腌腊肉制品中13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE的HPLC-MS/MS检测

宋 慧 1,2,耿志明 2,任 双 1,2,王道营 2,张牧焓 2,孙 冲 2,徐为民 1,2,3,*

(1.南京农业大学 肉品加工与质量控制教育部重点实验室,江苏 南京 210095;2.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014;3.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心, 江苏 南京 210095)

摘 要:采用高效液相色谱-串联质谱法对腌腊肉制品中13-羟基-9,11-十八碳二烯酸(13-hydroxy-9,11-octadecadienoic acid,13-HODE)、9,10-二羟基-12-十八碳烯酸(9,10-dihydroxy-12-octadecenoic acid,9,10-DHODE)、9,10-环氧-12-十八碳烯酸(9,10-epoxyoctadec-12-enoic acid,9,10-EPODE)及9,10,13-三羟基-11-十八碳烯酸(9,10,13-trihydroxy-11-octadecenoic acid,9,10,13-THODE)进行检测。腌腊肉制品中13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE用甲醇提取,经固相萃取柱去净化浓缩,然后以0.1%甲酸与乙腈为流动相,在XBridge色谱柱上进行梯度分离,采用电喷雾源负离子多反应监测模式进行分析。结果表明,13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE分别在质量浓度为0.05~2.0、0.01~0.5、0.05~1.0、0.01~0.5 μg/mL的范围内具有较好的线性关系(R 2>0.999);检出限分别为0.120、0.008、0.200、0.016 μg/g;不同添加水平的平均回收率分别为95.1%、85.2%、86.8%、86.2%。对26 种腌腊肉制品含量分析表明,所有样本都含有13-HODE、9,10-DHODE、9,10,13-THODE,含量分别在1.4~100.7、0.1~3.9、0.4~10.2 μg/g范围内,21 种样本中含有9,10-EPODE,含量范围为0.8~6.9 μg/g。结果表明,腌腊肉制品中存在目标分析物的异构体,羟基脂肪酸实际含量可能大大高于检测的量。

关键词:亚油酸;腌腊肉制品;13-HODE;9,10-DHODE;9,10-EPODE;9,10,13-THODE;高效液相色谱-串联质谱法

亚油酸(linoleic acid,LA,C 18∶2)是人类饮食中必需的脂肪酸。作为细胞膜结构与功能的基本成分,LA在许多生理过程中起到了重要的作用,例如介导细胞信号转导、调控基因表达 [1]。LA也是类花生酸的前体,例如前列腺素与白三烯 [2]。与花生四烯酸类似,LA在脂肪氧合酶、细胞色素P450 [3-5]、金属离子 [6]、游离自由基 [7]的存在下,极易受到氧化。在酶促或者非酶促的条件下,LA主要氧化生成十八碳烯酸的氢过氧化物(hydroperoxyoctadecadienoic acids,HPODEs) [8],HPODEs不稳定可进一步转化为单羟基十八碳烯酸(hydroxyoctadecadienoic acids,HODEs) [9]。HODE有两种异构体,9-HODE和13-羟基-9,11-十八碳二烯酸(13-hydroxy-9,11-octadecadienoic acid,13-HODE)。LA在非酶促作用下产生等物质的量13-HODE与9-HODE的混合物,而在15-脂肪氧合酶作用下只产生13-HODE [10]。除了HODEs,LA还可氧化生成二羟基十八碳烯酸(dihydroxyoctadecenoic acids,DHODEs)与三羟基十八碳烯酸(trihydroxyoctadecenoic acids,THODEs)。在细胞色素P450作用下,LA可产生其环氧化物环氧化十八碳烯酸(epoxyoctadecenoic acids,EPODE),EPODE存在9,10-环氧-12-十八碳烯酸(9,10-epoxyoctadec-12-enoic acid,9,10-EPODE)和12,13-EPODE两种异构体。EPODEs在可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)的存在下,被水解为DHODEs,分别为9,10-二羟基-12-十八碳烯酸(9,10-dihydroxy-12-octadecenoic acid,9,10-DHODE)和12,13-DHODE [11]。由于EPODEs可在白细胞中形成 [12],9,10-EPODE,12,13-EPODE也被称为白细胞毒素及异白细胞毒素,相应的9,10-DHODE和12,13-DHODE被称为白细胞毒素二醇及异白细胞毒素二醇。THODE也有很多异构体,例如9,10,11-THODE、9,10,13-三羟基-11-十八碳烯酸(9,10,13-trihydroxy-11-octadecenoic acid,9,10,13-THODE)、9,12,13-THODE和12,13,16-THODE等,脂肪氧合酶、细胞色素P450、羟化酶与水解酶都与其形成有关 [13],形成机制较为复杂。研究表明,羟基十八碳烯酸具有多重病理生理学作用。例如,HODEs与动脉粥样硬化的形成有关 [10]。酒精与HODEs共存的条件下,可加剧Caco-2细胞肠道屏障的损坏 [14]。病理生理学研究发现,EPODEs与DHODEs可导致肺水肿 [15]、抑制线粒体呼吸 [16],造成多器官功能衰竭(例如狗与大鼠的心脏停搏) [17-18]。关于THODEs生物重要性的研究很少,但是相关研究表明啤酒中存在的THODEs对啤酒品质有一定的影响 [19-21]

目前,有关羟基十八碳烯酸的研究主要集中于其体内代谢产生途径、内源性羟基十八碳烯酸的病理生理学意义、体液(血液、尿液等)中含量的分析方法等。例如Penny等 [22]采用高效液相色谱-串联质谱(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)法对血液中9,10-DHODE与9,10-EPODE进行了检测,Newman等 [23]采用同种方法对尿液中的9,10-DHODE与9,10-EPODE进行了检测,检出限低达0.1、0.3 ng/mL。Wu等 [24]采用气相色谱-质谱对吸附在硅胶上的脂肪酸单分子层,包括EPODE,进行了分析。然而有关外源性(如膳食)羟基十八碳烯酸的生物学作用、膳食中羟基十八碳烯酸的检测方法以及含量分布等研究报道很少。

腌腊肉制品是原料肉经过预处理、腌制、酱制、晾晒(或烘烤)等工艺加工而成的肉类制品,是我国传统的肉制品之一,深受广大消费者喜爱。腌腊肉制品主要包括腊肉类、咸肉类、风干肉类、火腿、香肠等,普遍加工周期较长,期间的脂质氧化对于腌腊肉制品的特征风味物质的产生至关重要。本实验以腌腊肉制品中LA的氧化产物——羟基脂肪酸为研究对象,建立13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE和9,10,13-THODE的HPLCMS/MS分析方法,并研究不同腌腊肉制品中13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE和9,10,13-THODE的含量分布情况,为进一步开展腌腊肉制品的羟基十八碳烯酸的相关研究提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腌腊肉制品 市购。

13-HODE 美国Cayman Chemicals公司;9,10-DHODE、9,10-EPODE及9,10,13-THODE 瑞典Larodan公司;乙腈及甲醇 德国Merk公司;水由纯水仪制备美国Millipore公司;Sep-Pak C 18固相萃取柱(500 mg/3 mL)美国Waters公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1290-6460QQQ HPLC-MS/MS仪(配有电喷雾离子源) 美国安捷伦公司;多头抽真空装置 美国Alltech公司;Biofuge stratos高速离心机 德国Heraeus公司;T25高速匀浆机 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

取适量体积质量浓度分别为0.5、1.0、0.1、0.1 mg/mL的13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE标准溶液,用甲醇稀释至质量浓度分别为5 μg/mL,取适量体积质量浓度为5 μg/mL的13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE混合制备系列标准工作溶液,使得13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE的质量浓度范围分别为0.05~2.0、0.01~0.5、0.05~1.0、0.01~0.5 μg/mL,将标准工作溶液储存于-40 ℃备用。

1.3.2 样品处理

将腌腊肉制品切碎装入密封袋中,储存于-18 ℃备用。称取2 g的肉样于100 mL离心管中,加入16 mL甲醇后5 000 r/min均质2 min,随后3 200×g离心10 min,将2.5 mL上清液过C 18固相萃取柱(C 18固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL水进行活化与平衡),弃去最初的0.5 mL洗脱液,收集的剩余洗脱液于-40 ℃储存备用。

1.3.3 仪器工作条件

HPLC条件:色谱柱:XBridge C 18(150 mm× 4.6 mm,5 μm);流动相:A为0.1%甲酸,B为乙腈;流速:0.6 mL/min;柱温:30 ℃;梯度洗脱程序:0 min、50% B;10 min、90% B;20 min、90% B;25 min、50% B;30 min、50% B;进样量:10 μL。

MS条件:离子源:电喷雾源负离子模式;离子化条件:气温与流速分别为300 ℃、8 L/min;鞘流气温度与流速分别为280 ℃、11 L/min;雾化气压45 psi;毛细管电压3.5 kV;定量模式:多反应监控模式;离子转变:13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE分别为m/z 295.5→m/z 277.3、m/z 313.4→m/z 201.3、m/z 295.3→m/z 277.3、m/z 329.4→m/z 171.3(表1);所有数据通过安捷伦MassHunter工作站中的软件进行分析,包括优化软件、数据获取软件以及定性分析软件。

表1 优化的转变离子及碰撞条件
Table1 Optimized transition ions and collision energy

注:*.定量子离子。

分析物母离子子离子碎裂电压/V碰撞能量/eV 13-HODE295.5277.3*945 195.5 201.3* 277.4 295.2 171.2 9,10-EPODE295.3277.3*945 171.2 9,10,13-THODE329.4171.3*1439 139.4 9,10-DHODE313.41739

1.3.4 方法验证

1.3.4.1 标准曲线

将13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE配制成质量浓度分别为0.05~2.0、0.01~0.5、0.05~1.0、0.01~0.5 μg/mL的系列混合标准工作溶液,进行HPLC-MS/MS分析,每个质量浓度重复测定3 次。以标准品质量浓度为横坐标x,以对应峰面积为纵坐标y,绘制标准曲线。按照3 倍信噪比(R SN=3)和10 倍信噪比(R SN=10)计算方法的检出限和定量限。

1.3.4.2 精密度实验

选择不同的腌腊肉制品,按照1.3.2节的步骤进行处理,每种样本进行6 个重复处理,在1 d内进行HPLC-MS/ MS分析,将其中3 个重复连续3 d每天测定1 次,以测得的结果分别计算日内和日间的精密度(以相对标准偏差表示)。

1.3.4.3 回收率实验

选择与添加水平相近的腌腊肉制品,根据添加水平向样本中添加13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE的标准品,按照1.3.2节的步骤进行处理,每个添加水平做3 个重复处理,测定分析物的含量,计算回收率。

1.4 数据分析

采用SPSS statistics 17.0进行单因素方差分析与相关性分析,均值采用邓肯多重范围检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 样品处理

色谱分析常用的样品提取方法包括液液萃取、超临界流体萃取、超声波辅助萃取以及微波萃取等 [25]。13-HODE、9,10-DHODE、9,10,13-THODE为羟基类脂肪酸,极性较大,可用有机溶剂进行提取,例如乙酸乙酯、甲醇、乙腈等,随后利用固相萃取柱进行净化浓缩 [22]或者直接进行色谱分析 [23]。通常采用液液提取方法对内源性(如血液、尿液)的13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE进行提取 [22-23]。对于饮食中的羟基脂肪酸,本实验采取超声波辅助、机械振荡以及均质匀浆等方式,观察了乙酸乙酯、乙腈、甲醇以及40%~90%的甲醇的提取效果,随后利用固相萃取柱对分析物进行净化浓缩。结果表明,采用乙酸乙酯提取的回收率最低,约为50%,40%~90%的甲醇提取回收率约为60%~80%,乙腈与甲醇的提取效果相似,回收率均大于80%~95%。由于乙腈价格较高且毒性较大,综合考虑,本实验选取甲醇为溶剂进行均质提取,并与提取后直接进行色谱分析进行了比较,结果发现固相萃取柱起到了很好的浓缩效果,去除大量疏水性的化合物,降低了干扰。本实验确定的样品处理方法可以满足HPLC-MS/ MS法同时分析腌腊肉制品中13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE含量的要求。

2.2 HPLC-MS/MS分析结果

图1 混标与样本总离子流图
Fig.1 Total ion chromatograms for mixed standard solution and sample

A.混标,1~4分别为9,10,13-THODE(0.5 μg/mL)、9,10-DHODE(0.5 μg/mL)、13-HODE(0.5 μg/mL)、9,10-EPODE(1.0 μg/mL);B.雨润烤肠,1~8分别为9,10,11-THODE或者9,12,13-THODE、9,10,13-THODE、12,13-DHODE、9,10-DHODE、13-HODE、9-HODE、12,13-EPODE、9,10-EPODE。

13-HODE、9,10-DHODE、9,10,13-THODE为羟基类十八碳烯酸,9,10-EPODE为环氧十八碳烯酸,它们所带羟基基团数量不同,故在中性或者酸性条件下的响应不相同。本实验研究了中性以及酸性条件下4 种分析物的离子化情况。结果表明,9,10-EPODE在中性条件下不能离子化,酸性条件下13-HODE、9,10-DHODE、9,10,13-THODE、9,10-EPODE均可离子化,且信噪比高于中性条件,确定流动相A为0.1%甲酸,流动相B为乙腈,并进一步优化了梯度洗脱条件。由图1可见,目标分析物与杂质峰实现了基线分离。

通过保留时间以及MS/MS对13-HODE、9,10-DHODE、9,10,13-THODE、9,10-EPODE进行鉴定。4 种分析物标准品的全扫模式显示,13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE母离子分别为m/z 295.5、m/z 313.4、m/z 295.3、m/z 329.4(图2A、2C、2E、2G)。MS/MS 结果显示,13-HODE产生了两个特征离子峰m/z 277.3(丢失一分子H 2O)、m/z 195.5(丢失HO—CH=CH(CH 23CH 3);9,10-DHODE产生的特征离子峰分别为m/z 295.2(丢失一分子H 2O)、m/z 277.4(丢失两分子H 2O)、m/z 201.3(丢失CH 3(CH 24CH=CHCH 2—)、m/z 171.2(丢失CH 3(CH 24CH=CHCH 2CHOH—);9,10-EPODE产生的特征离子峰为m/z 277.3(丢失一分子H 2O)、m/z 171.2(丢失CH 3(CH 24CH=CHCH 2CH—);9,10,13-THODE产生的子离子为m/z 171.3(HCO—(CH 27—COO)、m/z 139.4(CH 3(CH 24C(O—)=CH—CH=CH 2)。4 种分析物的MS/MS与其他研究是一致的 [22-23,26-28]

在实际样本分析时,发现4 种目标分析物有异构体同时存在(图1B)。通过样本中各个峰的MS/ MS验证发现,图1B中峰1的母离子为m/z 329.4,这与9,10,13-THODE的母离子一致,产生的子离子峰为m/z 229.3、m/z 211.3、m/z 171.3、m/z 139.3(图2H);峰3的母离子为m/z 313.3,这与9,10-DHODE的母离子一致,产生的子离子有m/z 295.4、m/z 195.4、m/z 183.2、m/z 129.3(图2D);峰6的母离子为m/z 295.4,与13-HODE的母离子一致,产生的子离子峰分别是m/z 277.4、m/z 171.3(图2B);峰7的母离子为m/z 295.2,这与9,10-EPODE的母离子一致,产生的碎片离子为m/z 277.4、m/z 195.1、m/z 181.2(图2F)。通过与相关文献 [23,26-28]比较发现,母离子为m/z 329.4的峰1应为9,10,13-THODE的异构体,可能为9,10,11-THODE或者9,12,13-THODE;母离子为m/z 313.3的峰3为9,10-DHODE的异构体12,13-DHODE;母离子为m/z 295.4的峰6是13-HODE的异构体9-HODE;母离子为m/z 295.2的峰7为9,10-EPODE的异构体12,13-EPODE。

图2 羟基类十八碳烯酸极其异构体的二级质谱图
Fig.2 MS/MS spectra for hydroxy(s) octadecenoic acids and the isomers

A. 13-HODE标样;B.样本中鉴定的9-HODE;C. 9,10-DHODE标样;D.样本中鉴定的12,13-DHODE;E. 9,10-EPODE标样;F.样本中鉴定的12,13-EPODE;G. 9,10,13-THODE标样;H.样本中鉴定的9,10,11-THODE或者9,12,13-THODE。

2.3 方法验证

2.3.1 线性范围及检出限

将适量13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE和9,10,13-THODE的标准溶液混合,配制4 种目标分析物的质量浓度分别为0.05~2.0、0.01~0.5、0.05~1.0 μg/mL和0.01~0.5 μg/mL的混合标准工作溶液,然后进行HPLC-MS/MS分析。以标准品质量浓度为横坐标x,以对应峰面积为纵坐标y,绘制标准曲线。按照3倍信噪比(R SN=3)和10倍信噪比(R SN=10)计算方法的检出限和定量限,检出限分别为0.120、0.008、0.200、0.016 μg/g,定量限分别为0.40、0.02、0.64、0.05 μg/g(表2)。4 种分析物的相关系数(R 2)均大于0.999,由此可见在相应线性范围内,标准品的质量浓度与峰面积有良好的线性关系。

表2 方法的线性、检出限以及定量限
Table2 Linearity, limits of detection, and limits of quantification of the proposed method

注:a. y为峰面积,x为质量浓度/(μg/mL);b.根据样本处理换算。

分析物13-HODE9,10-DHODE9,10-EPODE9,10,13-THODE线性范围/(μg/mL)0.05~2.00.01~0.50.05~1.00.01~0.5回归方程 ay = 7 827x-105.7y = 25 826x+177.2y = 3 731x-2.7y = 25 720x-49.8相关系数(R 2)0.999 80.999 00.999 80.999 6检出限/(μg/g) b0.1200.0080.2000.016定量限/(μg/g) b0.400.020.640.05

2.3.2 精密度实验结果

方法的精密度通过两种典型的腌腊肉制品的日内与日间实验验证,分别是含有分析物含量相对较多的农家腊肠以及含量相对较低的板鸭,结果见表3。13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、和9,10,13-THODE的精密度(相对标准偏差)范围分别为2.3%~5.7%、4.2%~9.0%、3.8%~6.8%和2.0%~8.6%,表明本实验建立的检测方法具有较好的精密度。

表3 精密度实验结果(n=3)
Table3 Precision of the method for determination of the analytes (n= 3)

注:a. 1 d之内分析6 次;b. 连续3 d,每天分析3 次。

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2.3.3 准确性实验结果

按照低、中、高含量选择双汇熏煮火腿、雨润牛肉火腿以及火腿进行添加回收实验,添加与样本中目标分析物含量相近的标准品,分析添加前后的4 种目标分析物的含量,并计算添加回收率,结果见表4。由表4可知,13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE的回收率范围分别为90.8%~97.5%、82.0%~88.0%、84.0%~89.0%、82.0%~89.0%,不同添加水平的平均回收率分别为95.1%、85.2%、86.8%、86.2%。表明本实验所建立的检测方法可较准确的定量腌腊肉制品中的分析物。

表4 不同添加水平回收率测定结果(n=3)
Table4 Recoveries of the analytes at different spiked?levels (n=3)

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2.3.4 实际样本分析

13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE具有重要的生理与病理作用,但在腌腊肉制品中的含量分布却鲜为人知。为了了解传统腌腊肉制品中4 种分析物的含量,本实验选取了超市中26 种腌腊肉制品,包括9 种生制腌腊肉制品(例如苏式香肠、农家腊肠),17 种即食制腌腊肉制品(例如雨润烤肠、荷尔美切片火腿),分析4 种目标分析物的含量分布情况(表5)。

表5 生制腌腊肉制品与即食腌腊肉制品中13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE及9,10,13-THODE的含量(x±s,n=3)
Table5 Contents of 13-HODE, 9,10-DHODE, 9,10-EPODE and 9,10,13-THODE in raw cured meat products and instant foods from cured meat (x ± s, n= 3)

注:ND.未检出。

样本含量/(μg/g)13-HODE9,10-DHODE9,10-EPODE9,10,13-THODE生制腌腊肉制品火腿46.71±1.191.82±0.046.90±0.099.81±0.08苏式香肠24.35±1.670.39±0.022.69±0.101.56±0.07咸肉14.92±0.340.41±0.0010.82±0.032.47±0.08农家腊肠100.77±2.861.33±0.066.75±0.2810.12±0.21风干鸭1.40±0.070.20±0.01ND1.22±0.04风干鱼4.03±0.280.13±0.01ND0.49±0.02板鸭12.25±0.290.32±0.011.53±0.040.76±0.05南京香肚28.29±0.130.69±0.051.84±0.162.62±0.04天泽城节肠30.94±0.501.50±0.085.11±0.273.33±0.19雨润烤肠54.97±0.313.55±0.035.18±0.363.53±0.11雨润红肠57.58±1.423.93±0.053.62±0.186.57±0.14雨润熏烤火腿39.27±1.421.73±0.011.77±0.552.30±0.01雨润火腿排12.41±0.190.41±0.01ND0.81±0.03雨润熏煮火腿41.08±0.221.85±0.121.17±0.062.23±0.08雨润牛肉火腿19.72±0.181.05±0.012.61±0.111.82±0.04雨润劲阳光火腿11.96±0.380.76±0.041.11±0.050.96±0.04雨润台湾烤肠2.87±0.020.11±0.01ND0.26±0.01双汇方腿香肠60.42±0.251.35±0.022.83±0.032.48±0.07双汇肘花小火腿50.55±0.391.21±0.091.51±0.082.06±0.10双汇蒜蓉烤肠77.56±0.432.89±0.086.20±0.424.36±0.07双汇烤肉饼57.67±0.462.26±0.132.78±0.073.05±0.10双汇熏煮火腿6.71±0.120.17±0.010.77±0.020.37±0.02双汇蒸煮火腿23.90±0.470.57±0.032.34±0.121.70±0.02双汇特嫩烤香肠36.78±0.581.15±0.032.99±0.071.55±0.08双汇配餐金火腿53.11±1.571.49±0.042.61±0.112.32±0.01荷尔美切片火腿4.37±0.260.33±0.01ND0.53±0.02即食腌腊肉制品

由表5可知,所有样本均检测出13-HODE、9,10-DHODE和9,10,13-THODE,21 个样本检测出9,10-EPODE。在生制腌腊肉制品中,13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE和9,10,13-THODE的含量范围分别为1.40~100.77、0.13~1.82、0.77~6.9 μg/g和0.82~10.12 μg/g;即食腌腊肉制品中4 种目标分析物的含量范围分别为2.87~77.56、0.11~3.93、0.77~6.20 μg/g和0.26~6.57 μg/g。

统计分析显示,13-HODE的含量显著高于9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE(P<0.05),9,10,13-THODE的含量显著高于9,10-DHODE、9,10-EPODE(P<0.05),在检测出9,10-EPODE的样本中,其含量显著高于9,10-DHODE(P<0.05)。但在生制腌腊肉制品和即食腌腊制品中,4 种分析物含量并不存在显著差异(P>0.05)。统计分析还显示,13-HODE、9,10-DHODE和9,10,13-THODE三者显著相关(P<0.01),9,10-DHODE与9,10-EPODE显著相关(P<0.01)。由于不饱和脂肪酸(LA)在酶促或者非酶促条件下氧化 [8],先生成氢过氧化物(HPODE),然后转化为羟基化合物(HODE),再进一步转化为其他氧化产物 [29],这可能是13-HODE含量显著高于其他氧化产物并且具有显著相关性的原因。同样地,9,10-EPODE在可溶性环氧化物水解酶的作用下生成9,10-DHODE,腌腊肉制品中加工过程中酶活性的逐渐下降应该是导致9,10-EPODE大于9,10-DHODE的主要原因;而某些样本中未检出9,10-EPODE但却有微量9,10-DHODE存在,表明可能存在9,10-DHODE的非酶促形成途径。生制腌腊肉制品与即食腌腊肉制品中的含量不存在显著差异,说明上述4 种LA的氧化产物有较强的热稳定性,一般食品加工温度对它们含量的影响很小。新鲜肉(猪肉、鱼肉、牛肉、鸡肉等)中4 种目标分析物的含量极其低(数据未列出),表明腌腊肉制品中羟基脂肪酸主要来源于加工过程。腌腊肉制品的加工过程中羟基脂肪酸的形成规律、以及影响因素等值得进一步深入研究。

13-HODE与9-HODE的峰面积相似,由此可推知腌腊肉制品中二者的含量相似,说明在腌腊肉制品中,非酶促氧化生成HODEs占据主导地位。在实际样本分析时发现,所有的样本均存在3 个以上的目标分析物的异构体,由于缺少标准物质,本实验未能对其进行定量分析,但可以推测,样本中羟基十八碳烯酸的含量应比本实验结果高得多。需关注的是,腌腊肉制品中9,10-DHODE与9,10-EPODE的含量总和在2~8 μg/g间,由于异构体的存在使得腌腊肉制品中DHODEs与EPODEs的实际含量会更高,由于人体组织中可溶性环氧化物水解酶的广泛分布 [30],使得随食物摄入人体的EPODEs经消化后生成的DHODEs要远远高于腌腊肉制品中检测出的DHODEs。许多研究表明,HODEs与多种心血管疾病的形成有关,例如导致动脉粥样硬化;DHODEs可促进有丝分裂以及胸部MCF-7癌细胞的增值,并可扰乱老鼠的内分泌、发情周期与性行为,所用剂量仅是植物雌激素的1/200 [31-32]。因此,腌腊肉制品中广泛存在的HODEs、DHODEs、EPODEs的形成机制、加工方式影响及其潜在健康风险有待进一步研究。

3 结 论

本实验通过样本处理条件以及色谱条件的优化,建立了腌腊肉制品中13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE和9,10,13-THODE的HPLC-MS/MS检测方法。腌腊肉制品中13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE和9,10,13-THODE用甲醇提取,经固相萃取柱净化浓缩,然后在XBridge色谱柱上进行梯度分离,流动相为0.1%甲酸与乙腈,采用电喷雾源负离子模式以及多反应监测模式进行定性定量分析。结果表明,13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE和9,10,13-THODE分别在质量浓度为0.05~2.0、0.01~0.5、0.05~1.0、0.01~0.5 μg/mL的范围内具有较好的线性关系(R 2>0.999),检出限分别为0.120、0.008、0.200、0.016 μg/g,不同添加水平的平均回收率分别为95.1%、85.2%、86.8%、86.2%。对26 种腌腊肉制品含量分析表明,所有样本都含有13-HODE、9,10-DHODE、9,10,13-THODE,含量分别在1.4~100.7、0.1~3.9、0.4~10.2 μg/g范围内,21 种样本中含有9,10-EPODE,含量范围为0.8~6.9 μg/g。4 种分析物异构体的存在,提高了腌腊肉制品中来源于LA的羟基脂肪酸的实际含量。腌腊肉制品中羟基脂肪酸的相关研究值得关注。

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Simultaneous Determination of 13-HODE, 9,10-DHODE, 9,10-EPODE and 9,10,13-THOD in Cured Meat Products by HPLC-MS/MS

SONG Hui 1,2, GENG Zhiming 2, REN Shuang 1,2, WANG Daoying 2, ZHANG Muhan 2, SUN Chong 2, XU Weimin 1,2,3,*
(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;3. Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Nanjing 210095, China)

Abstract:13-Hydroxy-9,11-octadecadienoic acid (13-HODE), 9,10-dihydroxy-12-octadecenoic acid (9,10-DHODE),9,10-epoxyoctadec-12-enoic acid (9,10-EPODE) and 9,10,13-trihydroxy-11-octadecenoic acid (9,10,13-THODE) in cured meat products were detected with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The analytes, extracted with methanol and cleaned by solid phase extraction, were separated on an XBridge C 18column with a mobile phase consisting of 0.1% formic acid in water and acetonitrile, followed by ionization and quantification with an electrospray ionization source in negative ion mode and multiple reaction monitoring mode (MRM). The results indicated that the calibration curves for 13-HODE, 9,10-DHODE, 9,10-EPODE and 9,10,13-THODE exhibited good linearity(R 2> 0.999) in the ranges of 0.05-2.0, 0.01-0.5, 0.05-1.0 and 0.01-0.5 μg/mL, respectively. The limits of detection (LODs)for the four analytes were 0.120, 0.008, 0.200, and 0.016 μg/g, and the recoveries were 95.1%, 85.2%, 86.8% and 86.2%,respectively. The method was successfully employed to detect the analytes in 26 cured meat products and the resultsshowed that all the samples contained 13-HODE, 9,10-DHODE and 9,10,13-THODE ranging from 1.4-100.7, 0.1-3.9 and 0.4-10.2 μg/g, respectively, and out of these samples, 21 contained 9,10-EPODE ranging from 0.8-6.9 μg/g. Since some isomers of the analytes were detected in samples as well, the real content of fatty acids with hydroxyl group (s) from oxidation of linoleic acid (LA) might be much higher.

Key words:linoneic acid; cured meat products; 13-HODE; 9,10-DHODE; 9,10-EPODE; 9,10,13-THODE; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618022

中图分类号:TS201.6

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)18-0133-08

引文格式:

宋慧, 耿志明, 任双, 等. 腌腊肉制品中13-HODE、9,10-DHODE、9,10-EPODE、9,10,13-THODE的HPLC-MS/MS检测[J].食品科学, 2016, 37(18): 133-140. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618022. http://www.spkx.net.cn

SONG Hui, GENG Zhiming, REN Shuang, et al. Simultaneous determination of 13-HODE, 9,10-DHODE, 9,10-EPODE and 9,10,13-THOD in cured meat products by HPLC-MS/MS[J]. Food Science, 2016, 37(18): 133-140. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618022. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2015-11-19

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31401560);江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(13)3081)

作者简介:宋慧(1992—),女,硕士研究生,研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail:1562275871@qq.com

*通信作者:徐为民(1969—),男,研究员,博士,研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail:weiminxu2002@aliyun.com