离子色谱法研究多聚磷酸盐在肌肉中的动态水解变化

（南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏南京 210095）

摘要：采用免试剂离子色谱法同时检测焦磷酸四钠（tetrasodium pyrophosphate，TSPP）、三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，STPP）和混合磷酸盐（m（TSPP）∶m（STPP）∶m（六偏磷酸钠）=3∶4∶3）在猪背最长肌、鱼背侧肌以及鸡胸大肌中的水解情况。结果表明，多聚磷酸盐在肌肉中的水解情况存在着差异。单一的TSPP在鸡胸大肌中的水解速率最快，TSPP在猪背最长肌中水解量比在鱼背侧肌中多。将STPP或混合磷酸盐加入到肌肉中，均在猪背最长肌中的水解速率最快，在鸡胸大肌中次之，在鱼背侧肌中最慢。本研究探索多聚磷酸盐在不同物种肌肉中的动态变化，为调控多聚磷酸盐的水解进程，指导多聚磷酸盐在不同物种肌肉中的合理添加提供了理论依据。

多聚磷酸盐是畜禽肉制品及水产品加工过程中常用的添加剂，工业中常用的主要有焦磷酸盐（pyrophosphate，PP）、三聚磷酸盐（tripolyphosphate，TPP）、六偏磷酸盐（hexametaphosphate，HMP）及其混合物［1-3］。目前国内外对于肉制品中多聚磷酸盐的测定方法主要分为传统检测方法（钼酸铵分光光度法［4］和薄层层析法［5］等）、核磁共振技术［6-7］和离子色谱技术［8-9］。传统检测方法不能区分多聚磷酸盐的种类，无法对各种磷酸盐含量准确定量，有一定的局限性。核磁共振技术虽然可以无损检测各种多聚磷酸盐，但是核磁共振设备价格昂贵，测定样品前需确定弛豫时间，耗时较长。离子色谱技术具有快速、简便、准确度高等优点。Rulliere等［10］在研究乳制品中的多聚磷酸盐时提出在复杂的环境中，离子色谱比核磁共振更适合分析多聚磷酸盐组分。王丽等［11］建立了一种利用离子色谱检测水产品及其制品中的多聚磷酸盐的方法，精密度在1%以内。沈涛等［12］建立了一种离子色谱样品前处理的方法测定肉制品中多聚磷酸盐，操作简单、灵敏度高，适用于日常生活中肉制品的检测分析。

已有研究表明，添加到肌肉中的多聚磷酸盐可以在肌肉内源酶作用下发生水解［13-14］，并且在不同物种中的水解速率存在较大差异。Sutton ［15］利用P 32标记法研究TPP在鳕鱼和牛肉中的水解规律时发现，在牛肉中PP的水解比鳕鱼慢。彭增起［16］利用 31P核磁共振研究焦磷酸四钠（tetrasodium pyrophosphate，TSPP）、三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，STPP）和六偏磷酸钠（sodium hexametaphosphate，SHMP）分别添加在鸡胸肉、猪背最长肌和牛背最长肌中的水解变化时发现，TSPP在加入鸡胸肉中10 h内被完全水解，在牛背最长肌中的水解最慢。添加到鸡胸肉中的STPP在10 h内已经完全降解，快于在牛背最长肌中的水解。然而，同时分析单一磷酸盐及混合磷酸盐在不同肌肉中水解差异的研究鲜见报道。

本研究采用离子色谱法同时检测TSPP、STPP和混合磷酸盐在畜（猪）、禽（鸡）、及水产（鱼）肉中的水解情况，讨论其水解的差异，实现了用离子色谱法监测多聚磷酸盐的动态变化，对多聚磷酸盐在不同物种肌肉中的合理添加、减少残留具有指导意义。

1　材料与方法

宰后约4 h的猪背最长肌、鸡胸大肌购于南京苜蓿园农贸市场，剔除可见的结缔组织和脂肪，4 ℃条件下放置备用。新鲜白鲢购于南京苜蓿园农贸市场，经宰杀后取背侧肌，剔除可见鱼刺，4 ℃放置备用。

正磷酸钠（sodium phosphate，Pi）、TSPP、STPP、SHMP 美国Sigma公司；氯化钠、三氟乙酸、氢氧化钠均为国产分析纯。实验所用水均为超纯水。

ICS-2000型离子色谱仪（配电导检测器、KOH淋洗液罐、AS40自动进样器、Chromeleon色谱工作站）美国D i o n e x公司；8 0 1 0 E S高速组织匀浆机美国Waring公司；pH 211台式酸度计意大利HANNA公司；HH-8数显恒温搅拌循环水箱国华电器有限公司；AvantiJ-E高速离心机美国Beckman Coulter公司；T25 Ultra Turrax分散机德国IKA公司；KQ 2200DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；0.45 μm水相过微孔滤膜天津市东康科技有限公司。

色谱条件参照文献［17］中方法。Dionex IonPac AS11-HC（4 mm×250 mm）分离柱，IonPac AG11-HC（4 mm×50 mm）保护柱，淋洗液自动发生装置在线产生如表1所示的梯度淋洗液。ASRS ULTRA Ⅱ阴离子抑制器，抑制器电流为250 mA，柱温30 ℃，淋洗液流速为1.0 mL/min，进样体积为25 μL。数据采集速率为5.0 Hz，柱压最低值设为200 psi，最高值设为3 000 psi。

表1　KOH溶液梯度淋洗条件
Table1　Potassium hydroxide concentrations for gradient elution

时间/min0515182025 KOH淋洗液浓度/（mmol/L）252599992525

用分析天平分别准确称取1.00 g的Pi、TSPP、STPP和SHMP，配制为1.00 g/L的Pi、TSPP、STPP和SHMP的混合溶液，用超纯水定容配制成Pi、TSPP、STPP和SHMP的质量浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 g/L的混合标准溶液，将溶液注射至离子色谱进样分析。以待测物的峰面积y（μS·min）对质量浓度x（g/L）做标准曲线。

分别配制30 g/L的TSPP、STPP和磷酸盐混合物溶液，其中磷酸盐混合物溶液中TSPP、STPP和SHMP的质量浓度分别为9、12、9 g/L，配制溶液所有用水均为超纯水。磷酸盐溶液置于4 ℃冰箱贮存，当日使用。

参照沈涛等［12］方法并加以修改。分别取猪背最长肌、鸡胸大肌和鱼背侧肌各150 g，切成约1 cm 3大小的肉丁，用组织捣碎机绞碎，每种肉分为12 个实验组，每组随机取10 g，分别加入5 mL磷酸盐溶液（TSPP、STPP、磷酸盐混合物），根据预实验确定25 ℃水浴反应时间：猪背最长肌+TSPP处理组和鱼背侧肌+TSPP处理组反应时间为0、0.8、2 h和10 h；鸡胸大肌+TSPP处理组反应时间为0、0.1、0.4 h和0.8 h；猪背最长肌+STPP处理组、猪背最长肌+磷酸盐混合物处理组、鱼背侧肌+ STPP处理组、鱼背侧肌+磷酸盐混合物处理组、鸡胸大肌+STPP处理组和鸡胸大肌+磷酸盐混合物处理组反应时间均为0、3.5、8 h和24 h。加入5 mL 20 g/100 mL 三氟乙酸溶液终止反应［18］，用分散机在12 000 r/min条件下分散30 s，每次10 s，中间停10 s。超声波萃取20 min后，放入冰箱4 ℃静置30 min。在4 ℃、10 000 r/min离心30 min，取1 mL上清稀释50 倍，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调至pH＞8，过0.45 μm的微孔滤膜过滤器，离子色谱仪测定。

实验重复3 次，每个重复测定3 次。采用Origin 8.0软件分析作图。

2　结果与分析

图1 4 种磷酸盐标准溶液的离子色谱图
Fig.1　Chromatograms of mixture standard solutions of Pi， TSPP，STPP and SHMP

图1　为0.20 g/L的Pi、TSPP、STPP及SHMP的磷酸盐标准溶液的离子色谱图，Pi、TSPP、STPP和SHMP分离效果较好。但是SHMP属于缩聚磷酸盐，含有90%以上的高分子链状聚磷酸盐、少量的小分子偏磷酸盐以及网状结构磷酸盐。在离子色谱图谱上可以观察到SHMP有很多峰的存在，并且各峰峰面积较小，没有主峰，峰形较复杂。另外，SHMP不被肉中的内源酶水解［19-20］，在肉中较稳定，不容易生成PP ［21］等，因此本实验未给出其线性关系，且在结果分析中并不分析讨论SHMP。

由Pi、TSPP和STPP的线性实验结果表明，混合标准液中Pi、TSPP和STPP溶液的质量浓度（x）范围在0.05～0.50 g/L时与峰面积（y，μS·min）均呈线性关系，R 2均大于99.9%，线性相关系数和线性方程见表2。

表2　混合磷酸盐标准溶液的线性方程
Table2　Linear regression equations with correlation coefficients for phosphate analysis

磷酸盐相关系数（R 2）/%线性方程Pi99.91y=103.30x-2.971 9 TSPP99.92y=141.81x-3.341 2 STPP99.94y=152.72x-3.964 1

图2　TSPP在肌肉中水解的动态变化
Fig.2　Dynamic hydrolysis of TSPP in muscle

A. 猪背最长肌；B. 鱼背侧肌；C. 鸡胸大肌。下同。

由图2A可知，在猪背最长肌+TSPP处理组中，TSPP的质量浓度在2 h内随着时间的延长呈下降趋势，在0.8 h内的水解速率为0.013 3 g/（L·h），在2 h时，TSPP仍有0.082 6 g/L的剩余，而在10 h时TSPP的质量浓度低于检测限（TSPP的含量低于0.05 g/L）。Pi的质量浓度随着时间的延长持续增加。

由图2B可知，在鱼背侧肌+TSPP处理组中，TSPP的质量浓度随着时间的延长不断降低，在0.8 h内的水解速率为0.022 9 g/（L·h）。PP与Pi的质量浓度在2～10 h内几乎没有变化，表明TSPP在2 h时已经水解结束。

由图2C可知，在鸡胸大肌+TSPP处理组中，0.1 h内TSPP的水解速率最快，在0.1～0.4 h期间水解速率有所下降，在0.4 h内的水解速率为0.092 5 g/（L·h），在0.4～0.8 h期间，TSPP的水解速率继续下降，在0.8 h内的水解速率为0.051 2 g/（L·h）。Pi的质量浓度随着时间延长不断增加。

由上述实验结果可知，TSPP在肌肉中的水解情况存在差异。TSPP在鸡胸大肌中水解最快，在鱼背侧肌和猪背最长肌中水解较慢，这与彭增起［16］研究中TSPP在鸡胸肉中的水解速率比在猪背最长肌中快的结论一致。另外，从TSPP水解结束后Pi的质量浓度（图2）可以得出，TSPP在相同质量的不同物种肌肉中水解量也存在差异，其中TSPP在猪背最长肌中水解量最多，鸡胸大肌次之，鱼背侧肌最少。这可能是由于不同物种肌肉中的多聚磷酸酶的含量及活性存在差异［22］。在此条件下，猪背最长肌中的焦磷酸酶（pyrophoshatase，PPase）活性可能低于鸡胸大肌中的PPase。

图3　STPP在肌肉中水解的动态变化
Fig.3　Dynamic hydrolysis of STPP in muscle

由图3A可知，STPP在猪背最长肌中水解很快，在3.5 h时已经低于检测限，而在3.5 h内，随着反应时间的延长，STPP的含量降低，PP和Pi的含量均增加，表明STPP可以转化为TSPP和Pi；此外，处理组内的Pi的质量浓度在8 h和24 h时变化不大。这表明STPP在猪背最长肌中8 h内就能被水解完全。

由图3B可知，在鱼背侧肌+STPP处理组中，STPP的质量浓度随着时间延长不断降低，而Pi的质量浓度不断增高。PP的质量浓度在0、3.5 h及8 h时均低于检测限，在24 h时，PP的含量高于0.05 g/L，这是由于STPP继续水解生成的PP不能再发生酶促水解，因此，STPP在8 h内没有反应完全，其水解速率为0.005 9 g/（L·h）。

由图3C可知，在鸡胸大肌+STPP处理组中，STPP的质量浓度随着时间延长不断降低，在8 h内的水解速率为0.008 5 g/（L·h），而在24 h时低于检测限。PP的质量浓度一直低于检测限，Pi的质量浓度随着时间延长不断增加，在24 h时达到0.214 2 g/L，与STPP猪背最长肌中水解完毕时生成的Pi质量浓度一致（0.214 0 g/L），表明STPP在24 h内反应完毕。

综合上述实验结果可知，STPP在猪背最长肌中的水解速率最快，8 h内水解完毕，STPP在鸡胸大肌中24 h才水解完成，这与彭增起［16］研究中STPP在猪背最长肌中的水解速率比在鸡胸肉中快的结论一致。同时也表明，在此条件下，猪背最长肌中的三聚磷酸酶（tripolyphosphatase，TPPase）的活性高于鸡胸大肌中TPPase的活性。而STPP在鱼背侧肌中8 h内的水解速率（0.005 9 g/（L·h））比在鸡胸大肌中（0.008 5 g/（L·h））低，表明STPP在鱼背侧肌中的水解速率最慢。另外，猪背最长肌+STPP和鸡胸大肌+ STPP处理组水解结束时，PP的质量浓度均低于检测限，而在鱼背侧肌+STPP处理组中，PP在24 h仍有0.059 5 g/L剩余，表明PP在鱼背侧肌中水解量比在猪背最长肌和鸡胸大肌中少，与2.2节中的结论一致。

图4　混合磷酸盐在肌肉中水解的动态变化
Fig.4　Dynamic hydrolysis of polyphosphate compounds in muscle

由图4A可知，混合磷酸盐在猪背最长肌中水解较快，在8 h和24 h时PP和STPP的含量均低于检测限，Pi的质量浓度也基本保持一致，这说明混合磷酸盐在8 h时已经水解完毕，这与单一的STPP在猪背最长肌中的水解情况相同。

由图4B可知，在鱼背侧肌+混合磷酸盐处理组中，STPP在3.5 h时的质量浓度为0.055 2 g/L，在8 h和24 h均低于检测限。PP的质量浓度在0～3.5 h时从0.064 8 g/L降至0.062 4 g/L，表明PP的生成速率慢于其水解速率。而与3.5 h相比，8 h时PP的质量浓度升高（0.063 5 g/L），表明PP不再发生酶促水解进而被累积。在24 h时，PP的质量浓度再次下降至0.054 9 g/L，这可能是由于PP发生了非酶促水解［23-24］。另外，在鱼背侧肌+混合磷酸盐处理组，STPP的水解速率为0.003 5 g/（L·h），慢于单一添加STPP（0.005 9 g/（L·h）），与Liu Wei等［25］在研究多聚磷酸盐在鳙鱼多聚磷酸酶中的水解结果一致。这是由于混合磷酸盐中的TSPP抑制了STPP的水解［26-27］。

由图4C可知，在鸡胸大肌+混合磷酸盐处理组中，STPP的质量浓度在3.5、8 h和24 h时均低于检测限，PP的质量浓度随时间的延长不断减少，在24 h时其质量浓度也低于检测限；而Pi的质量浓度随时间的延长不断增加，在24 h时Pi的质量浓度与猪背最长肌+混合磷酸盐处理组中反应完全时Pi的质量浓度一致，说明了鸡胸大肌+混合磷酸盐处理组中混合磷酸盐在24 h时反应完全，这与鸡胸大肌+STPP处理组中的水解情况相同。

由混合磷酸盐在猪背最长肌、鱼背侧肌和鸡胸大肌中水解实验结果可知，混合磷酸盐在猪背最长肌中8 h内水解完毕，水解速率最快。混合磷酸盐在鸡胸大肌中24 h内水解完毕，其中STPP在3.5 h内反应速率高于0.004 3 g/（L·h）（以8 h时STPP的质量浓度为0.05 g/L计算）。而在鱼背侧肌+混合磷酸盐中处理组中，STPP在3.5 h内反应速率为0.003 4 g/（L·h），PP在24 h内反应的量也最少（24 h时PP的质量浓度为0.054 9 g/L），表明混合磷酸盐在鱼背侧肌中水解最慢。因此，在白鲢鱼背侧肌中TSPP或STPP的添加量要少于在猪背最长肌和鸡胸大肌中，以免TSPP或STPP大量残留。在猪背最长肌和鸡胸大肌中，可以通过抑制猪背最长肌和鸡胸大肌中多聚磷酸盐的酶活性，使混合磷酸盐的水解速率变慢，提高多聚磷酸盐的作用效果。此外，由于鸡胸大肌PPase活性高于猪背最长肌PPase，TPPase活性低于猪背最长肌TPPase，因此，在鸡胸大肌中添加相同质量的混合磷酸盐时，其中的TSPP/STPP应该比在猪背最长肌中小。

3　结论

多聚磷酸钠在不同物种肌肉中的水解情况存在着差异。将单一的TSPP加入到肌肉中，TSPP在鸡胸大肌处理组中的水解速率最快，在猪背最长肌中的水解量比在鱼背侧肌中多。STPP在猪背最长肌+STPP处理组中水解速率最快，而鱼背侧肌+STPP处理组中STPP的水解速率最慢。将混合磷酸盐（m（TSPP）∶m（STPP）∶m（SHMP）=3∶4∶3）加入到肌肉中，混合磷酸盐在猪背最长肌中仍水解最快，其次是在鸡胸大肌处理组中，在鱼背侧肌+混合磷酸盐处理组中最慢，混合磷酸盐在鱼背侧肌中反应的量也最少。利用离子色谱法分析并理解多聚磷酸盐在不同肌肉中的动态水解变化，可以有针对性地调控多聚磷酸盐在不同肌肉中的水解进程，通过添加少量的多聚磷酸盐使产品获得较高的品质，降低肉制品中的残留量。

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Ion Chromatography Studies of Dynamic Hydrolysis of Added Polyphosphates in Muscle

XU Meng， LIU Wei， ZHOU Li， MA Zhifang， PENG Zengqi*
（National Center of Meat Quality and Safety Control， College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract：Polyphosphates are commonly used in meat processing as food additives. Once added into meat， they are hydrolyzed continuously by endogenous polyphosphatases present in meat. In this study， ion chromatography was used to detect the hydrolysis process of added tetrasodium pyrophosphate （TSPP）， sodium tripolyphosphate （STPP） and composite polyphosphate （m （TSPP） : m （STPP）: m （sodium hexametaphosphate） = 3:4:3） in pork longissimus dorsi， fi sh dorsal muscle and chicken breast muscle. Inconsistent results were obtained for the hydrolysis of added polyphosphates in muscle from different animal species. The hydrolysis rate of TSPP in chicken breast muscle was the highest， and TSPP was hydrolyzed completely within 0.8 h. More TSPP in pork longissimus dorsi was hydrolyzed than in fi sh dorsal muscle. In addition， STPP and composite polyphosphate were hydrolyzed fastest upon addition of either of them to pork longissimus dorsi， followed by addition to chicken breast muscle， and the slowest hydrolysis rate was observed upon addition to fi sh dorsal muscle. This study can provide the theoretical basis for regulating the hydrolysis process of polyphosphates and accordingly provide a guide to the reasonable addition of polyphosphates into muscle from different species.

Key words：polyphosphate； ion chromatography； muscle； hydrolysis； different species

徐萌，刘玮，周黎，等. 离子色谱法研究多聚磷酸盐在肌肉中的动态水解变化［J］. 食品科学， 2016， 37（19）： 36-41. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619006. http：//www.spkx.net.cn

XU Meng， LIU Wei， ZHOU Li， et al. Ion chromatography studies of dynamic hydrolysis of added polyphosphates in muscle［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 36-41. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619006. http：//www.spkx.net.cn

作者简介：徐萌（1991—），女，硕士研究生，研究方向为肉制品加工与质量控制。E-mail：2013108018@njau.edu.cn

*通信作者：彭增起（1956—），男，教授，博士，研究方向为畜产品加工与质量控制。E-mail：zqpeng@njau.edu.cn

离子色谱法研究多聚磷酸盐在肌肉中的动态水解变化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　结论