食品安全快速检测方法评价技术研究进展

摘要：快速检测方法在食品安全领域现场检测、快速筛查和政府监管等方面起着非常重要的作用。然而当前市场上基于快速检测方法的产品还存在着质量参差不齐，使用方法不科学等诸多问题，亟需建立科学合理的快检产品评价方法，保障产品质量和指导实际使用。本文综述了国内外对快速检测方法（产品）评价技术的现状与进展，并结合粮油质量安全领域中的实际情况探讨其应用情况。

谢刚, 叶金, 王松雪. 食品安全快速检测方法评价技术研究进展[J]. 食品科学, 2016, 37(17): 270-274. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201617045.　http://www.spkx.net.cn

XIE Gang, YE Jin, WANG Songxue. Progress in the validation of rapid food safety detection methods[J]. Food Science, 2016, 37(17): 270-274. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617045.　http://www.spkx.net.cn

近年来食品安全事件频发，基于大型仪器的检测方法，通　常由于设备庞大、操作复杂、检测速度较慢、成本较高等弊端无法满足及时、快速、现场的食品安全检测需求。为了满足日益增长的食品安全现场快速监管需求，快速检测（快检）方法受到越来越多的重视。快检方法有别于大型仪器方法，是一种包括样品前处理，短时间内能对相关质量安全指标得出检测结果的技术 [1]。国际标准化组织（International Standardization Organization，ISO）将其描述为具有能够满足用户适当需求的性能，具有减少分析时间、易于操作或者可以自动操作、小型化、降低检测成本等优势的替代方法（alternative method） [2]。基于快检方法的快检产品是指诸如检测试剂盒、试纸条 [3-6]这类对快检技术的主要或关键组成进行了商品化包装，并可供销售的检测体系，用以确定一种或多种基质中目标分析物的存在或含量 [7]。

新修订的《中华人民共和国食品安全法》 [8]第一百一十二条中明确规定了“县级以上人民政府食品药品监督管理部门在食品安全监督管理工作中可以采用国家规定的快速检测方法对食品进行抽查检测”。《中华人民共和国农产品质量安全法》 [9]第三十六条中也规定了在农产品质量安全监督抽查中可“采用国务院农业行政主管部门会同有关部门认定的快速检测方法进行农产品质量安全监督抽查检测”。CAC/RCP 51—2003《预防与降低谷物中真菌毒素污染操作规范》 [10]中明确　提出需要发展“快速、经济、准确”的检测包。但是目前市场上的快检产品还存在诸多问题：生产厂家研发水平、产品质量参差不齐，影响着快检产品的检测可靠性；开发和应用脱节，快检产品难以满足市场监管和用户的实际需求。如何科学合理地使用快检产品和选择满足自身使用需求的快检产品同样是一个难题。因此，建立科学规范的快检产品评价方法，保障快检产品质量，规范并指导用户使用，具有非常重要的现实意义。本文对国内外相关的快检方法评价技术标准进行了综述，探讨了快检产品评价方法在粮油真菌毒素检测领域的应用。

1　可替代方法验证规范

国际标准化组织发布的《食品和饲料中微生物检测可替代方法验证规范》（ISO 16140:2003，Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Protocol for the Validation of Alternative Methods） [2]，是为数不多的针对快检方法评价的标准，为市场上的快检产品的评价认证提供了非常好的依据。该标准的评价内容包括两个方面：与参考方法对比的研究（methods comparison study）；联合实验室的研究（interlaboratory study）。定性方法性能参数包含：相对准确度、相对特异性、相对灵敏度、检测限、包容性和排他性；定量方法性能参数包含：线性、相对准确度、检测限、定量限、相对灵敏度、特异性（包容性和排他性）、重复性、重现性。

定性方法评价方面，在与参考方法的对比研究中，针对不同的基质分别进行评价，使用快检方法和参考方法测定相同的60 个样品（大约50%的阳性样品，50%的阴性样品），两种方法的前处理最好相同。根据最终结果，计算其相对准确度、相对特异性、相对灵敏度。在不同实验室间的联合研究中，至少选择10 家实验室；至少3 种不同污染水平（阴性对照、检测限、10 倍检测限，每个实验室对每个污染水平至少做8 个重复盲样。每种样品均进行快检方法和参考方法的测定，研究共计有480 个结果，评测其特异性、相对灵敏度、相对准确度。不同实验室均需要在规定的时间内完成评价。

定量方法评价方面，在与参考方法的对比研究中，针对不同的基质分别进行评价，主要评价线性、检测限、定量限、相对灵敏度、特异性（包容性，排他性）。在不同实验室间的联合研究中，至少选择8 家实验室，至少做96 个样品，包括高、中、低3 个水平；分别评价准确度、重复性、重现性。不同实验室需要在规定的时间内完成评价。

ISO 16140:2003提出了快检方法评价的通用原则（general principle）和技术协议（technical protocol），评价内容侧重方法的技术性能，参数多、指标全面、评价过程相对复杂，具有广泛的借鉴意义。

欧洲最为权威的第三方认证组织法国标准协会（Association Française de Normalisation，AFNOR）在ISO 16140:2003标准的基础上对快检方法的评价进行了补充修改（表1） [11]，发布了《食品微生物可替代方法验证》（Validation of Alternative Analytical Methods Application in Food Microbiology）。

表1　AFNOR与ISO标准的性能参数比较 [11]
Table 1 Comparison of test characteristics in AFNOR and ISO standard [11]

定性方法定量方法性能参数AFNORISO性能参数AFNORISO相对准确度√√线性√√相对特异性√√相对准确度√√相对灵敏度√√检测限√√检测限√√定量限√√包容性和　排他性√√相对灵敏度√√实用性√特异性（包容性和排他性）√√重复性√√重现性√√实用性√

AFNOR的评价规范增加了方法实用性（praticability of the alternative method）评价，如对快检方法操作时间、人员需要培训时间等的评价（表2）。快检产品的最大的优势之一就是易于使用，增加对其实用性的考察非常有必要，但是还不够完善，大多数评价内容没有相应的量化指标，不易于最终的评价与鉴定。

表2　AFNOR方法中实用性的评价内容 [11]
Table 2 Practicability evaluation of the alternative method [11]

内容方法使用条件专业实验室检验试剂体积专业实验室检验贮存条件（未开封产品的保质期）专业实验室检验首次使用后的使用方法（最长使用时间）专业实验室检验对其他实验装置的需求专业实验室检验试剂的配制方法专业实验室检验对不熟悉该方法操作人员所需要的培训时间描述为以下3 个类别：小于1 d；大于1 d小于1 周；大于1 周操作时间与参考方法比较：小于、等于或大于参考方法的操作时间出报告时间测试阳性样品所需时间和阴性样品所需时间操作员资质要求专业实验室检验参考方法的通用步骤专业实验室检验分析结果的可溯性专业实验室检验日常维护维护所需时间和频率

北欧食品安全分析委员会（Nordic Committee on Food Analysis，NordVal）也在ISO评价标准的基础上进行了的修改（表3），发布了《微生物检测可替代方法验证规范》（Protocol for the Validation of Alternative Microbiological Methods），减少了一些评价参数，如检测限、定量限、相对灵敏度等，使得评价更加简单。特别增加了方法可靠性和不确定度的评价，进一步突出评价对用户的指导性。

表3　NordVal与ISO标准的性能参数比较 [12]
Table 3 Comparison of test characteristics in NordVal and ISO standard[ 12]

定性方法定量方法性能参数NordValISO性能参数NordValISO相对准确度√√线性√√相对特异性√√相对准确度√相对灵敏度√√检测限√检测限√√定量限√包容性和排他性√√相对灵敏度√与参考方法一致性√特异性（包容性和排他性）√重复性√√重现性√√方法可靠性√方法不确定度√

如在定量方法评价中，NordVal引入对方法不确定度（the uncertainty of the methods）的评价，方法不确定度应满足具体的实用要求。引入对方法可靠性（reliability of the method）评价来代替对检测限、定量限、灵敏度等性能指标的评价。在方法可靠性评价中，采用至少5 个水平等级，包含高、中、低3 个水平，每个浓度每种方法做5 次平行检测，得到两种方法的平均值和标准偏差与水平关系，若快检方法检测结果的平均值在参考方法的95%置信区间内，则两种方法之间没有显著性差异，快检方法可接受。

2　产品评价方法

国际分析化学师协会（Association of Official Agricultural Chemists，AOAC）作为国际上分析检测方法“金标准”的制定者和颁布者，早在1989年就出台了针对检测试剂盒的指南（guideline）：AOAC Research Institute Test Kit Defi nitions and Modifi cations Guideline [13]，对检测试剂盒做了定义。虽然没有形成评价标准，但已经有多个指南作为标准的附件为快检产品评价提供依据，其中AOAC研究中心（AOAC Research Institute）提供的对测试方法性能（performance tested methods，PTM）认证的服务中就有对试剂盒的评价要求，具体评价参数如表4所示。

表4　AOAC指南中对试剂盒评价的性能参数 [14]
Table 4 Test chara　cteristics in AOAC Guideline [14]

定性方法定量方法性能参数AOACISO性能参数AOACISO相对准确度√线性√相对特异性√相对准确度√相对灵敏度√检测限√检测限√定量限√包容性和排他性√√相对灵敏度√检出概率√特异性（包容性和排他性）√√重复性√ 重复性√√重现性√ 重现性√√

AOAC主要突出了对快检方法重复性和重现性的评价，注重评价结果对应用的指导。同时，在最新的针对微生物检测试剂盒的指南中 [15]，AOAC在定性评价方法中创新性地提出了检出概率（probability of detection，POD）这一概念，虽然没有对常规的定性产品评价方法中灵敏度、特异性，假阳性和假阴性等性能参数的评价，但可以通过检出概率-水平曲线图直观地反映出这些参数（图1）。引入检测概率后，减少了所需的评价参数，使得评价更加简洁、直观。

表5　国内行业标准中评价的性能参数 [17]
Table 5 Test characteristics in Chinese industry standards [17]

定性方法定量方法性能参数行标ISO性能参数行标ISO选择性√线性√√相对准确度√相对准确度√√检测限√√检测限√√相对灵敏度√√定量限√√相对特异性√√相对灵敏度√与参考方法一致性√特异性√√假阴性率√重复性√√假阳性率√ 重现性√√

同时，随着中国快检产品的大量使用，农业部于2005年发布了《兽药残留试剂（盒）备案参考评判标准》 [16]。2011年，国家质量监督检验检疫总局发布了国内首个针对检测试剂盒的评价标准SN/T 2775—2011《商品化食品检测试剂盒评价方法》 [17]，标准评价的性能参数见表5，该标准的发布对于确保检测数据的科学性与准确性，保障我国食品质量安全都有着十分重要的意义，但是由于国内的快检评价标准发展较晚，相对而言评价方式较为落后，还缺乏像“检出概率”这类更加科学的评价指标，因此亟需发展完善。

作为食品的重要组成部分和原材料，粮油易受真菌毒素的污染，严重危害食品安全，在粮油收储加工及监督检查中亟需可靠的快检产品。为此，美国、欧盟等发达国家及地区专门开展了针对粮油食品真菌毒素快速检测产品的评价工作。

美国农业部粮食检查、包装、储存管理局（Grain Inspection, Packers and Stockyards Administration，GIPSA）开展了针对快速、可靠的检测真菌毒素方法的认证项目（rapid test kit evaluation program） [18-24]，该项目已经认证了包括检测黄曲霉毒素（aflatoxin）、呕吐毒素（deoxynivalenol）、伏马毒素（fumonisin）、赭曲霉素（ochratoxin）、玉米赤霉烯酮（zearalenone）等在内的一系列快检产品。在定性产品的评价方面 [18]，分别检测空白样品组和加标样品组，要求空白的30 个检测结果全为阴性，而加标的全部结果为阳性，否则不合格。在定量产品的评价方面，针对不同真菌毒素限量要求，规定其检测的最大相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），以其2 倍的扩展不确定度计算得到评价范围（表6）。通过测定实际样品，合格的快检产品需满足95%的检测结果落在该范围内。该认证项目的评价方法相对简单，与常规的评价方法不同，该方法不是测试产品的具体性能参数，而是运用区分的思路，围绕主要量值、基于样品、应用统计，通过人员交叉评估获得快检产品对超标样品的筛查和区分能力，其评估结果可直接用于指导用户使用，评估针对性强，阴性和阳性符合率高。

表6　黄曲霉毒素快检产品可接受限值 [19]
Table 6 Acceptable limits of afl atoxin for rapid test kit [19]

黄曲霉毒素水平/（µg/kg）RSD/%标准偏差/（µg/限值范围/（µg/ 5 251.252.5～7.5 2020412～28 100161668～130 3001648200～400

欧盟委员会法规在2014年的新修订版 [25]中加入了筛查方法的要求及使用，明确规定了筛查方法是用于区分特定浓度（screen target concentration）的方法，结果表述为阴性（negative）或者可疑（suspect），筛查正确率达到95%就可以认为是满足目的（fit-for-purpse）而被欧盟认可。在对于筛查方法的认证，欧盟规定的原则是针对特定的毒素种类、特定的基质类别进行验证，测定其区分阴性和阳性样品的临界值（cut-off）等，使用扩展测量不确定度进行结果的判定和指导用户使用 [25-26]。可以看出，美国与欧洲的真菌毒素评价方法更加注重对方法/产品实际效果的评价，突出方法不确定度评价的重要性，并以此为标准来判定方法/产品的合格与否及指导检测结果的使用。这些以检测实际效果为基础的评价方法，为基于使用目的的评价模式提供了一个更加科学的评价思路。由于这类评价更贴近用户的真实情况，通过这类评价，用户可以更加科学、有效地选择和使用快检产品。

3　结语

对于快检产品的评价，国际上已经形成了比较完善的体系，并且很好地应用于相关快检产品的认证中。今后的评价标准将趋向两个方向：一是重视产品本身质量的评价方法，主要是针对快检产品的性能指标进行符合性检测，确保产品的质量合格；二是面向用户突出实用的快　检产品评价方法。由于快检产品的种类及用途越来越多，用户的需求也更加多样化，针对实际使用目的的相关评价验证方法越来越重要，如操作的便捷性和实用性。

我国食品安全领域对快检产品有着大量的需求，但是相关的评价标准还非常匮乏，使得快检产品的检测可靠性无法得到保障，也不知道如何去选择使用，快检产品对于用户而言犹如鸡肋，“食之无味，弃之可惜”。为了保障快检产品的质量和检测结果的可靠性，帮助用户选择合适、切实可靠的快检产品，并能正确合理的使用，使快检产品能在我国食品安全领域发挥其应有的作用，建议尽快出台科学合理的快检产品评价标准，为快检产品的评价提供依据。并为之后建立权威的评价认证平台，提供产品评价认证服务，及时公布评价认证结果供用户参考奠定基础。

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[4] 国家粮食局. LS/T 6112—2015 粮油检验粮食中玉米赤霉烯酮测定胶体金快速定量法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2015.

[5] 国家粮食局. LS/T 6113—2015 粮油检验粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定胶体金快速定量法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2015.

[6] 国家粮食局. LS/T 6114—2015 粮油检验粮食中赭曲霉毒素A测定胶体金快速定量法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2015.

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[9] 全国人民代表大会常务委员会. 中华人民共和国农产品质量安全法[EB/OL]. (2006-04-29) [2016-03-09]. http://www.gov.cn/fl fg/2006-04/30/content_271633.htm.

[10] Codex Alimentarius Commission. CAC/RCP 51—2003 Code of practice the prevention and rrduction of mycotoxin contamination in cereals[EB/ OL]. Revised 2014. (2014-01) [2016-03-09]. http://www.fao.org/faowho-codexalimentarius/standards/list-of-standards/en/?provide=standa rds&orderField=fullReference&sort=asc.

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[15] AOAC International methods committee guidelines for validation of microbiological methods for food and environmental surfaces[EB/OL]. (2012-02-24)[2016-03-09]. http://www.aoac.org/imis15_prod/AOAC_ Docs/StandardsDevelopment/AOAC_Validation_Guidelines_for_ Food_Microbiology-Prepub_version.pdf.

[16] 中华人民共和国农业部. 关于发布《兽药残留酶联免疫试剂(盒）备案审查技术资料要求》和《兽药残留酶联免疫试剂(盒)备案参考评判标准》的通知,农医发[2005] 17号文件[EB/OL]. (2006-01-24) [2016-03-09] http://www.moa.gov.cn/zwllm/zcfg/qtbmgz/200601/ t20060124_542688.htm.

[17] 国家认证认可监督管理委员会. SN/T 2775—2011 商品化食品检测试剂盒评价方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2011.

[18] United States Department of Agriculture Grain Inspection, Packers and Stockyards Administration Federal Grain Inspection Service. Performance verifi cation of qualitative mycotoxin and biotech rapid test kits[EB/OL]. (2011-03-22) [2016-03-09]. http://www.gipsa.usda.gov/ Lawsandregs/directives/9181-2.pdf.

[19] United States Department of Agriculture Grain Inspection, Packers and Stockyards Administration Federal Grain Inspection Service. Design criteria and test performance specifi cations for quantitative afl atoxin test kits[EB/OL]. (2016-01-01) [2016-03-09]. https://www.gipsa.usda.gov/ fgis/metheqp/afl atoxins_criteria.pdf.

[20] United States Department of Agriculture Grain Inspection, Packers and Stockyards Administration Federal Grain Inspection Service. Design criteria and test performance specifications for quantitative deoxynivalenol test kits[EB/OL]. (2016-03-01) [2016-03-09]. https:// www.gipsa.usda.gov/fgis/metheqp/Deoxynivalenol_criteria.pdf.

[21] United States Department of Agriculture Grain Inspection, Packers and Stockyards Administration Federal Grain Inspection Service. Design criteria and test performance specifications for quantitative fumonisin test kits[EB/OL]. (2016-03-01) [2016-03-09]. https://www.gipsa.usda. gov/fgis/metheqp/fumonisin_criteria.pdf.

[22] United States Department of Agriculture Grain Inspection, Packers and Stockyards Administration Federal Grain Inspection Service. Design criteria and test performance specifi cations for quantitative ochratoxin a test kits[EB/OL]. (2016-03-01) [2016-03-09]. https://www.gipsa.usda. gov/fgis/metheqp/ochratoxin_criteria.pdf.

[23] United States Department of Agriculture Grain Inspection, Packers and Stockyards Administration Federal Grain Inspection Service. Design criteria and test performance specifi cations for quantitative zearalenone test kits[EB/OL]. (2016-03-01) [2016-03-09]. https://www.gipsa.usda. gov/fgis/metheqp/zearalenone_criteria.pdf.

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[25] The European Commission. Commission Reglation (EU) No 519/2014. Amending Regulation (EC) No 401/2006 As regards methods of sampling of large lots, spices and food supplements, performance criteria for T-2, HT-2 toxin and citrinin and screening methods of analysis[EB/ OL]. (2014-05-16) [2016-03-09]. http://eur-lex.europa.eu/legal-content/ EN/TXT/PDF/?uri=CELEX:32014R0519&from=EN.

[26] European Commission. Guidance document for competent authorities for the control of compliance with eu legislation on afl atoxins[EB/OL]. (2010-11) [2016-03-09]. http://ec.europa.eu/food/safety/docs/cs_ contaminants_catalogue_alfatoxins_guidance-2010_en.pdf.

XIE Gang, YE Jin, WANG Songxue
(Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)

Abstract：Rapid detection technology has been an essential tool in many areas concerning food safety such as fast sample screening and fi eld test. However, current commercial products based on rapid detection technology suffer from many problems including poor quality and unscient　ifi c usage. So it is very important to establish a scientifi c and rational validation method for commercial products for rapid detection. In this review, we analyze current validation methods and their applications in the fi eld of grain and oil quality and safety.

Key words：rapid detection; validation; food quality and safety; grain and oil products

作者简介：谢刚（1974—），男，副研究员，硕士，研究方向为粮油质量安全检测与防控。E-mail：xg@chinagrain.org

食品安全快速检测方法评价技术研究进展

1 可替代方法验证规范

2 产品评价方法

3 结 语

1　可替代方法验证规范

2　产品评价方法

3　结语