邢海丽，辛嘉英*，王 艳，高圣博
（哈尔滨商业大学 食品科学与工程省级重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）
摘 要：在单因素试验的基础上，利用响应面试验研究甲烷氧化菌素、苯甲酸钠和山梨酸钾复配剂对白色葡萄球菌抑菌圈直径的影响，模拟得出了抑菌圈直径的回归方程，利用Design-Expert软件分析表明：当甲烷氧化菌素-苯甲酸钠-山梨酸钾质量浓度最佳配比为0.330∶0.309∶0.144时，最大抑菌圈直径的理论值为34.99 mm，实际值为34.7 mm，此时最佳复配剂对白色葡萄球菌最小抑菌浓度为0.05 mg/mL。
关键词：甲烷氧化菌素；化学防腐剂；复配剂；抑菌效果；响应面
近些年来，食品添加剂已用于调味、着色、延长食品的保质期以及食品安全宣传 ［1］，是食品加工生产中不可缺少的一部分 ［2-3］。随着人民生活水平的提高，绿色食品、健康食品的概念深入人心，天然食品防腐剂更加受到人们的重视，并成为食品添加剂研究和应用的一个热点 ［4-5］。甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）是由甲烷氧化细菌分泌的，它既能够以分泌物的形式存在于细胞外，又能以颗粒型甲烷的加氧酶组成结构成分存在于细胞内膜上，是一种小分子的荧光肽，对铜具有较强的亲和性 ［6-8］。而甲烷氧化菌是参与全球碳循环的一个重要微生物 ［9-10］，也由于其生长快、易培养，易大规模工业化生产、不受季节与自然条件限制等优越性，已经被用于生产单细胞蛋白及虾青素等 ［11］，因此利用微生物生产天然抗菌剂的技术具有很好的应用前景 ［12-14］。
国内外研究表明，由于很多食品添加剂在功能和应用方面具有局限性，将几种来源不同的天然食品防腐剂复配，或者将一种天然防腐剂与其他化学防腐剂复配使用，不仅可以减少防腐剂在食品中的用量，同时还可以使食品的杀菌或抑菌条件更加温和化，达到互补或协同增效作用 ［15-16］，对人们的饮食健康非常有利。苯甲酸钠和山梨酸钾因其价格低廉，又具有广谱的抑菌效果，广泛应用于食品中 ［17-18］，这两种化学防腐剂小剂量的摄入对人体并无大碍，但是大剂量的摄入对身体有一定的危害 ［19-21］。因此，本实验使用天然微生物源的食品防腐剂Mb和苯甲酸钠、山梨酸钾进行复配，在单因素试验的基础上，利用响应面试验法对复配剂进行优化，以指示菌的抑菌圈直径为响应值，获得最佳的复配比例，以及在最佳复配比例条件下的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），减少了化学防腐剂的用量，复配防腐剂应用于食品中更安全。
1.1 材料与试剂
甲烷氧化菌IMV3011（Methylosinus trichosporium IMV 3011），由俄罗斯科学院催化研究所提供；白色葡萄球菌，由哈尔滨商业大学食品工程学院微生物实验室提供。
细菌培养基：由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和琼脂组成。
Diaion HP-20大孔吸附树脂、1.1 cm×20 cm层析柱 日本三菱化工公司；苯甲酸钠、山梨酸钾（均为食品级） 丰达食品添加剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械公司；5BG-生化发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；RV8V旋转蒸发仪 德国IKA公司；FDU-1200冷冻干燥机 东京理化器械公司；HDL洁净工作台北京东联哈尔仪器公司；电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 Mb的提取纯化
将30 ℃培养3 d的甲基弯菌IMV 3011发酵液置于4 ℃、8 000 r/min冷冻离心机中离心20 min除去菌体，取上清液，在上清液中加入适量的CuSO 4溶液，常温条件下静止2 h，上清液通过已活化的Diaion HP-20大孔树脂进行吸附，吸附过程结束后，对吸附有Mb的大孔树脂进行除盐操作，除盐后使用60%乙醇溶液作为洗脱液进行脱附操作，收集洗脱液通过旋转蒸发（40 ℃、250 r/min）初步出去乙醇，然后预冷冻后通过冷冻干燥机除去水分，冻干后的Mb-Cu粗品置于-30 ℃冰箱中储存备用 ［22］。
1.3.2 单因素MIC的测定
将Mb-Cu、苯甲酸钠、山梨酸钾用2倍稀释法 ［23］稀释得到各种质量浓度，然后再将带有指示菌的斜面中加入已灭菌的液体培养基，调整菌浓，使每毫升液体培养基中含活菌数达 1×10 6CFU/mL。以不加Mb-Cu、苯甲酸钠、山梨酸钾但接菌的试管作为阳性对照，以不加Mb-Cu、苯甲酸钠、山梨酸钾且不接种菌的试管作为阴性对照，同时，以不加Mb-Cu加入与Mb-Cu等质量浓度的Cu 2+接菌的试管作对照。采用平板倾注法，依次将未见菌生长的各管培养物各吸取0.1 mL注入无菌平板培养基中，37 ℃培养24 h，实验组无菌生长组所对应的Mb-Cu、苯甲酸钠、山梨酸钾的最低质量浓度，为MIC。
1.3.3 单因素试验设计
采用滤纸片扩散法 ［24］，先制备直径20 mm滤纸圆片，121 ℃高压灭菌20 min，自然晾干备用。制备营养琼脂平板，吸取浓度为1×10 6CFU/mL的菌悬液100 μL置平板表面，用玻璃三角涂棒涂匀，将滤纸片浸泡于防腐液中1 min，取出晾微干，轻贴于平板上，每一个平皿均匀放2 张滤纸片，设1 个空白对照。每种防腐液做3 个平板重复，37 ℃培养24 h后用游标卡尺测量各抑菌圈直径，抑菌圈直径取平均值。抑菌圈直径大于20 mm为有抑菌作用，不大于20 mm为无抑菌作用，对照组应无抑菌圈产生，实验有效。
固定苯甲酸钠质量浓度0.600 mg/mL、山梨酸钾质量浓度0.335 mg/mL，探讨Mb-Cu质量浓度对白色葡萄球菌抑菌圈直径大小的影响；固定Mb-Cu质量浓度2.540 mg/mL、山梨酸钾质量浓度0.335 mg/mL，探讨苯甲酸钠质量浓度对白色葡萄球菌抑菌圈直径大小的影响；固定Mb-Cu质量浓度2.540 mg/mL、苯甲酸钠质量浓度0.600 mg/mL，探讨山梨酸钾质量浓度对白色葡萄球菌抑菌圈直径大小的影响。
1.3.4 响应面试验设计
在单因素试验结果基础上，综合考虑各因素对指示菌抑菌圈直径的影响，采用Box-Behnken设计方案，三因素Mb质量浓度、苯甲酸钠质量浓度、山梨酸钾质量浓度分别用X 1、X 2、X 3表示，每一自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、1进行编码，该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程可以表达为：
式中：Y为响应值（抑菌圈直径）；A 0、A i、A ii、A ij为方程系数；X i、X j（i≠j）为自变量编码值，确定最优防腐剂方案配比，并使用1.3.2节的方法确定最优防腐剂配比下的MIC。因子编码及各自变量水平见表1。
表1 响应面试验设计因素与水平
Table1 Factors and their coded levels used for Box-Behnken design mg/mL
?
2.1 单因素的MIC
表2 单因素的MIC
Table2 Minimum inhibitory concentrations of single preservatives mg/mL
指示菌Mb-Cu苯甲酸钠山梨酸钾白色葡萄球菌2.540±0.1150.150±0.0371.340±0.102
由表2可知，Mb-Cu、苯甲酸钠和山梨酸钾对白色葡萄球菌的MIC值分别为2.540、0.150、1.340 mg/mL。结果表明，Mb-Cu可以有效地抑制白色葡萄球菌的生长。
2.2 单因素试验结果
图1 Mb（A）、苯甲酸钠（B）、山梨酸钾（C）质量浓度对白色葡萄球菌抑菌圈直径的影响
Fig.1 Effects of concentrations of methanobactin-Cu
2+， sodium benzoate and potassium sorbate on inhibition zone diameters against Staphylococcus albus
由图1可以看出，白色葡萄球菌的抑菌圈直径随着Mb、苯甲酸钠和山梨酸钾质量浓度的增加而增加，根据GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》和GB 2760—2014A.2食品添加剂的使用规定中，同一功能的食品添加剂（相同色泽着色剂、防腐剂、抗氧化剂）在混合使用时，各自用量占其最大使用量的比例之和不应超过1，综合考虑选定Mb质量浓度的3 个水平为：2.54、3.81、5.08 mg/mL；苯甲酸钠质量浓度为0.30、0.45、0.60 mg/mL；山梨酸钾质量浓度为0.167、0.251、0.335 mg/mL。
2.3 响应面试验优化结果
2.3.1 响应面试验结果
表3为采用Box-Behnken设计方案所得试验结果。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table3 Box-Behnken design with experimental results of inhibition zone diameter
试验号X 1Mb质量浓度/（mg/mL）X 2苯甲酸钠质量浓度/（mg/mL）X 3山梨酸钾质量浓度/（mg/mL）抑菌圈直径/mm 12.540.300.25126.38 25.080.300.25126.68 32.540.600.25129.52 45.080.600.25132.41 52.540.450.16728.45 65.080.450.16725.54 72.540.450.33525.30 85.080.450.33531.06 93.810.300.16723.29 103.810.600.16726.76 113.810.300.33524.08 123.810.600.33528.63 133.810.450.25134.42 143.810.450.25134.48 153.810.450.25134.56 163.810.450.25134.50 173.810.450.25134.50
2.3.2 建立模型方程与显著性检验
利用Design-Expert软件对表3中的数据进行多元回归拟合及显著性检验，结果如表4所示。
表4 回归方程系数及其显著性检验
Table4 Regression coefficients and significance test of regression model
注：复相关系数R
2为0.999 5，
为0.998 9。
模型项系数估计标准差平方和均方F值P值模型263.6529.291 635.85＜0.000 1截距34.490.060 X 1Mb质量浓度0.760.0474.564.56254.65＜0.000 1 X 2苯甲酸钠质量浓度2.110.04735.6635.661 991.25＜0.000 1 X 3山梨酸钾质量浓度0.630.0473.163.16176.60＜0.000 1 X 1X 20.650.0671.681.6893.65＜0.000 1 X 1X 32.170.06718.7918.791 049.38＜0.000 1 X 2X 30.270.0670.290.2916.280.005 0 X1 2 -1.920.06515.5815.58869.92＜0.000 1 X2 2 -3.820.06561.4761.473 432.79＜0.000 1 X3 2 -4.980.065104.46104.465 833.45＜0.000 1
Mb质量浓度（X 1）、苯甲酸钠质量浓度（X 2）和山梨酸钾质量浓度（X 3）与抑菌圈直径之间的二次多项回归方程为：
回归方差分析显著性检验表明，Mb质量浓度、苯甲酸钠质量浓度和山梨酸钾质量浓度3个因素对白色葡萄球菌抑菌圈直径的线性效应都很显著（P＜0.000 1＜0.01）；各因子间交互作用很显著（P＜0.01）。在本试验设计范围内，F=1 635.85，P＜0.000 1＜0.01，说明该模型极其显著。该模型的校正决定系数R 2 Adj为0.998 9，表明99.89%的抑菌圈直径变异在所研究的3 个因素中，其中总变异中仅有0.11%不能由该模型解释，因此该模型拟合程度较好，试验误差小。变异系数表明不同水平处理组之间的变异程度，变异系数为0.45%，说明该模型重复性较好，证明应用响应面法优化Mb质量浓度、苯甲酸钠质量浓度和山梨酸钾质量浓度对白色葡萄球菌抑菌圈直径的影响是可行的。
2.3.3 响应面分析及复配剂优化
通过模型方程所作的响应面图及其等高线，如图2所示。
图2 各因素交互作用对白色葡萄球菌抑菌圈直径影响的响应面和等高线
Fig.2 Response surface and contour showing the interactive effects of concentrations of Mb， sodium benzoate and potassium sorbate on inhibition zone diameters against Staphylococcus albus
由图2可知，Mb和苯甲酸钠、Mb和山梨酸钾交互作用显著，等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反 ［25］。通过软件最后结果分析，得到的抑制白色葡萄球菌的最佳复配比例为：Mb-苯甲酸钠-山梨酸钾质量浓度比为0.330∶0.309∶0.144。此时对白色葡萄球菌的抑菌圈直径做出的理论分析值为34.99 mm。同时验证回归方程和实际结果拟合程度，在此条件下进行5 次验证实验，最后得到的实际平均抑菌圈直径为34.7 mm，与理论值基本上吻合，具有良好的重复性，因此，采用此响应面法所得到的抑菌参数比较准确可靠，具有实际应用价值。并使用1.3.2节的方法确定最优防腐剂配比条件下的MIC为0.05 mg/mL。
Mb是一种新型的潜在的微生物源的食品防腐剂，本实验主要研究了其与食品中常用的化学防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾复配对白色葡萄球菌抑菌圈直径的影响。测定单独用Mb、苯甲酸钠和山梨酸钾对白色葡萄球菌的MIC分别为2.540、0.150、1.340 mg/mL。将Mb、苯甲酸钠、山梨酸钾三因素进行复配，在单因素分析的基础上，用响应面法优化其复配比例，通过抑菌实验测定抑菌圈直径大小作为响应值，最后由软件分析法得出各个菌的最佳复配比例为Mb-苯甲酸钠-山梨酸钾质量浓度比为0.330∶0.309∶0.144，最大抑菌圈直径的理论值为34.99 mm，实测值为34.7 mm。MIC值为0.05 mg/mL，三因素复配的MIC值远低于单因素的MIC值，这说明复配剂之间的协同作用能提高其抑菌作用。
参考文献：
［1］ 王常柱， 武杰， 高晓宇. 食品添加剂的历史、现实与未来［J］. 中国食品添加剂， 2014（1）: 61-67.
［2］ SHIM S M， SEO S H， LEE Y， et al. Consumers’ knowledge and safety perceptions of food additives: evaluation on the effectiveness of transmitting information on preservatives［J］. Food Control， 2011， 22: 1054-1060. DOI:10.1016/j.foodcont.2011.01.001.
［3］ 王静， 孙宝国. 食品添加剂与食品安全［J］. 科学通报， 2013， 58（26）: 2619-2625. DOI:10.1360/972012-1635.
［4］ AYALA-ZAVALA J F， VEGA-VEGA V， ROSAS-DOMINGUEZ C， et al. Agro-industrial potential of exotic fruit byproducts as a source of food additives［J］. Food Research International， 2011， 44: 1866-1874. DOI:10.1016/j.foodres.2011.02.021.
［5］ SILVIA A V， LLUIS P， MIGUEL Á R， et al. Performance of hydroxypropyl methylcellulose （HPMC）-lipid edible coatings with antifungal food additives during cold storage of “Clemenules”mandarins［J］. LWT-Food Science Technology， 2011， 44: 2342-2348. DOI:10.1016/j.lwt.2011.02.014.
［6］ XIN Jiaying， CHEN Dandan， ZHANG Lanxuan， et al. Methanobactinmediated one-step synthesis of gold nanoparticles［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2014， 14（11）: 21676-21688. DOI:10.3390/ijms141121676.
［7］ XIN Jiaying， LIN Kai， WANG Yan， et al. Improved biological synthesis of gold nanoparticles using methanobactin［J］. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry， 2015， 58（3）: 387-395. DOI:10.1007/s13765-015-0057-3.
［8］ 周琦琼， 辛嘉英， 张颖鑫， 等. 甲烷氧化菌素的生物活性研究进展［J］. 生物技术通讯， 2009， 20（5）: 723-725. DOI:10.3969/ j.issn.1009-0002.2009.05.035.
［9］ XIN Jiaying， ZHANG Yingxin， DONG Jing， et al. Epoxypropane biosynthesis by whole cell suspension of methanol-growth Methylosinus trichosporium IMV 3011［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2010， 26: 701-708. DOI:10.1007/ s11274-009-0225-x.
［10］ XIN Jiaying， ZHANG Lanxuan， CHEN Dandan， et al. Colorimetric detection of melamine based on methanobactin-mediated synthesis of gold nanoparticles［J］. Food Chemistry， 2015， 174: 473-479. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.11.098.
［11］ JOHNSON C L. Methanobactin: a potential novel biopreservative for use against the foodborne pathogen Listeria monocytogenes［D］. Ames: Iowa State University， 2006: 85-86.
［12］ 王岁楼， 张平之. SOD在食品中的应用及微生物SOD的开发［J］. 山西食品工业， 1998（3）: 1-2.
［13］ 王岁楼， 张平之. 微生物SOD的提纯、育种及分子生物学研究［J］.微生物学杂志， 1996， 16（4）: 6-11.
［14］ 邢海丽， 辛嘉英， 王艳， 等. 微生物源天然食品防腐剂的研究进展［J］.食品安全质量检测学报， 2015， 6（10）: 3889-3894.
［15］ BEATRIZ R B， SAENZ Y， MYRIAM Z， et al. Antimicrobial activity of nisin against Oenococcus oeni and other wine bacteria［J］. International Journal of Food Microbiology， 2007， 116（1）: 32-36. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2006.12.020.
［16］ SMILANICK J L， MANSOURA M F， GABLERB F M， et al. Control of citrus postharvest green mold and sour rot by potassium sorbate combined with heat and fungicides［J］. Postharvest Biology and Technology， 2008， 47（2）: 226-238. DOI:10.1016/ j.postharvbio.2007.06.020.
［17］ 石立三， 吴清平， 吴慧清， 等. 我国食品防腐剂应用状况及未来发展趋势［J］. 食品研究与开发， 2008， 29（3）: 157-161.
［18］ 王思文， 巩江， 高昂， 等. 防腐剂苯甲酸钠的药理及毒理学研究［J］.安徽农业科学， 2010， 38（30）: 16724-16846. DOI:10.13989/ j.cnki.0517-6611.2010.30.189.
［19］ 肖燕清， 白卫东， 钱敏. 我国食品防腐剂的发展现状与对策［J］. 中国调味品， 2010， 35（11）: 43-45.
［20］ 郭松年， 田淑梅， 白洪涛. 乳酸菌及乳酸菌发酵食品［J］. 食品科学，2005， 26（1）: 39-40.
［21］ 王燕， 车振明. 食品防腐剂的研究进展［J］. 食品研究与开发， 2005，26（5）: 167-170.
［22］ CHOI D W， ANTHOLINE W E， DO Y S， et al. Effect of methanobactin on the activity and electron paramagnetic resonance spectra of the membrane-associated methane monooxygenase in Methylococcus capsulatus Bath［J］. Microbiology， 2005， 151（10）: 3417-3426. DOI:10.1099/mic.0.28169-0.
［23］ 吕淑霞， 白泽朴， 代义， 等. 乳酸链球菌素（Nisin）抑菌作用以及抑菌机理的研究［J］. 中国酿造， 2008， 27（9）: 87-91.
［24］ 程丽娟， 唐明， 袁静， 等. 微生物学实验技术［M］. 北京: 科学技术出版社， 1993: 54.
［25］ 徐媛， 王鲁峰， 徐晓云， 等. 响应曲面法优化红葡萄柚番茄红素的提取工艺［J］. 食品科学， 2010， 31（22）: 255-259.
Optimization of Combinations of Methanobactin， Sodium Benzoate and Potassium Sorbate for Enhanced Antibacterial Effect by Response Surface Methodology
XING Haili， XIN Jiaying*， WANG Yan， GAO Shengbo
（Key Laboratory for Food Science and Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin 150076， China）
Abstract：One-factor-at-a-time method and response surface methodology were applied jointly to study the individual and combined effects of methanobactin， sodium benzoate and potassium sorbate on inhibition zone diameters against Staphylococcus albus. As a result， a regression model was developed using inhibition zone diameter as response variable. The analysis carried out using Design-Expert software showed that the maximum inhibition zone diameter of 34.99 mm was obtained by the combined use of methanobactin， sodium benzoate and potassium sorbate at a mass ratio of 0.330:0.309:0.144，representing a minimum inhibitory concentration against S. albus of 0.05 mg/mL.
Key words：methanobactin； chemical preservative； blends； antimicrobial effect； response surface methodology
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201618001
中图分类号：TS202.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）18-0001-05
引文格式：
邢海丽， 辛嘉英， 王艳， 等. 响应面优化甲烷氧化菌素、苯甲酸钠和山梨酸钾复配剂抑菌效果［J］. 食品科学， 2016，37（18）: 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618001. http://www.spkx.net.cn
XING Haili， XIN Jiaying， WANG Yan， et al. Optimization of combinations of methanobactin， sodium benzoate and potassium sorbate for enhanced antibacterial effect by response surface methodology［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 1-5. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618001. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2015-12-11
基金项目：国家自然科学基金面上项目（21573055）
作者简介：邢海丽（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：841084208@qq.com
*通信作者：辛嘉英（1966—），男，教授，博士，研究方向为生物催化。E-mail：xinjiayingvip@163.com