响应面法优化甜叶菊残渣中总黄酮提取工艺及抗氧化活性

陈 婷,徐文斌,洪怡蓝,李 丹,奚印慈*

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

摘 要:研究甜叶菊残渣中总黄酮的提取工艺,同时测定甜叶菊残渣中总黄酮的抗氧化活性。首先以乙醇体积分数、超声功率和超声时间为因素进行单因素试验,找到每个因素的较优水平,然后在此基础上采用Box-Behnken法进行试验设计,并进行响应面分析,得到提取工艺的数学模型,预测出最佳提取工艺及最高总黄酮浸提量。结果显示:甜叶菊残渣中总黄酮物质的最佳提取工艺为乙醇体积分数70%、超声功率420 W、超声时间42 min,此时总黄酮浸提量为5.928 mg/g,与由数学模型得到的理论值5.949 mg/g基本符合。抗氧化实验结果表明,甜叶菊残渣中总黄酮具有很强的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和·OH的能力,其半抑制浓度(EC 50)相应为7.096、22.065 μg/mL,分别是VC的1.37、1.61 倍,表明甜叶菊残渣中黄酮类化合物有很好的抗氧化能力。

关键词:甜叶菊残渣;超声提取;总黄酮;响应面法;抗氧化性

甜叶菊(Stevia rebaudiana)是被称作“甜菊”、“甜草”原产于南美洲巴拉圭 [1]的一种菊科植物,含甜菊糖苷和黄酮类成分 [2]。其中甜菊糖苷是一种新型的天然甜味剂 [3],可替代蔗糖,有甜度高、热量低、安全无毒等特点 [4],已经广泛应用到医药和食品等领域 [5]。其具有抗氧化性、抗菌性等功效,且能够调节免疫力 [6-8],同时具有很好的软化血管、降血脂和降血糖等功能 [9-10]。目前国内已有对甜叶菊中甜菊糖苷提取方面的研究 [11],其发酵制剂抗氧化活性的研究也有报道 [12];但甜叶菊残渣中总黄酮的提取 [13]并鉴定其抗氧化活性却鲜有报道。

本实验以甜叶菊残渣为试验原料,先运用Box-Behnken试验设计及响应面分析对从甜叶菊残渣中总黄酮的超声提取工艺进行优化;再通过测定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和·OH的清除率,评价甜叶菊残渣中总黄酮的抗氧化活性,旨在为甜叶菊残渣中总黄酮物质的研究开发利用提供实验数据及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜叶菊残渣,由日本维科株式会社提供。

DPPH(纯度≥95%) 美国Fluka公司;芦丁标准品(光谱纯)、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(均为分析纯) 上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-3000PC型紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;ALC-210.4电子分析天平 上海精密仪器仪表有限公司;HSS-11-6电热恒温水浴锅 上海沪粤明科仪器有限公司;SK5210HP超声波仪 上海科导超声仪器有限公司;80-5微电脑离心机 江苏国华电气有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵 杭州明远仪器有限公司;GZX-9146 MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 甜叶菊残渣中总黄酮浸提量的测定

1.3.1.1 芦丁标准曲线的绘制 [14]

精确称取5.00 mg芦丁标准品,溶于60%乙醇溶液中,充分溶解后转移到25 mL容量瓶内,定容即得0.2 mg/mL芦丁标准溶液。依次吸取芦丁标准溶液0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL置于10 mL容量瓶内,加0.2 mL的5 g/100 mL亚硝酸钠溶液,混匀,室温条件下静置反应6 min,加0.2 mL的1 g/10 mL硝酸铝溶液,混匀,室温条件下静置反应6 min,加2.0 mL的1.0 mol/L氢氧化钠溶液,然后用60%乙醇溶液定容,混匀,室温条件下静置反应15 min,于波长510 nm处测定吸光度,y(吸光度)为纵坐标,x(总黄酮质量)为横坐标,绘制标准曲线,线性回归方程为:y=0.836x+0.007(R 2=0.999)。

1.3.1.2 总黄酮浸提量的计算 [14]

准确称取5.00 g甜叶菊残渣样品,在不同条件下进行总黄酮的提取,抽滤得到提取溶液,用60%乙醇溶液定容到一定体积,精确吸取一定量提取液,根据1.3.1.1节方法配制待测液。测定其在510 nm波长处的吸光度,总黄酮浸提量计算见式(1):

式中:m 1为根据标准曲线计算出提取液中黄酮含量/mg;m 2为甜叶菊残渣质量/g;V 1为测定液体积/mL;V 2为定容体积/mL。

1.3.2 甜叶菊残渣中总黄酮提取工艺优化

1.3.2.1 单因素试验设计

甜叶菊残渣为样品,以样品的总黄酮浸提量为考察对象,分别以3 个因素:乙醇体积分数、超声时间和超声功率 [15-16]进行单因素试验,得到各因素对甜叶菊残渣中总黄铜提取量影响的试验结果。

1.3.2.2 Box-Behnken试验设计

根据单因素试验结果,采用Box-Behnken设计法,选3 个因素:乙醇体积分数、超声功率和超声时间作为自变量,总黄酮浸提量(Y)为响应值,设计试验的因素和水平,见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平
Table1 Factors and their levels used in response surface methodology

因素水平-101 A乙醇体积分数/%657075 B超声功率/W370400430 C超声时间/min354045

1.3.3 甜叶菊残渣中总黄酮抗氧化性的测定

1.3.3.1 清除DPPH自由基的测定 [17-18]

将上述甜叶菊残渣提取液进行梯度稀释,之后依次吸取3 mL上述不同浓度稀释液于试管内,加入0.04 g/L DPPH溶液3 mL,混匀,避光反应20 min。上述液体在3 500 r/min离心10 min,取上清液,于517 nm波长处测定吸光度A i;依次吸取3 mL上述不同浓度稀释液于试管内,依次添加3 mL无水乙醇,摇匀,避光反应20 min。上述液体在3 500 r/min离心10 min,取上清液测定其在517 nm波长处的吸光度A j;取0.04 g/L DPPH溶液3 mL和无水乙醇3 mL反应作为校准液,在517 nm波长处测定其吸光度A 0。DPPH自由基清除率计算见式(2):

1.3.3.2 清除·OH的测定 [18]

将上述甜叶菊残渣提取液进行梯度稀释,依次吸取2 mL上述稀释液,依次添加6 mmol/L的硫酸亚铁溶液2 mL、6 mmol/L的过氧化氢溶液2 mL,摇匀后室温条件下静置10 min,再添加6 mmol/L水杨酸2 mL,摇匀后室温条件下静置30 min,测定其在510 nm波长处的吸光度A i;同时测定用去离子水替换水杨酸时的吸光度A j。校准液是用去离子水替换总黄酮溶液,然后测定其吸光度为A 0。·OH清除率计算见式(2)。

1.4 数据分析

实验得到的数据均为多次重复实验得到的平均值,选择单因素试验结果较好的水平,采用Design-Expert 8.0软件进行分析,得到回归模型及最优工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮浸提量的影响

当超声时间20 min、超声功率300 W时,分别考察乙醇体积分数30%、40%、50%、60%、70%和80%对甜叶菊残渣中总黄酮浸提量的影响,结果如图1所示。

图1 乙醇体积分数对总黄酮浸提量的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

图1 显示,当乙醇体积分数在30%~70%内,甜叶菊残渣中总黄酮浸提量随乙醇体积分数的增加呈现增加趋势;但当乙醇体积分数高于70%时,总黄酮浸提量呈现下降趋势;当乙醇体积分数为70%时,总黄酮浸提量的最大值是5.397 mg/g。因此,后续试验选定乙醇体积分数最优值为70%。

2.1.2 超声功率对总黄酮浸提量的影响

当乙醇体积分数70%、超声时间20 min时,分别考察超声功率300、350、400、450、500、550 W对甜叶菊残渣中总黄酮浸提量的影响,结果见图2。

图2 超声功率对总黄酮浸提量的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of total flavonoids

由图2可得,超声功率从300~400 W时,总黄酮浸提量逐步增大;但当超声功率超过400 W时,总黄酮浸提量逐渐下降,可能因为过大的超声功率破坏了黄酮分子,导致总黄酮浸提量的下降 [19];当总黄酮浸提量到达最大(5.647 mg/g)时,超声功率为400 W。因而,当其他条件保持不变的时候,为了提取出更多黄酮物质,超声功率选择400 W。

2.1.3 超声时间对总黄酮浸提量的影响

控制乙醇体积分数70%、超声功率400 W,分别考察超声时间10、20、30、40、50、60 min时甜叶菊残渣中总黄酮浸提量受超声时间的影响。

图3 超声时间对总黄酮浸提量的影响
Fig.3 Effect of ultrasonication duration on the extraction rate of total flavonoids

由图3可知,当超声时间为40 min时,总黄酮浸提量最大可达5.129 mg/g;当超声时间在40 min内时,随着超声时间的延长甜叶菊残渣中总黄酮的浸提量逐渐增大;随着超声时间不断的延长,总黄酮物质的浸提量呈下降趋势,由于超声时间延长,超声波的作用增强,破坏了黄酮的结构 [19],因此甜叶菊残渣中总黄酮浸提量减少。

2.2 响应面分析设计及结果

通过Design-Expert 8.0软件对表2的数据进行分析,结果如表3所示。由表3可知,乙醇体积分数(P<0.01)、超声时间(P<0.01)和超声功率(P<0.01)3 个因素均对甜叶菊残渣总黄酮提取影响显著 [20-21]。以甜叶菊残渣中总黄酮浸提量为响应值,经回归拟合,得到的回归方程为:

表2 响应面试验设计及结果
Table2 Program and experimental results of RSA

?

表3 方差分析
Table3 Analysis of variance for the fltted regression model

注:**. P<0.01,影响极显著。

方差来源离均差平方和自由度均方F值P值

方差来源项的P值若小于0.01,则此项为极显著,在本试验中,模型A、B、C、A 2、B 2和C 2皆显著,仅AB、AC、BC三项不显著,说明模型具有较好的拟合效果;该方程是甜叶菊残渣中总黄酮浸提量与提取工艺各项参数的核实数学模型,因此,该回归方程可以用来确定甜叶菊残渣中总黄酮的最优提取工艺。离均差平方和的数值大小反映来源项所引起的响应值变异程度,数值越小所引起的变异越小,在本试验中,A、B、C三因素对响应值影响大小依次为B>C>A,即超声功率>超声时间>乙醇体积分数。

响应面图形是响应值Y对应于试验因素A、B和C所构成的三维空间的曲面图,其在二维平面上的等高线图可直观反映各因素及他们之间的交互作用对响应值的影响 [22-23]。图4是根据回归方程得到的不同因素的响应面图和等高线图。

图4 两因素交互作用对总黄酮浸提量的响应面和等高线图
Fig.4 Response surface and corresponding contour plots showing the effects of operating parameters on the extraction rate of total flavonoids

图4 中的立体图显示乙醇体积分数对总黄酮浸提量的影响显著,曲面弯曲程度大,超声时间的影响不明显,曲面弯曲程度小 [24]。在超声功率和乙醇体积分数交互作用等高线图中,等高线沿体积分数降低方向密集,增高方向稀疏,说明降低乙醇体积分数会更显著地影响总黄酮浸提量。同理,降低超声功率、缩短超声时间都会更显著地影响总黄酮浸提量。

对响应面模型进行优化分析,得到的最优因素组合为乙醇体积分数70%、超声功率420 W、超声时间42 min,最高总黄酮浸提量的理论值为5.949 mg/g,按此工艺进行实际实验,得到的总黄酮浸提量为5.928 mg/g,这与理论值基本吻合。

2.3 甜叶菊残渣中总黄酮的抗氧化活性分析

2.3.1 甜叶菊残渣中总黄酮对DPPH自由基清除效果

图5 VC和甜叶菊残渣黄酮对DPPH自由基的清除作用
Fig.5 DPPH radical scavenging effects of vitamin C and the total flavonoids

VC和甜叶菊残渣中总黄酮对DPPH自由基清除效果见图5。甜叶菊残渣中总黄酮的EC 50(即清除率达到50% 时所需药物的质量浓度)为7.069 μg/mL,而VC的 EC 50为5.152 μg/mL,甜叶菊残渣中总黄酮的EC 50约是VC的1.37 倍。表明甜叶菊残渣中总黄酮有较好的抗氧化活性,虽然不及纯度很高的VC,但对DPPH自由基清除率最高可达92.74%。

2.3.2 甜叶菊残渣中总黄酮对·OH清除效果

图6 VC和甜叶菊残渣黄酮对·OH的清除作用
Fig.6 Hydroxyl radical scavenging effects of vitamin C and the totafll avonoids

目前的研究表明黄酮类化合物能够抗癌和防癌,且可以有效阻止脂质过氧化破坏细胞 [24]。由图6可知,当甜叶菊残渣中总黄酮质量浓度是22.065 μg/mL时,50%的·OH得到清除,而VC的EC 50是13.74 μg/mL,甜叶菊残渣中总黄酮的质量浓度是VC质量浓度的1.61 倍。因此,相比于VC,甜叶菊残渣中总黄酮清除·OH的能力较弱。

3 结 论

通过响应面分析法对各单因素的试验结果进行优化,得到的最优工艺条件为乙醇体积分数70%、超声功率420 W、超声时间42 min,按此工艺进行试验操作,得到的总黄酮浸提量为5.928 mg/g,这与理论值5.949 mg/g相符。表明模型能够对试验结果较好的拟合。各因素对总黄酮浸提量影响的显著性依次为超声功率、超声时间和乙醇体积分数。

通过对甜叶菊残渣中总黄酮的抗氧化实验表明,甜叶菊残渣中总黄酮具有很强的清除DPPH自由基和·OH的能力,其EC 50相应为7.096、22.065 μg/mL,分别是VC的1.37、1.61 倍,实验结果表明甜叶菊残渣中黄酮类化合物有很好的抗氧化能力。这为甜叶菊残渣中总黄酮物质的研究开发利用提供了理论依据。

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Total Flavonoids from Stevia rebaudiana Residue: Optimization of Extraction Process by Response Surface Methodology and Antioxidant Activity Evaluation

C
HEN Ting, XU Wenbin, HONG Yilan, LI Dan, XI Yinci*

College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Abstract:In this experiment, we optimized the conditions for extracting total flavonoids from stevia (Stevia rebaudiana)residue left after stevioside extraction and determined the antioxidant activity of the total flavonoids. Firstly, we selected ethanol concentration, ultrasound power, and ultrasound treatment time as factors to conduct single factor investigations for the purpose of establishing the appropriate levels for each of these factors. Then, we developed a predictive mathematical model of the yield of total flavonoids using Box-Behnken experimental design for the optimization of extraction conditions by response surface analysis. The optimal extraction conditions were determined as follows: ethanol concentration, 70%;ultrasound power, 420 W; and ultrasound treatment time, 42 min. Experiments conducted under these conditions gave the maximum yield of total flavonoids of 5.928 mg/g, which was close to the predicted value of 5.949 mg/g. Moreover, antioxidant experiments showed that total flavonoids from stevia residue left after stevioside had very strong scavenging capabilities for DPPH and hydroxyl radicals with EC 50values of 7.096 and 22.065 μg/mL, respectively, which were approximately 1.37 and 1.61 times that of vitamin C, respectively. Therefore, the total flavonoids had strong antioxidant capacity.

Key words:stevia residue left after stevioside extraction; ultrasonic extraction; total flavonoids; response surface methodology; antioxidant activity

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618009

中图分类号:TS201.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)18-0052-06

引文格式:

陈婷, 徐文斌, 洪怡蓝, 等. 响应面法优化甜叶菊残渣中总黄酮提取工艺及抗氧化活性[J]. 食品科学, 2016, 37(18): 52-57. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618009. http://www.spkx.net.cn

CHEN Ting, XU Wenbin, HONG Yilan, et al. Total flavonoids from Stevia rebaudiana residue: optimization of extraction process by response surface methodology and antioxidant activity evaluation[J]. Food Science, 2016, 37(18): 52-57. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618009. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-01-04

基金项目:上海海洋大学-日本维科株式会社合作研究基金项目

作者简介:陈婷(1991—),女,硕士研究生,研究方向为食品工程。E-mail:chentingjs@163.com

*通信作者:奚印慈(1957—),女,副教授,博士,研究方向为天然物质的生物活性成分。E-mail:xiyinci@gmail.com