韩云云 1，宋方圆 2，韩艳文 1，李 玲 3，4，闫师杰 3，4，*
（1.天津农学院园艺园林学院，天津 300384；2.新疆农垦科学院农产品加工研究所，新疆 石河子 832000；3.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384；4.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384）
摘 要：以河北鸭梨为试材，通过测定鸭梨果实呼吸强度、乙烯释放量、果心褐变指数等生理指标变化及不同部位脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）基因表达特性和LOX活性变化，研究了两种降温条件下不同采收成熟度鸭梨LOX基因表达及其与鸭梨果心褐变的关系。结果表明：不同贮藏期果心LOX活性及果心褐变指数顺序均为晚采果＞早采果＞中采果，急速降温果＞缓慢降温果；贮藏期间，鸭梨果心LOX基因表达量呈现先缓慢上升后下降，贮藏末期又上升的变化趋势；急速降温鸭梨LOX基因表达量大于缓慢降温果，中采果LOX基因表达量小于早采及晚采果。中采结合缓慢降温抑制了鸭梨果肉及果心部位LOX基因表达，进而减少了果心褐变的发生；LOX基因的表达与LOX活性及鸭梨褐变指数变化趋势一致，说明该基因与鸭梨褐变关系密切。
关键词：鸭梨；脂氧合酶；果心褐变；基因表达；褐变指数
鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv. Yali）集中产于河北南部、山东西北部、辽宁西部等地，是中国梨中最驰名品种之一。2014年，河北地区鸭梨产量为409.6万 t，占全国梨总产量的25.8%；其中鸭梨种植面积占河北省梨树总种植面积的78% ［1］，为果农创收做出了巨大贡献。鸭梨在贮藏早期及后期极易发生果心褐变，极大地影响着鸭梨的经济价值；因此提高鸭梨贮藏期间综合品质，解决早期及晚期黑心病的发生已成为迫在眉睫的问题。鸭梨果心褐变是采后贮藏中发生的一种生理紊乱现象，与多种酶、酚类、乙烯、膜变化等都有着密切的关系 ［2］。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）在植物中普遍存在 ［3］，由多基因家族编码而成。其参与了多种代谢活动，过程中产生了活性氧、氧自由基、氢过氧化物等对细胞膜有破坏作用的物质；同时LOX途径产生的氢过氧化物和超氧自由基等物质还参与了乙烯的生成 ［4-8］。在苹果 ［9-10］、番茄 ［11］和猕猴桃 ［12］的已有研究中，从多角度证实了LOX基因家族在果实的成熟衰老过程中发挥着重要作用，但从分子角度揭示鸭梨果实中LOX途径与褐变关系的研究却鲜有报道。本实验对鸭梨组织LOX基因的cDNA进行了测序和克隆，并通过半定量反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）对各贮藏时期不同处理的鸭梨果肉及果心部位的LOX基因表达量进行了分析，以研究两种降温方法处理的不同成熟度鸭梨的呼吸强度、乙烯释放量、LOX活性及基因表达量，以进一步鸭梨褐变与LOX基因之间的关系，为通过基因工程的方法抑制鸭梨褐变提供理论依据。
1.1 材料与试剂
实验材料为河北藁城鸭梨，分别于2014年9月6日（早采）、9月16日（中采）和9月26日（晚采）采摘；采摘后挑选批次内成熟度和大小一致、无明显机械伤的鸭梨果，加装网套并装箱后运至天津农学院冷库。
M-MLV逆转录酶 北京鑫泽天佑生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Z323K高速冷冻离心机 德国Hermle公司；IMS-30制冰机 河南兄弟仪器设备有限公司；Forma-86C ULT-80 ℃超低温冰箱、Biomate 3S核酸蛋白测定仪美国Thermo公司；VORTEX-GENIE2漩涡混匀器 美国Scientific Industries公司；T100型PCR仪、164-5070电泳仪美国Bio-Rad公司；Tanon2500凝胶成像系统 上海天能公司。
1.3 方法
1.3.1 材料处理
急降温处理果直接放入（0±1）℃冷库中贮藏；缓降温处理果于12 ℃预冷，每5 d降2 ℃，共30 d降至0 ℃。贮藏期间，每20 d测定相关生理指标并取样；每次随机选取40 个果实，削皮，沿果实赤道处切开，将果肉和果心切块，经液氮速冻置于-80 ℃低温冰箱中保存。
1.3.2 呼吸强度的测定
呼吸强度的测定参考闫师杰等 ［13］的方法。
1.3.3 乙烯释放量的测定
随机选取18 个果作为乙烯定果。将定果置于直径25 cm、高50 cm的标本缸中，密闭2 h，从顶部用注射器抽取20 mL气体，每个处理重复3 次，用气相色谱仪测定。乙烯样品进样量为1 mL；色谱柱为Porapak 80-100不锈钢填充柱（2 m×3 mm）；检测器为氢火焰离子检测器，载气为N 2；进样口温度120 ℃，柱温箱温度60 ℃，检测器温度150 ℃。乙烯释放量以μL/（kg·h）表示。
1.3.4 果心褐变指数的测定
果心褐变指数的测定参考Yan Shijie等 ［14］的方法。
1.3.5 LOX活性的测定
底物配制：参考罗云波等 ［15］的方法；LOX抽提液配制：50 mmol/L pH 6.8的磷酸缓冲液，加1% TritonX-100和1% PVP。酶液制备及活性测定参照闫师杰等 ［13］方法。酶活性用每分钟反应体系在波长234 nm处吸光度变化0.01所需的酶量表示。
1.3.6 鸭梨LOX基因的扩增及其半定量RT-PCR分析
将-80 ℃保存的鸭梨果肉及果心样品取出，在液氮中研磨成粉末状，参照改良的CTAB法 ［16-17］提取不同部位总RNA。使用Thermo核酸蛋白测定仪测定波长260 nm和280 nm处RNA吸光度，检测总RNA纯度；经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。以Oligo（dT） 18为引物，利用不同贮藏期各处理样品的总RNA进行反转录，参照M-MLV逆转录酶说明合成cDNA第一链。
根据GenBank上登录的蔷薇科植物肌动蛋白（Actin）基因保守序列设计了一对跨内含子引物Actin l、2；依据已知的高等植物的LOX基因保守区序列，进行BLASTX比对分析，使用Primer 5.0等生物学软件设计一对LOX基因的简并引物，交由上海生工生物技术公司合成。引物序列如下：Actin1：5’-CAGTGGTCGTACAACTGGTAT-3’；Actin2：5’-AGGTAGCTCATAGCTCTTCTC-3’。LOXF：5’-CCGATTTACAAACTTCTGC-3’；LOXR：5’-ATCCTTAACTGCCACTCCT-3’。
每个样品吸取2.0 μL的反转录液（cDNA）作为模板，用引物分别进行LOX基因及Actin基因的PCR扩增。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min后，94 ℃变性45 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延长2 min，循环35 次（Actin基因的PCR扩增循环30 次），最后72 ℃延伸10 min。分别取5 μL扩增产物于含溴化乙锭1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用成像系统自带软件进行成像和荧光密度扫描分析。将PCR扩增产物交由上海生工生物技术公司测序，并通过BLAST分别比对鸭梨Actin及LOX基因与其他植物同源性。
1.4 数据处理
用Excel 2010进行数据统计及作图，用DPS 7.05进行方差分析和显著性检验。
2.1 不同降温方法对不同成熟度采后鸭梨果实呼吸强度、乙烯释放量及LOX活性的影响
图1 缓慢降温和急速降温处理对不同采收成熟度鸭梨采后各指标的影响
Fig.1 Effects of slow cooling and rapid cooling on postharvest physiology and biochemistry of Yali pears of different maturities
鸭梨是典型的呼吸跃变型果实，贮藏过程中明显的呼吸强度及乙烯释放量高峰是其成熟和衰老的重要标志 ［18］。由图1可知，采收初期（贮藏0 d），田间热尚未散去，且各成熟度鸭梨衰老程度低，因而其果实呼吸强度高、乙烯释放量少，LOX活性处于较低水平。与急速降温相比，缓降处理果经历了长时间（30 d）的高温度（2～12 ℃）阶段，高环境温度造成了贮藏20、40 d时早采和中采缓降果相对于急降果较高的呼吸强度和乙烯释放量；该阶段各处理果心部位LOX活性缓慢上升，各缓降果活性低于相同成熟度条件下急降果。
随着贮藏时间延长，早采果、中采果及晚采果分别于贮藏80、60 d和40 d出现LOX活性及乙烯、呼吸代谢高峰，果心LOX活性与果实呼吸和乙烯释放高峰出现时间相吻合。整个贮藏期间缓慢降温果的呼吸强度及乙烯释放量变化更为缓和，LOX活性及呼吸、乙烯代谢整体水平低于同期采收急速降温果；相同降温方式下中采果呼吸强度、乙烯释放量及LOX活性峰值较低，且贮藏期间整体处于较低水平。贮藏期间缓慢降温果呼吸、乙烯及LOX代谢水平较低，可能是由于缓慢降温延缓了温度骤变引起的膜脂过氧化作用 ［19］，并进一步降低了果实生理代谢水平。该结论与李晓丹等 ［20］研究的缓慢降温抑制鸭梨果心及果肉部LOX活性等结论一致。
2.2 不同降温方法对不同成熟度的采后鸭梨果心褐变指数的影响
图2 两种降温方式对不同成熟度鸭梨采后果心褐变的影响
Fig.2 Effects of two cooling methods on postharvest core browning index of Yali pears of different maturities
如图2所示，早采果、中采果和晚采果分别于贮藏40、20 d和20 d开始出现果心褐变。随着贮藏时间的延长，鸭梨果心褐变指数呈现不同程度的增长趋势。其中，中采果褐变指数增长趋势最为缓和，早采次之，晚采果增长趋势最明显。同一贮藏期，相同降温方式下各采收期褐变指数大小为晚采果＞早采果＞中采果、同采收期褐变指数急速降温果＞缓慢降温果。贮藏期结束，急速降温处理（缓慢降温处理）的早采果、中采果和晚采果的褐变指数分别达到0.6（0.312）、0.367（0.319）、0.667（0.9），早期采收及中期采收结合缓慢降温处理褐变指数显著低于其他处理（P＜0.05）。闫师杰 ［21］、何利华 ［22］及王志华 ［23］等的研究均证实，适宜成熟度采收结合缓慢降温能有效延缓果实衰老、抑制鸭梨贮藏期间果心褐变的发生。
2.3 鸭梨LOX基因保守序列的扩增及测序
PCR扩增产物经电泳检测分析，在500 bp左右出现一条特异条带，与理论上扩增的片段大小相符，且条带清晰（图3）。图3的PCR产物送上海生工进行测序，测序结果如图4所示，片段长度为473 bp。使用NCBI中BLAST程序对该核酸序列与其他物种的LOX基因进行同源性分析，结果显示：该核酸序列和已经报道的沙梨（登录号：EF215449.1）、苹果（登录号：001294101.1）的LOX基因cDNA序列的一致性分别达到99%、99%。可以确定该核酸序列与其他物种LOX基因具有同源性，本实验扩增得到的片段为鸭梨LOX基因的cDNA片段。图5为目的序列与沙梨、苹果LOX基因cDNA序列的比对结果。
图3 鸭梨LOX基因RT-PCR产物图
Fig.3 The Yali pear product of RT-PCR
图4 鸭梨cDNA序列及推测的氨基酸序列
Fig.4 The nucleotide sequence of LOX and the deduced amino acid sequence of Yali pear
图5 目的片段与沙梨及苹果LOX基因BLAST比对
Fig.5 Alignment between the query and the LOX gene of Pyrus pyrifolia and Malus
2.4 不同降温方法对不同成熟度鸭梨果实中LOX基因表达量的半定量分析
2.4.1 内参基因Actin的PCR扩增及测序结果分析
以鸭梨总RNA为模板，反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行Actin基因的PCR扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增出的特异性片段大小为297 bp，与预期大小相符（图6）。
图6 鸭梨Actin基因的RT-PCR
Fig.6 RT-PCR product of actin of Yali pear
图7 鸭梨Actin cDNA核苷酸序列
Fig.7 Nueleotide sequence of Actin cDNA of Yali pear
将图6中的PCR产物送样测序，测序结果见图7。之后根据NCBI中BLAST比对核苷酸序列，结果表明克隆所得序列与蔷薇属（Rosa hybrid）、梨属（Pyrus bretschneideri）、葡萄（Vitis vinifera）的碱基序列同源性达87%，与李属（Prunus salicina）、苹果（Malus domestica）的碱基相似性高达88%以上。而与杨树（Populus tomentosa）、大豆（Glycine max）、柳树（Salix miyabeana）、栗树（Castanea sativa）等的相似性也达86%以上。
2.4.2 鸭梨果实中LOX基因表达量的半定量分析
图8 两种降温方式不同成熟度鸭梨贮藏过程中LOX基因RT-PCR表达量分析
Fig.8 Semi-quantitative RT-PCR analysis of LOX expression in Yali pears of different maturities under two cooling methods during storage
用改良CTAB法提取不同降温方法处理的不同成熟度鸭梨采后0～180 d 10 个采样点的果肉、果心中的总RNA，经过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，总RNA的纯度和完整性达到了图6的结果，然后通过半定量RT-PCR分析LOX基因的表达量差异。如图8所示，对比各贮藏期不同处理果心及果肉部电泳结果，可以得出：鸭梨果肉及果心部LOX基因表达量均呈现先缓慢上升至高峰后逐渐下降、贮藏末期又上升的趋势，与贮藏期间各处理果心部LOX活性变化趋势一致；贮藏期间，中采鸭梨果心LOX基因表达量整体小于早采和晚采鸭梨果心，急速降温鸭梨果心部LOX基因表达量高于缓慢降温鸭梨；各贮藏期内，鸭梨果肉部LOX基因表达量小于果心。
结合图1、2所示的贮藏期间果实生理代谢变化，发现LOX基因的表达模式与LOX活性及鸭梨果心褐变指数变化趋势相一致；贮藏期间，采取不同降温方法的不同成熟度鸭梨果实的LOX活性与乙烯释放量峰值同时出现，鸭梨LOX基因可能是随着乙烯合成产生作用，但对于LOX与乙烯的调控机理与关系，尚未有确切的阐述 ［24-25］。
综合比较2 种降温方式下不同采收成熟度鸭梨生理指标变化可以看出，适宜成熟度采收（中采）结合缓慢降温，在延缓果实各生理指标（呼吸强度、乙烯释放量及果心LOX活性）高峰出现的同时，有效地降低了其贮藏期间生理代谢水平，并进一步减少了果心褐变发生，为鸭梨采后较适宜的抑制果心褐变的处理方法。
通过对鸭梨LOX基因cDNA进行克隆、测序，并与其他植物LOX基因的同源性分析，确定了获得的cDNA为鸭梨LOX基因的cDNA片段，鸭梨LOX基因为LOX基因家族一员。通过对不同贮藏期鸭梨果肉及果心部位LOX活性及鸭梨果心褐变指数变化趋势相一致。LOX基因参与了鸭梨采后贮藏期间果心褐变的发生进程，具体的发生机理仍待进一步研究和确定。
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LOX Gene Expression and Its Relationship with Core Browning of Yali Pear under Different Harvest and Storage Conditions
HAN Yunyun
1， SONG Fangyuan
2， HAN Yanwen
1， LI Ling
3，4， YAN Shijie
3，4，*
（1. College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China；2. Institute of Agricultural Products Processing， Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science， Shihezi 832000， China；3. College of Food Science and Biotechnology， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China；4. Tianjin Engineering and Technology Research Centre of Agricultural Products Processing， Tianjin 300384， China）
Abstract：Hebei-grown Yali pears （Pyrus bretschneideri Rehd cv. Yali） of different maturities were stored at （0 ± 1） ℃directly or after pre-cooling at gradually decreasing temperature. Changes in respiration intensity， ethylene production and core browning index and lipoxygenase （LOX） activity and LOX gene expression pattern during storage were determined and the relationship of LOX gene expression with core browning was studied as well. The results showed that during storage，the decreasing order of LOX activity and core-browning index was as follows: late-harvested fruit ＞ early-harvested fruit ＞middle-harvested fruit， as well as rapid-cooling fruit ＞ slow-cooling fruit. The expression level of LOX gene in core tissues initially increased slowly， then declined， and increased again until the end of storage. The expression level of LOX gene in rapid-cooling fruits was higher than in slow-cooling fruits， and the expression level of LOX gene in middle maturity fruits was lower than in fruits of early and late maturities. Middle-maturity harvest combined with slow pre-cooling inhibited the LOX gene expression of flesh and core tissues， thereby suppressing core browning of Yali pears. LOX activity and the gene expression level of LOX were coordinated with core browning index， suggesting that the expression level of this gene was correlated closely with core browning of Yali pears.
Key words：Yali pear； lipoxygenase； core browning； gene expression； core browning index
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201618035
中图分类号：S609.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）18-0216-07
引文格式：
韩云云， 宋方圆， 韩艳文， 等. 不同采收贮藏条件下鸭梨果实LOX基因表达及其与果心褐变的关系［J］. 食品科学， 2016，37（18）: 216-222. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618035. http://www.spkx.net.cn
HAN Yunyun， SONG Fangyuan， HAN Yanwen， et al. LOX gene expression and its relationship with core browning of Yali pear under different harvest and storage conditions［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 216-222. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618035. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-03-08
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31471630）
作者简介：韩云云（1989—），女，硕士研究生，研究方向为果蔬贮藏保鲜。E-mail：1461871540@qq.com
*通信作者：闫师杰（1971—），男，教授，博士，研究方向为农产品加工与贮藏、食品质量与安全。E-mail：yanshijie@126.com