新疆传统发酵酸驼乳优势菌种短乳杆菌高密度培养技术

沙吉坦穆·克依斯尔，古丽皮艳·托乎提，努丽艳·阿不都米力克，日孜万古力·艾山，努尔古丽·热合曼 *

摘要：以分离自传统发酵酸驼乳中的优势菌种短乳杆菌作为材料，通过单因素试验，确定微囊化短乳杆菌的最佳碳源为蔗糖，最适质量浓度为15 g/L；最佳氮源为胰蛋白胨，最适质量浓度为10 g/L；最佳促生长因子为玉米浆，最适体积分数15%；最佳酸碱缓冲剂为CaCO 3，最适质量浓度为5 g/L。在此基础上，采用响应曲面法分析了4 个因子的交互作用及其最佳水平范围，高密度发酵培养的培养基优化配方为：乳清粉60 g/L、蔗糖18 g/L、胰蛋白胨13.02 g/L、玉米浆130 mL/L、CaCO 33.29 g/L。

关键词：传统发酵酸驼乳；短乳杆菌；高密度培养；响应曲面法

酸驼乳（哈萨克语Shubat）是利用新鲜骆驼奶经过传统发酵技术制成的一种乳酸菌饮品 [1]。制作时，只需将新鲜驼奶直接倒入专用的容器“撒巴”，室温放置发酵24～48 h即可。酸驼奶被饮用后再填补等量的新鲜驼奶，期间未进行消毒处理 [2]。传统发酵酸驼乳营养丰富，医疗和药物价值高，且具有抗菌活力 [3-6]。

在新疆有生产驼乳发酵制品需要的价格低廉的丰富原料，然而，由于没有专用的发酵剂，新疆传统的发酵饮料酸驼乳的生产过程基本上停留在自然发酵水平，不仅发酵周期长而且产品质量不稳定，难以保证产品的安全和卫生，并且没有像酸牛奶那样的成熟产品供给市场 [7]。随着人们对高端乳制品需求的增加，使用传统工艺发酵驼乳已不适应现代工业发展的要求，若要实现其工业化生产，必须要研制出安全、高效的专用发酵剂，以保证产品在口感上的统一及质量的安全 [8-9]。

制备高效发酵剂的前提是对乳酸菌进行高密度培养，高密度培养可以为工业化生产提供高密度的菌体 [10-11]。培养基作为菌体生长的介质，与菌体产量存在直接的关系，在高密度培养过程中微生物的培养基具有至关重要的作用 [12-15]，因此优化培养基各物质的浓度是一个重要手段 [16]。

本研究首先采用细胞固定化技术对从酸驼乳中分离纯化的短乳杆菌进行液芯微囊化处理；然后以液芯微胶囊为微反应器，通过单因素试验、响应面法对微囊化短乳杆菌进行培养基优化，达到囊内菌株浓缩培养的目的，以期为进一步发展浓缩型酸驼乳发酵剂提供理论依据。

1 材料与方法

短乳杆菌（Lactobacillus brevis）M3-3，分离自传统发酵酸驼乳，－20 ℃保藏。

MRS培养基 [17]；细胞增殖基础培养基（g/L）：乳清粉60、葡萄糖20、酵母粉20、MgSO 40.28、MnSO 40.18、CaCO 35。

海藻酸钠、壳聚糖、黄原胶（均为食品级）、氯化钙（分析纯）日本新田公司；玉米浆北京索莱宝科技有限公司。

SW-CJ-1FD型超净工作台江苏苏净集团有限公司；LRH-250电热恒温培养箱、JB-1B型磁力搅拌器上海一恒科技有限公司；LDZX-30KBS型高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；2-16P型高速低温离心机美国Sigma公司。

依据文献[18-19]，将甘油保藏的短乳杆菌于MRS液体培养基活化两代后，离心收集菌体，加入少量生理盐水，并置入15 g/L CaCl 2溶液与3 g/L黄原胶溶液的混合液中制成菌悬液。将菌悬液置于无菌10 mL注射针器中，在磁力搅拌条件下慢慢滴入8 g/L海藻酸钠溶液（含1 g/L吐温-80）中，将形成的液芯微胶囊过滤收集并用生理盐水冲洗，将其转移到20 g/L CaCl 2溶液中硬化处理1 h后，用8.5 g/L生理盐水冲洗，在3 g/L壳聚糖溶液中包覆处理30 min，用8.5 g/L生理盐水冲洗，收集微胶囊。

把甘油保藏的菌种接种在10 mL MRS液体培养基中，按体积分数2%接种，于37 ℃条件下培养，传代2 次。菌种活化后，在MRS液体培养基中按体积分数2%的接种量，于37 ℃条件下培养24 h，每隔2 h测定菌液OD 600 nm，以培养时间为横坐标，OD 600 nm为纵坐标绘制短乳杆菌M3-3的生长曲线。

按照文献[20]，细胞增殖基础培养基中分别添加不同的碳源（蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉）、促生长因子（番茄汁、胡萝卜汁、玉米浆）及不同质量浓度（2、5、8、10、15 g/L）的pH值缓冲剂CaCO 3。按1%的接种量接种微囊化短乳杆菌，调节起始pH值至7.0，在37 ℃条件下培养24 h，采用血球计数板进行囊内细胞计数，以确定最佳碳源、氮源、促生长因子和缓冲剂质量浓度。

按照单因素试验的结果，分别以A、B、C、D表示蔗糖质量浓度、胰蛋白胨质量浓度、玉米浆体积分数、CaCO 3质量浓度4 个主要影响因素，采用中心组合旋转设计（central composite rotatable design，CCRD）法，对其交互作用进行进一步研究，试验因素与水平见表1。

表1 CCRD试验因素及水平
Table 1 Factors and levels used in CCRD

因素水平－2－1012 A蔗糖质量浓度/（g/L）912151821 B胰蛋白胨质量浓度/（g/L）26101418 C玉米浆体积分数/%1113151719 D CaCO 3质量浓度/（g/L）13579

依据CCRD试验结果，建立二次多项回归模型方程并对其进行方差分析，对模型的系数进行显著性检验，分析各因素的线性效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值，优化得到适合短乳杆菌M3-3菌体增殖的最佳培养基配方。

2 结果与分析

由图1可知，短乳杆菌进入对数期后，在8 h的OD 600 nm值最高，之后进入稳定期，因此选择培养8 h收获。

由图2可知，以蔗糖为碳源时菌体密度最高，因此，选用蔗糖为最佳碳源。培养过程中微生物的生长会直接受到蔗糖质量浓度的影响 [21]。通过比较不同蔗糖质量浓度条件下菌体的生长情况，结果表明15 g/L为该实验条件下的最适蔗糖质量浓度（图3）。

图2 不同碳源对微囊化短乳杆菌M3-3生长的影响
Fig. 2 Effect of carbon source on the growth of Lactobacillus brevis M3-3

图3 蔗糖质量浓度对短乳杆菌M3-3生长的影响
Fig. 3 Effect of sucrose concentration on the growth of Lactobacillus brevis M3-3M3-3

图4 不同氮源对短乳杆菌M3-3生长的影响Fig. 4 Effect of nitrogen source on the growth of Lactobacillus brevis M3-3M3-3

图5 胰蛋白胨质量浓度对短乳杆菌M3-3生长的影响
Fig. 5 Effect of typtone concentration on the growth of Lactobacillus brevis M3-3M3-3

由图4可知，胰蛋白胨为氮源时，菌体密度高于选用其他氮源的试验组，并确定10 g/L为增殖培养基中胰蛋白胨的最适质量浓度（图5）。

为促进乳酸菌的生长繁殖，可以添加胡萝卜汁、番茄汁、玉米浆等营养物质 [22-23]。向增殖培养基中添加不同体积分数（5%、10%、15%）的玉米浆、胡萝卜汁和番茄汁，在37 ℃条件下培养24 h后，分别测量菌体密度，确定最佳的促生长因子。由图6可知，3 种物质都不同程度地提高了菌体密度，在相同促生长因子体积分数的条件下，培养24 h后，玉米浆试验组菌体密度最高，因此最佳促生长因子选择玉米浆。进一步确定，在相同实验条件下玉米浆的最适体积分数为15%（图7）。

图6 不同促生长因子对短乳杆菌M3-3生长的影响
Fig. 6 Effect of growth-promoting factor on the growth of Lactobacillus brevis M3-3M3-3

图7 玉米浆体积分数对短乳杆菌M3-3生长的影响
Fig. 7 Effect of corn steep liquor concentration of the growth of Lactobacillus brevis M3-3M3-3

图8 CaaCCOO 3质量浓度对短乳杆菌M3-3生长的影响
Fig. 8 Effect of CaCO 3concentration on the growth of Lactobacillus brevis MM33--33

随着发酵过程中乳酸含量的升高，发酵液pH值降低，乳酸菌繁殖受抑制。在液芯微胶囊增殖培养基中添加适量CaCO 3，不仅可以增强微胶囊的机械强度，还可以起到缓冲发酵液pH值的作用。由图8可知，加入5 g/L CaCO 3时菌体密度最高，CaCO 3质量浓度继续增加，菌体密度下降。

表2 CCRD试验结果
Table 2 CCRD design with experimental and predicted values

试验号ABCD菌体密度（lg（CFU/g））实测值预测值1－1－1－1－113.4113.40 21－1－1－113.7113.75 3－11－1－113.6213.63 411－1－113.9313.90 5－1－11－113.3913.39 61－11－113.5513.53 7－111－113.3113.30 8111－113.3613.38 9－1－1－1－113.5713.55 101－1－1113.5913.58 11－11－1113.6113.61 1211－1113.5813.58 13－1－11113.8813.89 141－11113.7413.73 15－111113.6913.65 16111113.4213.41 17－200013.6313.65 18200013.7613.76 190－20013.7213.72 20020013.6113.63 2100－2013.5313.53 22002013.3413.35 23000－213.4313.42 24000213.5713.60 25000013.9313.86 26000013.9113.86 27000013.8913.86 28000013.8613.86 29000013.8513.86 30000013.7413.86

CCRD试验设计及结果如表2所示，通过对其进行二次多项回归拟合，得到微囊化短乳杆菌菌体密度Y对4 个因子（A蔗糖质量浓度、B胰蛋白胨质量浓度、C玉米浆体积分数、D CaCO 3质量浓度）的二次多项式回归方程：Y＝13.86＋0.027A－0.023B－0.044C＋0.045D－0.017AB－0.050AC－0.077AD－0.077BC－0.040BD－0.090CD－0.040A 2－0.048B 2－0.011C 2－0.089D 2。

表3 多项二次模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for the fitted quadratic polynomial model odel

变异源平方和自由度均方F值P值模型1.000140.071 35.62＜0.000 1失拟项0.007100.0070.160.993 2误差项0.02350.004 R 2＝0.970 8R 2 Adj＝94.35

由表3可知，该模型的P＜0.01，表明该模型回归方程极显著。失拟项在α＝0.01水平上显著（P＝0.993 2＞0.01）。该模型的校正决定系数

＝94.35，表明该模型能解释94.35%菌体密度的变化；模型的确定系数R 2＝0.970 8，表明该模型拟合的程度较好，试验误差较小，可用于微囊化短乳杆菌的生长增殖情况的预测分析。

表4 回归方程系数显著性检验
Table 4 Significance test for regression coefficients

模型项自由度系数估计标准差F值P值常数项113.860.018 A 1－0.0270.0109.090.008 7 B 1－0.0230.0106.090.026 1 C 1－0.0440.01023.450.000 2 D 10.0450.01024.350.000 2 A 21－0.0400.01022.220.000 3 B 21－0.0480.01031.28＜0.000 1 C 21－0.1100.010152.10＜0.000 1 D 21－0.0890.010108.74＜0.000 1 AB1－0.0170.01111.760.138 0 AC1－0.0500.0114.830.000 4 AD1－0.0770.0118.94＜0.000 1 BC1－0.0770.0118.94＜0.000 1 BD1－0.0400.0116.50 0.002 7 CD10.0900.0111.740.207 0

由表4可知，微囊化短乳杆菌菌体密度中各试验因素的线性效应全部显著，并且对菌体密度的曲面效应也全部显著；AD、BC的交互作用显著，而AB、AC、BD、CD的交互作用不显著。

图9 蔗糖与胰蛋白胨对微囊化短乳杆菌的交互作用影响曲面图（a）及其等高线图（b）b
Fig. 9 Response surface (a) and contour plots (b) showing the effect of sucrose and tryptone on the cell population of Lactobacillus brevis

图10 蔗糖与玉米浆对微囊化短乳杆菌的交互作用影响曲面图（a）及其等高线图（b）b
Fig. 10 Response surface (a) and contour plots (b) showing the effect of sucrose and corn steep liquor on the cell population of Lactobacillus brevis

图11 蔗糖与CaaCCOO 3对微囊化短乳杆菌的交互作用影响曲面图（a）及其等高线图（bb）
Fig. 11 Response surface (a) and contour plots (b) for the effect of cross-interaction between sucrose and CaCO 3on the cell population of Lactobacillus brevis

图12 胰蛋白胨与玉米浆对微囊化短乳杆菌的交互作用影响曲面图（a）及其等高线图（b）b
Fig. 12 Response surface (a) and contour plots (b) showing the effect of tryptone and corn steep liquor on the cell population of Lactobacillus brevis

图13 胰蛋白胨与CaaCCOO 3对微囊化短乳杆菌的交互作用影响曲面图（a）及其等高线图（bb）
Fig. 13 Response surface (a) and contour plots (b) showing the effect of CaCO 3and typtone on the cell population of Lactobacillus brevis

图14 CaaCCOO 3与玉米浆对微囊化短乳杆菌的交互作用影响曲面图（a）及其等高线图（bb）
Fig. 14 Response surface (a) and contour plots (b) showing the effect of CaCO 3and corn steep liquor on the cell population of Lactobacillus brevis

由图9～14可知，胰蛋白胨、蔗糖、玉米浆及CaCO 3的添加量的取值范围分别在6～14、12～18 g/L、13%～17%、3～7 g/L。采用软件分析得到的最佳组合为：蔗糖18 g/L、胰蛋白胨13.02 g/L、玉米浆13%、CaCO 33.29 g/L，此时模型预测菌体密度为13.91（lg（CFU/g））。在此条件下进行验证实验，得到的菌体密度为13.89（lg（CFU/g）），说明响应曲面法得到的此模型能有效地对所选的因子进行优化。

3 结论

发酵过程中乳酸菌对培养基的营养需求高，实验室常用的MRS培养基的成本比较高，不适合大规模培养。当今国外已有不少采用便宜的乳清底质培养基来生产乳酸菌浓缩型发酵剂的成功先例 [24-25]。国内，李艾黎 [26]和刘振民 [27]等研制了缓冲能力强、增殖培养效果很好的新型内控型pH值乳清培养基，此培养基比牛乳培养基和MRS培养基的培养效果更好，在此培养基中乳酸菌的生长速率较快。

在本研究的微囊化短乳杆菌在培养基优化前将MRS培养基作为增殖培养基进行了对照实验，增殖培养后得到的菌体密度为1.21×10 10CFU/g。

本研究通过单因素试验，确定蔗糖为微囊化短乳杆菌的最佳碳源，其最适质量浓度为15 g/L；胰蛋白胨为最佳氮源，最适质量浓度10 g/L；玉米浆为最佳促生长因子，最适体积分数15%；酸碱缓冲剂CaCO 3的最佳质量浓度为5 g/L。

本研究采用辅助设计软件Design-Expert 8.0.6以胰蛋白胨质量浓度、蔗糖质量浓度、玉米浆体积分数及CaCO 3质量浓度4 个生长强化因子作为研究对象，以菌体密度为响应值进行CCRD试验。最后优化的微囊化短乳杆菌高密度培养的专用培养基配方为：乳清粉60 g/L、蔗糖18g/L、胰蛋白胨13.03 g/L、玉米浆13%、CaCO 33.28 g/L、MgSO 40.28 g/L、MnSO 40.18 g/L，按照此配方再次进行增殖培养时，微囊化短乳杆菌的菌体密度可达到13.89（lg（CFU/g）），达到囊内菌株的浓缩培养。此研究结果可为浓缩型酸驼乳发酵剂的培养基配方提供依据。

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High-Density Cultivation of Lactobacillus brevis as a Dominant Strain Isolated from Xinjiang Traditional Fermented Camel Milk

KAYSER Sajidam, TOHTI Gulpiya, ABDUMILIK Nurya, HASAN Rezwangul, RAHMAN Nurgul *
(School of Life Sciences, Xinjiang Normal University, rümqi 830054, China)

Abstract：In this study, the one-factor-at-a-time method was employed to determine that the optimum carbon source for liquid-core microcapsules of Lactobacillus brevis M3-3 as a dominant strain isolated from Xinjiang traditional fermented camel milk was sucrose at 15 g/L, the optimum nitrogen source was typtone at 10 g/L, the optimum growth promoting factor was corn steep liquor at 15% and the optimum pH buffering agent was CaCO 3at 5 g/L. The interaction among the four factors was studied using response surface methodology to determine their optimum levels. The optimum medium formulation for high-density cultivation of the strain was found to be composed of 60 g/L whey powder, 18 g/L sucrose, 13.02 g/L typtone, 130 mL/L corn steep liquor, and 3.29 g/L CaCO 3.

Key words：traditional fermented camel milk; Lactobacillus brevis; high-density cultivation; response surface methodology

沙吉坦穆·克依斯尔, 古丽皮艳·托乎提, 努丽艳·阿不都米力克, 等. 新疆传统发酵酸驼乳优势菌种短乳杆菌高密度培养技术[J]. 食品科学, 2016, 37(23): 178-183. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201623030. http://www.spkx.net.cn

KAYSER Sajidam, TOHTI Gulpiya, ABDUMILIK Nurya, et al. High-density cultivation of Lactobacillus brevis as a dominant strain isolated from Xinjiang traditional fermented camel milk[J]. Food Science, 2016, 37(23): 178-183. (in Chinese with English abstract)

基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31160333）

作者简介：沙吉坦穆·克依斯尔（1989—），女，硕士研究生，研究方向为应用微生物。E-mail：sajida1026@163.com

*通信作者：努尔古丽·热合曼（1972—），女，副教授，博士，研究方向为传统发酵食品、益生菌资源。E-mail：nurgulum@163.com

新疆传统发酵酸驼乳优势菌种短乳杆菌高密度培养技术

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论