数字聚合酶链式反应技术在食品安全检测领域的研究应用进展

刘 津 1,刘二龙 2,谢 力 1,李志勇 1,相大鹏 3,高东微 1,*

(1.广东检验检疫技术中心,广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室,广东 广州 510623;2.黄埔出入境检验检疫局,广东 广州 510700;3.广东出入境检验检疫局,广东 广州 510623)

摘 要:数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)作为一项新兴的基于单分子目标基因扩增的绝对定量技术,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文综述了商业化dPCR技术在转基因成分、动物源性成分、食源性致病微生物定量检测等食品安全领域的研究进展,讨论了dPCR应用中技术难题的解决,并在此基础上展望了该技术在食品安全检测领域的发展前景。

关键词:数字聚合酶链式反应;食品安全;绝对定量;检测

刘津, 刘二龙, 谢力, 等. 数字聚合酶链式反应技术在食品安全检测领域的研究应用进展[J]. 食品科学, 2016, 37(17): 275-280. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617046. http://www.spkx.net.cn

LIU Jin, LIU Erlong, XIE Li, et al. Progress in research and application of digital polymerase chain reaction (dPCR) in food safety detection[J]. Food Science, 2016, 37(17): 275-280. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617046. http://www.spkx.net.cn

数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)是继普通PCR和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)之后的第三代PCR技术,是一项基于单分子目标基因PCR扩增的绝对定量技术。该技术通过将PCR反应溶液进行稀释并分配到大量独立的反应室中,理论上使得每个反应室中的目标核酸不超过1 拷贝,每个反应室中的单拷贝核酸进行独立的荧光PCR扩增,通过逐个检测并统计反应室中阳性和阴性反应的数量,并根据泊松分布(Poisson distribution)的统计学原理进行校正,最终计算出初始样品中目标核酸的精确拷贝数 [1-3]

dPCR构想最早于1992年由Sykes等 [1]基于样品稀释和泊松分布数据处理的巢式PCR定量技术而提出。随后,许多研究者利用dPCR技术的构想在各自不同的研究领域进行了大量有益的尝试 [2,4-7],如Kalinina等 [4]利用毛细管中微升级的荧光PCR反应实现了单分子定量,Vogelstein等 [2]采用96 孔板发展了微升级的PCR反应,Diehl等 [7]发明BEAMing方法,以磁珠、乳化、扩增与磁力吸附为要点,通过流式细胞仪对磁珠进行等位基因变异分析。dPCR技术以其准确性好、灵敏度高、无需任何校准物质、可对样品核酸进行绝对定量等优势,已经在临床诊断 [8-9]、单细胞基因表达 [10]、环境微生物检测 [11]、下一代测序 [12-13]和食品安全定量检测 [14]等方面得到了广泛的研究和应用。

商业化dPCR仪的出现,克服了研究者们各自研究工作中操作复杂、重复性差、通量低等困难,实现了自动化和高通量的应用,从而进一步推动和扩大了dPCR技术的发展和应用范围,在食品安全检测领域获得了广泛的关注,引起了极大的研究热情并已经取得了可喜的成果。鉴于此,本文对近年来商业化dPCR技术应用于食品安全检测领域的研究和应用进展进行了综合评述和思考,旨在为该技术进一步发展和普及提供参考。

1 商业化dPCR技术原理简介

目前,商业化的dPCR技术主要包括芯片式dPCR(chip digital PCR,cdPCR)和微滴式dPCR(droplet dPCR,ddPCR)。这两种dPCR技术均基于泊松分布原理对数据进行统计学分析与计算,主要技术区别在于PCR反应溶液随机和独立分布的实现方式,以及反应室中PCR扩增阴/阳性信号的读取方式。

图1 ddPCR原理示意图 [14]
Fig. 1 Schematic diagram of ddPCR [14]

ddPCR主要由Bio-Rad和RainDance公司进行商业化开发,将PCR反应液进行微滴化处理(图1),用油包水的形式将反应体系分成2×10 4个纳升级(QX200 TMDroplet Digital PCR System) [15]或者1×10 7个皮升级(RainDrop TMDigital PCR System) [16]的微滴,其中每个微滴含有0或1 个至数个待检核酸分子。PCR扩增结束后,采用流式细胞仪工作原理,通过荧光散射源和检测器对微滴进行逐个检测,有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,统计出有荧光信号的微滴总数,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出目标分子的起始拷贝数或浓度。

cdPCR主要包括Fluidigm公司开发的集成流路(integrated fluidic circuits,IFCs)芯片dPCR系统(BioMark TMHD System)和ThermoFisher Scientifi c公司开发的微孔式芯片dPCR系统(QuantStudio TM3D Digital PCR System)。前者以48.48型IFCs芯片为例,由48 个独立的面板和相应的进样孔组成(图2),每个面板含有48 个10.1 nL的独立反应室,24 μL反应液通过进样孔后被分配到2 304 个反应室进行独立扩增,可以实时监测荧光扩增信号和统计最终的阴/阳性扩增结果 [17];后者则是在芯片上用激光蚀刻了20 000 个均匀分布的0.755 nL独立微孔,通过涂布14.5 μL反应液到芯片面板的20 000 个反应室后进行独立扩增 [18],并检测每个反应室中的最终阴/阳性扩增信号(图3)。两种cdPCR均根据泊松分布原理及阳性扩增信号数量和比例得出目标分子的起始拷贝数或浓度。

图2 48.48型IFCs芯片 [19]
Fig. 2 A 48.48 IFCs chip [19]

图3 微孔式dPCR的芯片构造图
Fig. 3 Construction of a microwell dPCR chip

2 dPCR在转基因成分定量检测领域的研究进展

全球已有50多个国家和地区实施了转基因产品的标识制度,并制定了各自不同的标识阈值 [20],对转基因成分的精准定量提出了迫切需求。dPCR作为一种可对特定基因拷贝数进行绝对定量的新方法,已大量应用于转基因成分定量检测领域的研究。

2.1 研究进展

在应用dPCR技术进行转基因成分定量检测研究时,可以将qPCR平台建立的PCR反应体系进行平移,是转基因成分dPCR定量检测能够快速得到研究和应用的重要优势。cdPCR和ddPCR这两种主流的商业化dPCR技术都已用于进行转基因成分定量检测,定性检测限小于5 拷贝,其中cdPCR已在质粒标准品和转基因作物种子的转基因成分拷贝数定量检测中进行验证 [14,21-22],ddPCR已在农作物、食品和饲料中的转基因成分拷贝数定量检测中进行验证 [23-24]。此外,dPCR得到的数据可靠、精确、重复性好,具有良好的计量性能,可以用于评估标准物质的拷贝数比例 [14,22,25]

在实际应用方面,ddPCR因其成本相对便宜,更适宜进行大规模筛查,被认为更适合于日常检测 [23]。cdPCR则会相对较贵,且测量的不确定度更大 [3]。为了降低dPCR定量检测的价格成本,可以采用多重PCR策略。多重PCR反应依赖于不同的探针标记,在cdPCR中最多可使用5 种不同的荧光基团,ddPCR最多可用2 种。最近有研究在ddPCR中通过使用不同的引物/探针浓度来使同一个反应体系中最多进行10 个目标的检测 [24],也有研究通过使用DNA结合染料来实现多重检测 [26]

dPCR可针对目标片段进行拷贝数的绝对定量,在转基因成分定量检测方面与qPCR相比,至少具有4点优势:1)无需标准物质便可实现定量检测;2)避免了因样品与标准品之间DNA提取效率和扩增效率不一致而引起的偏差 [14,22-23];3)由于dPCR是在PCR终点进行荧光信号的检测和计数统计,对样品基质中的PCR反应抑制物的忍耐程度更高,对样品DNA纯度的要求更低 [21];4)检测灵敏度更高,在检测低水平拷贝数样品时精确度和重复性更优 [27-28]。样品复杂基质中存在的抑制物是造成样品与标准品之间扩增效率差异的主要原因,也是qPCR进行相对定量时误差的来源之一。cdPCR定量检测实验结果证实,虽然抑制物可能会影响每一个微反应PCR扩增曲线的Ct值,但是由于最终定量结果的获得依赖于每个微反应中阳性扩增的统计数据,经过扩增曲线分析和阈值设定后,每一个微反应的Ct值波动并不会干扰最终的统计数据,所以不会影响最后的定量结果 [29]

在进行定量检测时,dPCR相较于qPCR还具有低成本优势,尤其是ddPCR。以用96 孔板来进行同一转基因成分的定量检测为例,用ddPCR可检测的样品数量是qPCR的3 倍,每个样品的价格比qPCR低30% [30]。这是因为用qPCR进行相对定量时,96 个反应中需要包含浓度梯度的标准物质和每个样品至少两个稀释浓度,实际能够检测的样品数会比较少。

2.2 标准化进展

转基因成分dPCR定量检测研究领域取得的突出成果已经开始向标准化方向转化。目前有3 项出入境检验检疫行业标准制定计划项目获得立项并开展研究,分别为“转基因大米常见品系的精准定量检测方法 数字PCR法”(2015) [31]、“转基因玉米成分检测 微滴式数字PCR检测方法”(2015) [32]和“转基因植物产品的数字PCR检测方法”(2016) [33]。其中前两项已经于2015年完成了网上征求意见工作,进入室外验证阶段。从网上公开的征求意见稿可知,“转基因大米常见品系的精准定量检测方法 数字PCR法”覆盖了7 种转基因大米品系,分别是TT51、KMD、KF6、M12、LL62、T2A-1、T1C-19,定量检测低限为0.1%;“转基因玉米成分检测 微滴式数字PCR检测方法”覆盖了15 种转基因玉米品系,分别是MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604、ES3272、NK603、TC1507、MON87460、59122和GA21,对30 ng玉米基因组DNA的检测低限为0.1%,150 ng玉米基因组DNA的检测低限为0.02%。

2.3 应用前景

实行转基因成分标识的阈值管理已是大势所趋。各个国家和地区规定的阈值含义不一致,现有定量检测技术存在明显的技术缺陷,使得转基因成分定量检测成为标识阈值管理的瓶颈,造成转基因国际贸易中最主要的技术贸易壁垒之一。

qPCR可以利用标准曲线测定转基因成分的质量百分比或者拷贝数百分比,但是在测定质量百分比时由于转基因作物存在纯合子和杂合子之分,利用基于基因的方法不能准确反映转基因作物质量的真实值。对于一个二倍体生物来说,杂合子的细胞中含有的转基因DNA拷贝数只有纯合子的1/2。如果以质量百分比为单位测定转基因成分含量,杂合子和纯合子转基因作物的转基因成分均为100%;而以拷贝数百分比为单位对它们进行测量时,杂合子的转基因成分为50%,纯合子的转基因成分为100%。在测定拷贝数百分比时由于使用的DNA标准品在保存和运输过程中易降解,且与实际待测样品之间的本质差异,也存在测定值往往严重偏离真实值的情况。换言之,qPCR作为一种相对定量检测技术,在转基因成分定量检测方面只能提供较为粗略的定量结果,难以达到阈值管理所要求的精准定量技术水平。

近年来,在国际上推行统一含义的阈值已成为许多国际组织努力的目标 [34]。利用dPCR技术建立的转基因成分定量检测方法,可以脱离标准品来完成对特定转基因成分拷贝数的绝对定量,从而计算出拷贝数的百分比含量,具有灵敏度高、特异性强、适用性广等优势,已成为最具应用前景的转基因定量检测新方法。

3 dPCR在动物源性成分定量检测领域的研究进展及应用前景

肉制食品掺假是全球共同面临的食品安全热点问题。在肉制食品中掺入配料表中未经标识的肉类成分,以假充真、以廉充贵,是一种极为恶劣的商业欺诈行为。与此同时,在肉制食品生产加工过程中由于共用仓储和加工设备,造成产品无意掺杂未经标识的动物源性成分也非常普遍的现象。准确区别上述两种不同性质的动物源性成分掺入,直接关系到能否对肉制食品掺假进行有效监管。因此,建立肉制食品中动物源性成分的精准定量检测技术,对防范肉制食品掺假、保障肉制食品安全具有重要作用。

dPCR已经应用于猪、黄牛、羊、马、鸡成分的定量检测研究中。Floren等 [35]利用线粒体DNA与基因组DNA设计的引物探针进行动物源性成分定量检测,比较研究它们的准确性。结果发现,线粒体DNA由于丰度高且在不同组织部位的含量不一致,容易导致定量结果偏差较大;而基因组DNA含量较恒定,适合用于动物源性成分的定量检测,质量百分比定量检测限和定性检测限分别为0.01%和0.001%。Cai Yicun等 [36]研究发现,烘干的未经加工的生肉质量和DNA的质量、DNA的质量和DNA的拷贝数检测数据都接近于线性关系,可通过测定肉制食品中特定物种拷贝数含量为区分有意掺假和无意掺杂提供依据。王珊等 [37]建立了一种定量检测羊肉制品中羊源性成分与猪源性成分的方法,利用该方法对市售的3 份羊肉制品中进行qPCR和ddPCR检测。用qPCR可以同时在3份样品中检测出羊成分和猪成分,但是无法明确含量比例。ddPCR的检测结果则可以通过羊成分和猪成分拷贝数的显著差异判断出样品只是无意沾染猪成分,而非故意添加。

现有研究表明,在建立动物源性成分精准定量检测技术区分肉制食品有意掺假和无意掺杂方面,qPCR无法提供有效的解决办法,而dPCR则可以通过对动物源性成分的拷贝数进行绝对定量,并依据拷贝数含量与质量的相关性,估算动物源性成分的质量百分比,从而可以将有意掺假和无意掺杂区分开来。

dPCR为肉类食品掺假的检测提供了新的解决途径。目前主要的技术难题是如何理顺dPCR得到的拷贝数与动物源性成分质量之间的关系。一方面,研究的重点可以放在建立拷贝数与质量相关性上,使得最终利用dPCR得到的数据可以换算出准确的动物源性成分质量百分比。由于不同动物组织的质地、密度、状态差别巨大,肉制食品配方和工艺千差万别,如何建立拷贝数与质量相关性的研究工作,仍然存在许多技术问题。另一方面,为了基于现有技术尽快破解肉制食品掺假的监管难题,也可以考虑直接利用dPCR得到的拷贝数比例数据作为判别有意掺假和无意掺杂的技术依据。采用拷贝数比例这种新的评价指标,舍弃以往质量百分比的评估方式,能够更加精准直观地反映出样品中动物源性成分含量的真实状态。

4 其他研究领域

dPCR还在食品安全分子生物学检测的其他领域有零星研究报道,如食源性致病微生物定量检测和餐厨废弃植物油的鉴别。董莲华等 [38]用ddPCR建立了大肠杆菌O157:H7的定量检测方法,定量检测限为4 copies/20 μL,定性检测限为3 copies/20 μL。Rothrock等 [39]将ddPCR与禽类加工行业现有常规两种检测方法qPCR和传统培养鉴定方法进行了比较,研究了在采用不同取样时间和取样方法时这3 种检测方法得到的禽类加工设备中主要传染性致病微生物检测结果的差别。结果表明,ddPCR能够从更早的样本中,也能够更多地从不同的生产加工设备中检出病原菌的特异性基因,且定量检测结果与传统的病原菌培养鉴定检测方法一致。杨冬燕等 [40]采用ddPCR技术扩增动物源性同源异形盒家族HOXC6基因鉴别餐厨废弃植物油,检测灵敏度和准确率略高于qPCR法,而ddPCR检测的稳定性和精密度略低于qPCR法。

5 结 语

dPCR作为绝对定量方法能准确定量目标DNA,弥补了采用相对定量技术的qPCR方法在定量检测方面高度依赖标准品与PCR扩增效率的一致性等不足,可与qPCR在食品安全分子生物学检测技术领域互为补充,为食品安全监管多个专业领域的限量或阈值设定提供了新的度量标尺。

dPCR在食品安全定量检测领域,除了用于转基因成分、动物源性成分和食源性致病微生物的定量检测外,还可应用于多个方面。例如,在食品过敏原成分的定量检测方面,现有的麸质过敏原阈值管理,可以尝试采用dPCR解决检测的需求;对于零容忍的各种过敏原,dPCR技术的应用更是可以降低检测限、提高检测灵敏度,为食物过敏人群带来更加精准的保护。在珍贵食药材及其制品的鉴别和定量检测方面,可通过建立物种特异性基因拷贝数与质量之间的换算关系,应用dPCR绝对定量方法对冬虫夏草、阿胶等生物来源的样品进行有效成分的含量测定,评估这些珍贵食药材及其制品的价值。

dPCR技术已经为食品安全定量检测带来全新的解决方案,其在食品安全检测领域产生的影响逐渐开始显现。相信在不远的将来,研究者将从中找到更多的切入点,取得更大的成果,为保障食品安全提供更为先进的技术手段。

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Progress in Research and Application of Digital Polymerase Chain Reaction (dPCR) in Food Safety Detection

LIU Jin 1, LIU Erlong 2, XIE Li 1, LI Zhiyong 1, XIANG Dapeng 3, GAO Dongwei 1,*
(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangdong Key Laboratory of Import and Export Technical Measures of Animal, Plant and Food, Guangzhou 510623, China; 2. Huangpu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510700, China; 3. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510623, China)

Abstract:Digital polymerase chain reaction (dPCR), which emerges as a new absolute DNA quantifi cation technique based on monomolecular target gene amplifi cation, can promote the development and application of modern molecular biology in accurate quantitative detection. A review of the literature on commercial dPCR applied in food safety detection is given in this paper, including quantitative detection of genetically modifi ed organisms, animal derived ingredients and foodborne pathogenic microorganisms. A discussion on the solution of technical problems using dPCR is provided as well. Moreover, future prospects for the development of dPCR technology in food safety detection are proposed.

Key words:digital polymerase chain reaction (dPCR); food safety; absolute quantifi cation; detection

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201617046

中图分类号:TS207.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)17-0275-06

收稿日期:2016-01-07

基金项目:国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2016IK055);广东出入境检验检疫局科技计划项目(2016GDK16)

作者简介:刘津(1983—),女,工程师,硕士,研究方向为食品检测。E-mail:ivfhonline@126.com

*通信作者:高东微(1973—),女,研究员,博士,研究方向为食品检测。E-mail:margree@126.com

引文格式: