、p-ERK蛋白表达量无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05）。这提示染料木黄酮不通过ERK/p-ERK途径抑制3T3-L1细胞成脂分化。
2.6 染料木黄酮对AMPK、p-AMPK表达的影响
图6 染料木黄酮对AMPK、p-AMPK表达的影响
Fig. 6 Effect of genistein and estrogen on the expression of AMPK and p-AMPK
如图6所示，与对照组（G0）相比，G30组细胞AMPK表达量无明显差异（P＞0.05），p-AMPK表达量上调74%，差异具有统计学意义（P＜0.01）；G30＋IC组AMPK表达量无明显差异（P＞0.05），p-AMPK表达量上调53%，差异有统计学意义（P＜0.01）。与G30组相比，G30＋IC组AMPK表达量无明显差异（P＞0.05），p-AMPK表达量下调（P＜0.05）。以上结果说明染料木黄酮可能通过上调p-AMPK表达，激活AMPK相关途径抑制3T3-L1细胞成脂分化，此作用能被高剂量雌激素受体抑制剂ICI182780部分阻断。
2.7 染料木黄酮对HSL表达的影响
图7 染料木黄酮对HSL表达的影响
Fig. 7 Effect of genistein and estrogen on the expression of HSL
如图7所示，与对照组（G0）相比，G30组细胞HSL表达量上调81%，G30＋IC组HSL表达量上调72%，差异有统计学意义（P＜0.01）。与G30组相比，G30＋IC组HSL表达量无明显差异（P＞0.05）。这提示染料木黄酮可能通过上调HSL表达促进脂肪合成作用，此作用不能被雌激素受体抑制剂ICI182780阻断。
2.8 染料木黄酮对FAS表达的影响
图8 染料木黄酮对FAS表达的影响
Fig. 8 Effect of genistein and estrogen on the expression of FAS
如图8所示，与对照组（G0）相比，G30组细胞FAS表达量下调35%，G30＋IC组FAS表达量下调37%，差异有统计学意义（P＜0.01）。与G30组相比，G30＋IC组FAS表达量无明显差异（P＞0.05）。这提示染料木黄酮可能通过下调FAS表达抑制脂肪合成作用，此作用不能被雌激素受体抑制剂ICI182780阻断。
TG在细胞中的蓄积量是脂肪细胞成脂分化的评价指标。本实验结果显示，染料木黄酮可下调TG在细胞中的蓄积量，且呈剂量依赖关系。此外，有文献报道高剂量的染料木黄酮对3T3-L1有细胞毒性作用，在48 h干预培养实验中，其半数致死剂量为111.67 μmol/L [9]。因此，本实验采用染料木黄酮安全有效剂量30 μmol/L进行研究。
染料木黄酮与两种亚型雌激素受体ERα和ERβ都有亲和力，其中对ERβ的亲和力约为ERα的22 倍 [10]。低剂量染料木黄酮（10 –8～10 –5μmol/L）对3T3-L1的细胞增殖作用主要由ERα介导，在未分化的3T3-L1细胞中，染料木黄酮干预后ERα表达量下调，而对诱导分化初期的3T3-L1细胞，染料木黄酮干预48 h后ERα表达量上调1.98 倍 [11-12]。Phrakonkham等 [13]研究发现：染料木黄酮能影响ERα mRNA的表达，但其表达结果与细胞分化程度不相关；ERβ mRNA的表达量与细胞分化程度成负相关；染料木黄酮（100 μmol/L）能明显抑制细胞成脂分化，且同时上调ERα mRNA、ERβ mRNA水平。此外有研究表明，雌激素干预48 h能减少成熟脂肪细胞TG含量 [14]。为研究染料木黄酮对3T3-L1细胞的抑制作用是否通过雌激素受体介导，本实验采用雌激素受体拮抗剂ICI182780联合染料木黄酮对3T3-L1细胞进行干预诱导，结果显示染料木黄酮能明显抑制3T3-L1成脂分化且染料木黄酮的这种作用不能完全被雌激素受体抑制剂ICI182780阻断，雌激素对3T3-L1成脂分化有较弱影响，雌二醇（100 nmol/ L）能减少TG在细胞中蓄积，但其抑制效果弱于染料木黄酮（30 μmol/L）。
3T3-L1细胞成脂分化由多种信号通路介导。MAPK/ERK途径是经典的促细胞增殖途径，通过激活细胞周期相关蛋白，提高细胞增殖能力 [15]。在3T3-L1分化过程中，ERK在分化早期起重要作用，但另有研究表明激活后的ERK能抑制胰岛素诱导的3T3-L1细胞分化，这两种结论相悖 [16-17]。本实验发现染料木黄酮对ERK、p-ERK的表达无明显影响。
AMPK是生物能量代谢调节的关键因子。激活的AMPK可使乙酰辅酶A羧化酶、肉毒碱棕榈酰转移酶-1磷酸化从而抑制胆固醇、脂肪酸和TG的合成，增强线粒体功能，提高脂肪酸氧化速率 [18-19]。染料木黄酮能改善高脂大鼠肝脏脂肪代谢，减少肝脏脂质沉积，抑制3T3-L1成脂分化，其作用可能与p-AMPK蛋白表达上调有关 [20-21]。HSL主要在动物白色脂肪组织中表达，其生理作用主要表现为促进TG水解成甘油和游离脂肪酸以满足机体能量需要。Harada等 [22]研究表明HSL基因敲除小鼠白色脂肪组织的质量和TG的含量均下降，但棕色脂肪组织和肝脏中TG的含量均升高。本实验结果显示，染料木黄酮能显著上调p-AMPK（74%）和HSL（81%）表达，ICI182780能部分减弱染料木黄酮对p-AMPK的调节作用。
FAS是合成脂肪酸的关键酶，刘姚等 [23-24]研究发现青钱柳多糖能下调高脂血症小鼠肝脏及脂肪组织FAS表达，抑制3T3-L1细胞成脂分化，下调3T3-L1细胞FAS表达。已有的研究也表明染料木黄酮能抑制3T3-L1成脂分化，下调FAS表达 [6]。本实验发现染料木黄酮能下调FAS表达（37%），ICI182780、染料木黄酮联合应用对FAS表达量的影响与染料木黄酮单独作用效果无明显差异。
综上所述，染料木黄酮能抑制3T3-L1细胞成脂分化，此作用不完全由雌激素受体介导。染料木黄酮对3T3-L1细胞成脂分化的抑制作用可能通过p-AMPK、HSL、FAS信号通路介导完成。
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Anti-adipogenic Effect of Genistein in 3T3-L1 Cells and Its Mechanism
HU Wenmin, ZHANG Ling, LI Linzi, ZHANG Lijing, HU Zhihang, CHEN Jianguo, LIU Dongying, LIU Zhen, WANG Yin*
(Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China)
Abstract：Objective: To investigate the anti-adipogenic effect and underlying mechanism of genistein in 3T3-L1 cells and its estrogen receptor (ER) mediated pathway. Methods: After treated with various concentrations of genistein, the survival rate of 3T3-L1 cells was assessed by MTT assay. In addition, after treated with genistein, genistein-ICI182780, or estrogen, differentiation degree and lipid accumulation of the cells were assessed by oil red staining and a TG assay kit, and adipocyte lipolysis was assessed by a glycerin assay kit. After intervention by genistein or genistein-ICI182780, the expression of extracellular signal-regulated kinase (ERK), phospho-extracellular signal-regulated kinase (p-ERK), adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK), phospho-adenosine monophosphate activated protein kinase (p-AMPK), hormone sensitive lipase (HSL), and fatty acid synthetase (FAS) were analyzed by Western blotting. Results: Genistein and high-dose estrogen inhibited lipid accumulation of 3T3-L1 and increased lipolysis in adipocytes. The presence of ICI182780 partly decreased both functions of genistein. Furthermore, genistein increased the expression of p-AMPK and HSL, and decreased the expression of FAS. The presence of ICI182780 could slightly suppress the increase of p-AMPK caused by genistein intervention. Conclusion:Genistein can inhibit the adipogenesis and differentiation of 3T3-L1 cells via a non-ER pathway through a mechanism which may be relate to p-AMPK, HSL and FAS.
Key words：genistein; 3T3-L1 cell; phospho-adenosine monophosphate activated protein kinase (p-AMPK); hormone sensitive lipase (HSL); fatty acid synthetase (FAS)
收稿日期：2015-10-22
基金项目：浙江省医药卫生平台重点资助计划项目（2014ZDA004）；浙江省营养学医学支撑学科建设项目（11-zc03）；
浙江省科技厅创新团队建设与人才培养项目（2011F20038）；浙江省科技厅支撑学科建设项目（2013F10007）；浙
江省151人才培养项目；食品（保健食品）质量安全评价研究实验室建设项目（2015F10014）
作者简介：胡文敏（1991—），女，硕士研究生，主要从事营养学研究。E-mail：hwm616@163.com
*通信作者：王茵（1963—），女，研究员，本科，主要从事营养与健康关系研究。E-mail：wy3333@163.com
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201617037
中图分类号：R151
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）17-0219-06
引文格式：