王 莉，罗颖鹏，罗小虎，王 韧，李永富，李亚男，邵慧丽，陈正行*
（江南大学食品学院，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122）
摘 要：利用臭氧降解小麦中的呕吐毒素，通过超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC Q-TOF MS）测定了纯水体系中呕吐毒素的臭氧降解产物。结果表明：全麦粉中的呕吐毒素降解率显著高于小麦籽粒。当小麦水分含量为20.10%，臭氧质量浓度为100 mg/L，处理60 min后，呕吐毒素含量由3.89 mg/kg 降到了0.83 mg/kg。建立的一级动力学方程显示臭氧反应速率为k 100 mg/L＞k 75 mg/L＞k 50 mg/L＞k 25 mg/L。根据UPLC Q-TOF MS得到离子碎片信息提出了可能的离子碎片生成途径并推测了臭氧降解产物结构，5 种主要产物的m/z分别为344.948 1、329.205 0、311.191 8、311.190 7和346.240 4。
关键词：小麦；呕吐毒素；臭氧；动力学；降解产物
呕吐毒素学名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是镰刀菌的一种次级代谢产物，特别是禾谷镰刀菌，会引起小麦赤霉菌 ［1-2］。DON会抑制蛋白质的合成，导致呕吐、腹泻、厌食、神经紊乱等毒性效应 ［3-5］。由于气候、环境等条件的原因，很难避免DON污染粮食，且普通的加工方式很难将其破坏。常用的物理方法 ［6-9］降解效率不高；化学方法 ［10］常用碱处理等化学试剂处理，会有化学残留；生物法因其反应条件温和，能改善产品的品质，但成本较高。因此，寻找一种安全有效、可应用的DON消减方法仍非常必要。
臭氧可迅速破坏有机物中的双键，形成含双键少、分子质量较低的物质；且臭氧可自动分解成氧气，没有毒性残留。1997年，臭氧被美国鉴定为一般认为安全物质，并被食品药品监督管理局证明可以直接加入到食品中 ［11］。另外，前人大量的研究证明臭氧能够高效地去除花生、玉米、无花果、小麦等粮食中的黄曲霉毒素 ［12-15］。与臭氧处理黄曲霉毒素B 1（aflatoxin B 1，AFB 1）相比，DON的臭氧处理研究相对较少，而关于其臭氧降解产物的研究更是鲜有报道。超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC Q-TOF MS）在研究毒素降解产物方面已被广泛应用。刁恩杰等 ［16］利用UPLC Q-TOF MS研究乙腈溶液中的AFB 1臭氧降解产物，发现了6 种主要降解产物，推测了它们的结构并提出了可能的AFB 1臭氧降解途径。Luo Xiaohu等 ［17-18］用该仪器分别分析臭氧水溶液和干臭氧处理AFB 1可能的降解产物，推测了相应的产物结构以及降解途径。Liu Ruijie等 ［19］也利用该仪器做了AFB 1光降解产物的研究。证明UPLC Q-TOF是一种有效地推测产物结构的工具。
本实验研究了不同条件下臭氧对污染小麦中DON的降解效果，并建立相应的一级动力学方程，以期为臭氧降解DON的实际应用提供理论基础。同时，推测了臭氧降解产物的结构，对于评价产物的毒性有重要的意义。
1.1 材料与试剂
DON自然污染小麦 市购；DON标准品（CAS：51481-10-8，纯度≥99%）、乙腈（色谱纯） 百灵威科技有限公司；Mycosep 227# Trch+固相萃取柱 美国Romer Labs公司；除特别说明，其他试剂均为分析纯国药集团（上海）化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
通过臭氧发生器 中国青岛国林有限公司；1260系列高效液相色谱仪（带紫外检测器）、ZORBAXSB-C 18柱美国Agilent科技有限公司；Ideal 2000臭氧分析记录仪 中国淄博测量控制有限公司；Acquity UPLC仪、Synapt Q-TOF MS质谱仪、UPLC BEH C 18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） 美国Waters公司；Millipore-Q SP超纯水仪 美国Millipore公司；HYGA全温摇瓶柜 太仓市实验设备厂。
1.3 方法
1.3.1 臭氧处理小麦样品
挑出杂质后取一定量样品充分混匀，通过四分法取100 g小麦籽粒或者全麦粉（过孔径为0.6 mm筛）置于一个玻璃反应器中。臭氧气体先从反应器底部进入，从顶端排出。反应器的底部铺满了玻璃珠，目的是使臭氧气体分布均匀。玻璃珠上面是待处理的物料，两者之间由钢丝网隔开。臭氧流速为2 L/min不同水分含量（11.79%、16.29%、20.10%）的样品用不同质量浓度的臭氧（0、25、50、75、100 mg/L）处理，环境温度与湿度分别为25℃、75%。每个样品处理时间分别为0、15、30、45、60 min。残余的臭氧气体通过尾气分解器分解成氧气排出，所有处理后的样品在4 ℃条件下储藏，待测。
1.3.2 DON检测 ［20］
1.3.2.1 样品处理
取25 g样品置于250 mL锥形瓶中，加入100 mL乙腈-水（84∶16，V/V），在200 r/min的摇床上剧烈振荡30 min，得到提取液，布氏漏斗过滤，收集滤液。取上述滤液4 mL，由Mycosep 227# Trch+净化柱净化，用塑料管收集2 mL 净化液，在50 ℃条件下N 2吹干。残余物用1mL乙腈-水（6∶94，V/V）复溶，涡旋振荡30 s。复溶液过0.22 μm 滤膜，并在4 ℃条件下储藏，待高效液相色谱分析。
1.3.2.2 液相色谱测定方法
仪器为安捷伦1260系列，可变波长紫外检测器。检测波长为218 nm，色谱柱为安捷伦ZORBAXSB-C 18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。检测时柱温维持在35 ℃，流速0.8 mL/min，流动相为乙腈-水（6:94，V/V），进样量10 μL，检测时间20 min。
1.3.3 降解率计算
臭氧处理DON降解率的计算公式为：
式中：c （A，t）为样品中DON经臭氧处理t时间后的初始含量/（mg/kg）；c （A，0）为样品中DON的初始含量/（mg/kg）。
1.3.4 动力学模型
一级动力学模型建立方法参考罗小虎等 ［21］的文献。
1.3.5 DON臭氧降解产物分析
1.3.5.1 臭氧处理DON标准品
取1 mL 40 mg/L的标准工作液到EP管中，40 ℃条件下氮气吹干后，1 mL超纯水复溶。按同样的方法得到若干个样品。将质量浓度为10 mg/L的臭氧气体直接通入样品溶液中，分别处理0、0.5、1、1.5、3 min和5 min。
1.3.5.2 UPLC Q-TOF MS条件
UPLC条件：配置自动进样器，二元溶液梯度系统，紫外检测器的Waters Acquity UPLC系统，分离柱为UPLC BEH C 18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 µm）。流动相组成为：乙腈（A）和0.1%甲酸溶液（B）。采用梯度洗脱模式进行检测，流动相梯度配比为：0 min 5% A，95% B；0.5 min 5% A，95% B；10 min 70% A，30% B；12 min 100% A；12.1 min A流动相迅速降为5%，并维持2 min。整个进样分析过程耗时15 min；进样量0.5 μL；流速300 μL/min；柱温45 ℃。
MS条件：质谱仪的检测由配备电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源的Waters Synapt Q-TOF系统在阳离子（positive ionization，PI）模式下实现的。其实验条件如下：3.0 kV的毛细管电压，30 V锥孔电压，100 ℃离子源温度，和400 ℃的脱溶剂气体温度。锥孔和脱溶剂气体的气流速度分别为50 L/h和500 L/h。质核比扫描范围m/z 50～800，碰撞能量6 eV。
1.4 统计分析与数据处理
所有试验都重复至少3 次，图形由Origin 8.6绘制；质谱图数据由工作站Masslynx V4.1及MassFragment处理完成。
2.1 不同处理条件对臭氧降解DON效果的影响
2.1.1 水分含量对臭氧降解DON效果的影响
图1表明水分含量是影响小麦中DON降解率的关键因素。11.79%、16.29%和20.10%这3 种水分含量的样品中DON的初始含量分别为3.98、3.93 mg/kg和3.89 mg/kg。很明显，图中水分含量为11.79%的全麦粉，在100 mg/L的臭氧质量浓度条件下处理1h，所得降解率为47.42%；当水分含量为20.10%时DON的降解率则上升到了78.55%。可能是因为水分的存在提高了臭氧的氧化能力，增加了它的渗透性。Tiwari等 ［22］认为湿度条件可能会减慢臭氧在物料层的运动，相当于延长了臭氧与毒素的接触时间。Young等 ［10］得出湿臭氧对小麦中DON的影响甚微，可能是因为小麦的水分含量过低（约为12%）或者是物料颗粒太大而不能与臭氧发生充分反应。在Young ［23］的另外一篇论文中，当湿玉米（水分含量50%）和饱和水溶液臭氧，或者湿玉米与干臭氧反应，污染玉米中的DON有明显减少。与之相反，当玉米的水分含量太低时，臭氧对DON的影响很小。Dwarakan ［24］和Luo Xiaohu ［25］等也认为物料水分含量是臭氧降解AFB 1的一个重要因素。
2.1.2 物料形态对臭氧降解DON效果的影响
图1 不同水分含量全麦粉（a）和籽粒（b）中DON臭氧降解效果
Fig.1 Efficacy of DON degradation in whole wheat flour （a） and kernels （b） with different moisture contents
图1 a和1b分别反映了全麦粉与小麦籽粒之间的DON降解率，臭氧对全麦粉中的DON降解率明显优于小麦籽粒。水分含量为16.69%的污染小麦，在100 mg/L臭氧质量浓度条件下处理60 min后，前者的DON降解率最高达67.26%，后者仅有50.03%；水分含量为11.79%和20.10%时，同样条件下处理具有相同的趋势。出现这种现象可能是由于全麦粉与臭氧的接触面积更大，全麦粉更加多孔，臭氧渗透性更好，毒素能更彻底地和臭氧发生反应。Akbas ［26］和Proctor ［27］等得到了相反的结论，他们认为在条件相同的情况下，花生粉或者无花果粉中的AFB 1减少量要少于籽粒中的毒素减少量。可能是因为粉凝结成块，导致臭氧和样品接触不充分。另外，还可以有另外一种原因解释这个现象：小麦中的DON在不同的部位分布是有差异的，而且不同的品种，DON的分布情况也不尽相同 ［8，28］。本研究籽粒中的DON降解率低可能是因为所选小麦的表面分布的DON较少，而磨成粉后就使得其从内部暴露出来，因而能够得到较高的降解率。
2.1.3 臭氧质量浓度与处理时间对DON降解效果的影响
图2 20.10%小麦粉（a）与小麦籽粒（b）中DON臭氧降解效果
Fig.2 Efficacy of DON degradation in whole wheat flour （a） and kernels （b） with 20.10% moisture content by ozonation
如图2所示，不同臭氧质量浓度与处理时间对DON的降解有着明显不同的效果。含水量为20.10%的小麦，分别用0、25、50、75、100 mg/L臭氧处理0、15、30、45、60 min。当处理臭氧质量浓度为100 mg/L，|处理60 min，全麦粉中的DON降解率达到了78.55%（图2a）；在同样的条件下，小麦籽粒中的DON降解率仅有58.35%（图2b），明显低于小麦籽粒。随着臭氧质量浓度的提高，处理时间的延长，小麦中 DON的降解率也明显增加（P＜0.05）。
Young ［23］将玉米粉碎后，经干臭氧处理15 min，DON降解率达到了65%，处理时间延长到60 min后，降解率升高到了90%。结果与本实验结果有差异的原因可能是基质、毒素初始含量或水分含量不同，氧气的不同流速也可能是影响降解效率的原因。Zorlugenc ［15］、Luo Xiaohu ［24］和Inan ［29］等研究也表明随着处理时间，臭氧质量浓度的提升，玉米、无花果、红辣椒中的AFB 1降解率也随着增加，和本实验的研究结果一致。
2.2 一级动力学模型
图3 20.10％小麦粉（a）与籽粒（b）一级动力学拟合曲线
Fig.3 First order kinetic fitting curves for whole wheat flour （A） and kernels （B） with 20.10％ moisture content
图3 表示的是20.10%水分含量的小麦其反应时间与不同臭氧质量浓度和物料形态的ln（c （A，t）/c （A，0））值之间的一级动力学曲线。该曲线都符合动力学模型的特点。DON降解一级动力学模型在其他文献中也有应用。Vidal ［30］和Numanoglu ［31］等都建立了热处理消减DON的动力学模型，他们的研究也同样在固体物料中执行，并对DON降解显示了较好的适用性，一定程度上支持了本实验研究结果。
表1 不同处理条件下一级动力学参数
Table1 First order kinetic parameters under different treatment conditions
注：*.P＜0.05，差异显著；**.P＜0.01，差异极显著。
含量/%形态臭氧质量水分浓度/（mg/L）动力学方程R 2反应速率常数k A/min -1t 1/2/min显著性全麦粉20.10 25c （A，t）=3.549e -0.012t0.9210.012±0.00257.8** 50c （A，t）=3.649e -0.017t0.9760.017±0.00240.8** 75c （A，t）=3.469e -0.021t0.9280.021±0.00333.0** 100c （A，t）=3.116e -0.024t0.9130.024±0.00428.9**籽粒25c （A，t）=3.842e -0.006t0.9960.006±0.0002115.5** 50c （A，t）=3.822e -0.010t0.9810.010±0.00169.3** 75c （A，t）=3.852e -0.011t0.9750.011±0.00163.0** 100c （A，t）=3.749e -0.015t0.9870.015±0.00146.2**全麦粉25c （A，t）=3.731e -0.009t0.9360.009±0.00175.6** 50c （A，t）=3.360e -0.010t0.8990.010±0.00268.6** 75c （A，t）=3.619e -0.014t0.9090.014±0.00248.1** 100c （A，t）=3.622e -0.018t0.9360.018±0.00239.1** 25c （A，t）=3.767e -0.005t0.8860.005±0.001138.6* 50c （A，t）=3.795e -0.008t0.9650.008±0.00186.6** 75c （A，t）=3.785e -0.010t0.9660.010±0.00169.3** 100c （A，t）=3.761e -0.012t0.9690.012±0.00157.8** 16.29籽粒
表1列出了一级动力学模型在不同处理条件下的方程、相关系数、反应速率常数、半衰期和显著性等参数。表中R 2值都大于0.877，显示了一级动力学模型良好的拟合度。反应速率常数k A反映地是臭氧与DON反应过程的快慢，k A值越大，则反应越快，达到目标效果的时间越短。从表1可以看出，k 100 mg/L＞k 75 mg/L＞k 50 mg/L＞k 25 mg/L，k 20.10% MC＞k 16.29% MC，表明DON随着臭氧质量浓度、水分含量的升高而出现不断降低的趋势，与本实验研究结果一致。同时，方程中的初始含量c （A，0）和实际反应中的初始含量有着较好的匹配度，说明这个模型对DON的降解有着一定的指导作用。
2.3 DON臭氧降解产物推测
2.3.1 降解产物色谱图
图4 未处理标准品（a）与处理5 min后样品（b）色谱图
Fig.4 Chromatograms of non-treated standard （a） and 5-min treated sample （b）
从图4可以看出，DON在5 min内被迅速降解。随着处理时间的延长，DON的降解率也随着提高，处理5 min后DON降解率达到了88%。在未处理样品色谱图中，只有DON一个单峰存在；用臭氧处理不同时间后，各个色谱图中出现了多个峰。由此可知，DON在降解的同时，产生了不同的降解产物。从图4可以观察到A、B、C、D和E 5种主要降解产物。
2.3.2 产物结构分析
臭氧与DON的主要作用方式符合Criegee机制 ［32-33］。根据Criegee机制，DON中的C9-C10双键会被臭氧打开，形成环加成反应，加入3个氧原子，初步形成不稳定的分子臭氧化物，最终分解成含有醛酮基团的羰基化合物降解产物结构的分析主要利用了MassFragment软件。以降解产物B的推测为例，它在质谱图中它的基准峰是m/z 329.205 4［M+H］ +，与此同时还有一系列的特征离子碎片产（图5c）。主要特征离子碎片有m/z 311.192 2［MH 2O］ +，283.190 4［M-CH 2O 2］ +，265.175 7［M-CH 2O 3］ +，249.224 3［M-C 2H 4O 3］ +，227.235 9［M-C 3H 4O 4］ +等。根据Masslynx软件中的“Elemental composition”功能，能得到相应碎片可能的分子式组成。因为整个反应过程是在纯水系统中进行，只会存在C、H及O三种元素，结合DON的原本结构，就可推测产物B的结构，再将B的结构导入MassFragment软件。MassFragment会从各种可能性打断B的结构，分析得到最有可能的各个离子碎片结构（图6c）。图5列出了DON及产物的质谱图，图6推测了DON及其主要产物在Q-TOF MS中主要离子碎片的生成途径；此外，由于产物C与D具有相同的离子质量碎片图谱，推测它们可能是由于空间位置不同而形成的同分异构体。最终得到的A～E 5 种产物的分子式分别为C 15H 20O 9、C 15H 20O 8、C 15H 20O 7（C和D）和C 14H 18O 10，m/z分别为344.948 1、329.205 0、311.191 8、311.190 7和346.240 4。
图5 DON与降解产物质谱图
Fig.5 Mass spectra of DON and degradation products
a. DON；b.产物A；c.产物B；d.产物C和D；e.产物E。
图6 DON与降解产物离子碎片生成途径
Fig.6 Ion fragmentation pathways of DON and degradation products
臭氧质量浓度、物料形态、处理时间以及物料水分含量是影响臭氧降解DON效果的关键因素。全麦粉中的DON降解率明显高于小麦籽粒。在实验范围内，臭氧质量浓度越高、处理时间延长，水分含量的升高都会促进DON的降解，而不同初始DON含量的样品降解率没有显著变化。当全麦粉的水分含量由11.79%增加到20.10%时，DON的最大降解率从47.42%上升到了78.55%，DON含量由3.89 mg/kg降为了0.83 mg/kg，低于国标
［34］（GB 2761—2011《食品中真菌毒素限量》）限量1.0 mg/kg。建立的一级动力学模型具有良好的拟合度，动力学常数
，与实验结果一致。该模型的建立可以对臭氧的实际应用提供一定的理论指导。由于DON结构双键被臭氧破坏，根据结构活性关系推测，产物的毒性应比DON弱；5 种主要产物结构的推测能对降解产物的安全性评价提供一定的帮助。另外，臭氧降解小麦中DON后的动物实验等安全性评价仍需要更进一步的研究。
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Efficacy of Deoxynivalenol Detoxification by Ozone Treatment in Wheat and Prediction of Degradation Products
WANG Li， LUO Yingpeng， LUO Xiaohu， WANG Ren， LI Yongfu， LI Yanan， SHAO Huili， CHEN Zhengxing*
（School of Food Science and Technology， National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，State Key Laboratory of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）
Abstract：In this study， we used ozone to reduce deoxynivalenol （DON） in contaminated wheat， and the ozonation products were deduced using ultra performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry（UPLC Q-TOF MS）. The results showed that DON content in whole wheat flour decreased more quickly than in wheat kernels. For wheat with a moisture content of 20.10%， DON content was reduced from 3.89 mg/kg to 0.83 mg/kg after 100 mg/L ozone treatment for 60 min. The kinetic model constants with different ozone concentrations showed the decreasing order of k 100 mg/L＞k 75 mg/L＞k 50 mg/L＞k 25 mg/L， which was consistent with the experimental results. According to the mass spectral and ion fragmentation information from UPLC Q-TOF， possible ozonation products were proposed. The m/z of the major products were 344.948 1， 329.205 0， 311.191 8， 311.190 7 and 346.240 4， respectively.
Key words：deoxynivalenol； ozone； kinetic； degradation products
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201618027
中图分类号：TS210
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）18-0164-07
引文格式：
王莉， 罗颖鹏， 罗小虎， 等. 臭氧降解污染小麦中呕吐毒素的效果及降解产物推测［J］. 食品科学， 2016， 37（18）: 164-170. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618027. http://www.spkx.net.cn
WANG Li， LUO Yingpeng， LUO Xiaohu， et al. Efficacy of deoxynivalenol detoxification by ozone treatment in wheat and prediction of degradation products［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 164-170. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201618027. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-03-03
基金项目：公益性行业（粮食）科研专项（201313005）；公益性行业（农业）科研专项（201203037）；
国家自然科学基金面上项目（31371874；31471616）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31101383；31201381；31501579）；江苏省博士后基金项目（1501078B）；国家国际科技合作专项（2015DFA30540）
作者简介：王莉（1981—），女，副教授，博士，研究方向为粮食精深加工。E-mail：legend0318@hotmail.com
*通信作者：陈正行（1960—），男，教授，博士，研究方向为粮食精深加工。E-mail：zxchen2007@126.com