向进乐 1,2,3，罗 磊 1,2，马丽苹 1,3，张彬彬 1，樊金玲 1,2，朱文学 1,2,*
（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.河南省食品原料工程技术研究中心，河南 洛阳 471023；3.洛阳市微生物发酵工程技术研究中心，河南 洛阳 471023）
摘 要：以光皮木瓜为原料，发酵木瓜干酒，再通过液态深层发酵酿制木瓜醋，确定了木瓜干酒和木瓜醋的发酵工艺，并对木瓜酒和醋主要有机酸进行分析。光皮木瓜经榨汁、调整糖度后进入发酵工序，酒精发酵采用带皮渣半固态发酵方式，条件为加水比例1.5∶1（m/m）、初始糖度18%、果酒干酵母接种量0.1%、在24 ℃条件下发酵64 h，木瓜酒酒度（乙醇体积分数）为9.45%。醋酸发酵采用半连续式液态深层发酵法，调整初始酒度7%，醋酸菌接种量10%，在34 ℃条件下醋酸发酵80 h，木瓜醋总酸度为4.52%；分割留种发酵仅需24 h即可完成醋酸发酵。采用反相高效液相色谱法从木瓜干酒和木瓜醋中检出10 种有机酸，分别是草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸。实验确定的发酵工艺以及有机酸的分析与鉴定可为木瓜干酒及木瓜醋产品的开发提供理论依据。
关键词：光皮木瓜；木瓜干酒；木瓜醋；发酵工艺；有机酸
光皮木瓜（Chaenomeles sinensis Koehne）别名海棠，属蔷薇科（Rosaceae）木瓜属植物，是我国特有的经济树种，广泛种植于陕西、山东、河南、广东、海南等地。光皮木瓜不仅营养丰富，还具有较强的保健功能。光皮木瓜所含氨基酸组成全面，还含有苹果酸、酒石酸、柠檬酸等丰富的有机酸；含有多种矿物质，是一种高钾低钠食品资源；VC平均含量高达122 mg/100 g，远高于皱皮木瓜（76.4 mg/100 g），是柑橘的近4 倍，苹果的30多倍 [1-2]。现代分析化学与医学研究表明，光皮木瓜中含酚酸、黄酮、三萜皂苷、多糖等多种活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、保肝、抑菌、强心、利尿等多种功效 [3-5]。木瓜中熊果酸、齐墩果酸、白桦脂酸等三萜化合物一直受到研究人员的关注 [3]。张婷等 [4]研究发现光皮木瓜中总多酚含量高达1 801 mg/100 g（以鲜质量计），具有很强的清除自由基能力；Sawai等 [5]还发现光皮木瓜中高分子质量的多酚物质是抑制流感病毒的主要活性成分，说明多酚类也是光皮木瓜主要功效成分之一。
在食品工业中，木瓜已被开发成多种保健食品 [6]，木瓜可以通过现代发酵技术酿制成木瓜酒、木瓜醋 [7-8]。但由于光皮木瓜原料的酸度较高，酿制的木瓜干酒酸度较高、口感较粗糙。为提高木瓜酒的品质，在达到干酒的国家质量标准的同时，往往需要进行降酸处理，以改善风味 [9]。为了提高光皮木瓜的利用率以及木瓜酒的保健功效，实验以木瓜中含量较高的VC和多酚为主要指标，研究了木瓜酒的发酵条件；同时，为了使木瓜干酒的降酸方法更有针对性，实验分析了木瓜酒中11 种主要有机酸。本实验采用半连续液态深层发酵法酿制木瓜醋，并对木瓜醋主要有机酸进行分析，为木瓜醋产品的开发和生产提供理论依据。
1.1 材料与试剂
光皮木瓜，于11月初木瓜成熟季节采摘于洛阳理工学院校园内。
酒用高活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌 上海中科伍佰豪生物有限公司。
果胶酶（酶活力100 000 U/g） 河南正兴食品添加剂有限公司；有机酸标品（苹果酸、酒石酸、醋酸等） 天津科密欧化学试剂有限公司；福林-西奥卡特试剂 上海荔达生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
ZJ145型果蔬压榨机 广东恒联食品机械有限公司；UV-2350型紫外-可见分光光度计 上海优尼科公司；TGL-20M型台式离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；HND-GQ-4.5 L型三联液态发酵罐 镇江汇能达生物工程设备有限公司；LC-15C高效液相色谱仪（包括LC-15C泵、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C柱温箱、SPD-15C紫外检测器及数据处理系统） 日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 分析检测方法
1.3.1.1 酒度、总酸度及总VC含量测定
木瓜酒酒度（乙醇体积分数，下同）以酒精计法测定；样品中总酸度采用酸碱滴定法测定；木瓜酒总VC含量采用2,4-二硝基苯肼法，绘制标准曲线，得回归方程为y＝0.022 9x＋0.003 1（R 2＝0.994 4），样品测定及计算步骤参照GB/T 5009.86—2003《蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2,4-二硝基苯肼法）》。
1.3.1.2 总酚含量测定
发酵液样品总酚参考Zhou Kequan等 [10]的方法测定，以没食子酸作标准曲线，线性回归方程为y＝0.232 9x－0.007 2（R 2＝0.996 3）。木瓜发酵液总酚含量以没食子酸计（mg/100 mL）。
1.3.1.3 木瓜酒液得率计算
酒精发酵后，木瓜酒液得率根据按下式计算。
1.3.1.4 木瓜干酒和木瓜醋中有机酸含量测定
有机酸含量测定参考前期优化的方法进行 [11]。色谱条件：色谱柱为Wondasil C 18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相，0.01 mol/L KH 2PO 4-H 3PO 4缓冲溶液（pH 2.8）；流速0.7 mL/min；检测波长210 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。样品处理：取发酵完成的木瓜酒和木瓜醋样品迅速10 000 r/min冷冻离心10 min，上清液用流动相稀释10 倍，过滤膜，滤液上机分析（进样10 μL），外标法定量。
1.3.2 木瓜干酒发酵工艺的确定
1.3.2.1 工艺流程
1.3.2.2 原料处理方式
取汁发酵：取新鲜光皮木瓜加水榨汁，收集木瓜汁，调整糖度为14%（g/100 mL，下同），加入0.1%的酵母拌均，于24 ℃条件下酒精发酵，发酵结束测定木瓜酒得率、酒度、总VC含量、总酚含量等指标。
榨汁带渣发酵：按料液比1∶1.5（m/m，下同）加水榨汁，收集汁、渣，加入糖液调整初始糖度为14%，加入0.1%的酵母拌均，于24 ℃条件下酒精发酵，发酵结束，过滤、8 000 r/min离心10 min，得木瓜酒液，测定指标。
榨汁带渣酶解发酵：按料液比1∶1.5加水榨汁，收集汁、渣，先按质量分数0.05%加复合果胶酶于32 ℃条件下酶解2 h，再按上述榨汁带渣发酵的方法进行酒精发酵，测定指标。
1.3.2.3 发酵条件
加水比例：分别按料液比1∶1、1∶1.5、1∶2加水榨汁，接种发酵，测定指标；初始糖度：分别调整初始糖度为10%、14%、18%、22%，接种发酵，测定指标；发酵温度：分别在20、24、28、32 ℃条件下进行酒精发酵，测定指标。
1.3.3 木瓜醋发酵工艺
1.3.3.1 工艺流程
1.3.3.2 醋酸发酵工艺
采用优化后的酒精发酵方法制备木瓜酒，作为木瓜醋发酵底物。醋酸发酵参照前期优化的果醋发酵条件进行 [12]。将木瓜酒酒度调整到7%左右，按体积分数接种10%经活化的醋酸菌，维持发酵温度34 ℃。待第一次醋酸发酵完成，采用分割留种方式进行循环发酵。
1.4 数据统计分析
采用DPS 6.55软件进行数据处理，实验重复3 次，结果用±s表示，显著性差异以不同字母表示。
2.1 木瓜酒发酵条件优化
2.1.1 木瓜原料处理方式的确定
表1 原料处理方式对木瓜酒液得率和品质的影响
Table 1 Effects of different pretreatments for raw material on the yield and quality of Chaenomeles sinensis fruit wine
注：同行肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
评价指标处理方式取汁发酵榨汁带渣发酵榨汁带渣酶解后发酵酒度/%7.12±0.33 a7.48±0.43 a7.52±0.47 a酒液得率/%63.69±2.45 a76.57±3.61 b78.03±3.92 bVC含量/（mg/100 mL）20.09±1.72 a35.66±1.85 b36.94±1.64 b总酚含量/（mg/100 mL）396.00±13.48 a675.00±21.55 b698.00±30.41 b
原料处理方式对木瓜酒液得率、酒度、VC及总酚含量的影响如表1所示，原料处理不同方式所得木瓜酒酒度无显著差异（P＞0.05）。而木瓜直接取汁发酵与榨汁带渣发酵、榨汁带渣酶解后发酵相比，酒液得率、酒液中VC和总酚含量明显较低（P＜0.05）。因为光皮木瓜原料的纤维含量高 [1]，必须要经过充分破碎才能使原料中的营养物质和多酚等功效成分充分溶出，提高酒液得率和酒中营养保健成分含量。
果蔬加工中使用果胶酶能提高果汁澄清度、出汁率以及果酒的酒液得率，从而提高原料的利用率 [13-14]。本研究加入复合果胶酶对木瓜浆液酶解处理发现，酶处理对木瓜酒各指标并无显著影响（P＞0.05）。考虑经济成本，实验采用原料榨汁带渣进行酒精发酵。
2.1.2 酒精发酵加水比例的确定
表2 加水比例对木瓜酒得率和品质的影响
Table 2 Effects of different material/water ratios on the yield and quality of wine from Chaenomeles sinensis fruit wine
评价指标加水比例（m/m）1∶11∶1.51∶2酒度/%7.55±0.78 a7.53±0.83 a7.45±0.69 a酒液得率/%60.15±2.29 a76.39±3.55 b82.01±4.20 cVC含量/（mg/100 mL）38.57±0.98 b36.88±1.07 b23.82±0.94 a总酚含量/（mg/100 mL）695.00±33.18 b678±20.68 b398.00±22.14 a
由表2可知，加水比例越大，酒液得率越高，但所得木瓜酒VC和总酚含量越低，所需增加的糖分越多。当加水比为1∶2时，VC含量为23.82 mg/100 mL，总酚含量为398.00 mg/100 mL，显著低于添加1 倍和1.5 倍水时。加水比例高，虽然酒液得率提高，但是木瓜酒营养和功能成分含量低，同时也需要补充更多糖分而增加生产成本。与加水比例为1∶1.5相比，当加水比例为1∶1时，木瓜酒中VC和总酚含量均较高，但无显著性差异；而酒液得率显著降低（P＜0.05）。因此，当加水1.5 倍时，木瓜酒液得率、营养和保健成分含量均较高。
2.1.3 酒精发酵初始糖度的确定
由于光皮木瓜糖酸比较低，木瓜酒发酵前需补充糖分以提供微生物活动所需碳源并产生足量酒精。由表3可知，初始糖度越高，木瓜酒酒度也越高。初始糖度18%时发酵酒酒度、VC和总酚含量均较高。当初始糖度超过18%，酒度升高不明显，发酵周期也显著延长，说明糖分没能充分利用或者糖的转化率降低，酵母发酵产酒变缓；而且木瓜酒中VC和总酚含量显著偏低。因此，综合考虑发酵周期、酒度以及生产成本，选择初始糖度18%。
表3 初始糖度对木瓜酒品质及发酵周期的影响
Table 3 Effects of initial sugar concentration on the fermentation cycle and quality of Chaenomeles sinensis fruit wine
评价指标初始糖度/% 10141822酒度/%5.65±0.64 a7.55±0.71 b9.33±0.86 c10.06±0.95 c发酵周期/h60±4 a72±4 ab80±4 b96±8 cVC含量/（mg/100 mL）34.72±1.14 b33.59±1.71 b35.82±1.27 b27.69±0.94 a总酚含量/（mg/100 mL）645.00±30.21 b674.00±26.28 b677.00±30.13 b608.00±21.63 a
2.1.4 酒精发酵温度的确定
表4 酒精发酵温度对发酵周期和木瓜酒品质的影响
Table 4 Effects of different fermentation temperatures on the fermentation cycle and quality ofChaenomeles sinenssiiss fruit wwiinnee
评价指标发酵温度/℃20242832酒度/%9.10±0.71 a9.45±0.75 b9.29±0.96 ab9.08±0.85 a发酵周期/h80±6 c64±4 b56±4 ab48±4 aVC含量/（mg/100 mL）36.22±1.31 c35.59±1.77 c24.62±1.25 b17.69±0.74 a总酚含量/（mg/100 mL）625.00±30.21 ab674.00±29.14 c639.00±28.03 b608.00±21.63 a
由表4可知，温度越高，发酵速度越快，发酵周期越短。但高发酵温度所得木瓜酒的酒度、VC和总酚含量显著降低（P＜0.05）。因为温度高，酵母活动加剧，用于酵母繁殖的能量增加，导致糖的有效转化率降低。另外，温度高可能会造成部分酒精挥发，也可能是产生相对低酒度的原因。VC是一种不稳定的抗氧化物质，温度越高，越不稳定。当发酵温度高于24 ℃时，所得木瓜酒VC含量显著降低。多酚是木瓜中的主要抗氧化物质 [4]，总酚含量在24 ℃发酵时最高，这可能是发酵周期、酵母菌活动以及多酚氧化等多因素共同作用的结果 [15]。
2.2 木瓜醋发酵过程中酒度与酸度的变化
由图1可知，第一批发酵持续80 h，可分为3 个阶段。第一阶段（0～16 h）醋酸菌需进行大量增殖至足够高的菌体浓度，酸度仅缓慢升高，表明醋酸菌生长情况较好。第二阶段（16～64 h）酒度剧烈下降至1.2%，总酸度显著升高至4.07%（g/100 mL，下同）。第三阶段（64～80 h）由于酒精逐渐耗尽，发酵最后阶段总酸度逐渐升至最大值4.52%。醋酸发酵第一批完成后须尽快补充酒液循环发酵。分割留种发酵周期（80～104 h）大大缩短，仅用24 h就完成发酵。由于醋酸菌的菌体浓度本身较高，醋酸菌的增殖过程大大缩短，随后很快进入快速产酸阶段。醋酸发酵的启动阶段相对比较困难，半连续和连续发酵可使醋化效率大大提高 [16]。
图1 醋酸发酵过程中酒度和酸度变化
Fig. 1 Time course of acetic acid fermentation for Chaenomeles sinensis fruit vinegar
2.3 木瓜酒和木瓜醋有机酸组成分析
图2 11 种有机酸混合标准品反相高效液相色谱图
Fig. 2 Chromatogram of a standard mixture of eleven organic acids
采用反相高效液相色谱法定性和定量分析，有机酸混合标准品色谱图如图2所示。木瓜酒和木瓜醋样品有机酸的定性，采用在相同的测试条件下比较样品峰和混合标准品有机酸的保留时间，添加标准物视峰高增加的方法。木瓜酒和木瓜醋有机酸色谱图如图3，共检出10 种有机酸。
图3 木瓜酒（A）和木瓜醋（B）反相高效液相色谱图
Fig. 3 Chromatogram of organic acids from Chaenomeles sinensis fruit wine (A) and vinegar (B)
由表5可知，木瓜酒主要以苹果酸、醋酸、酒石酸和琥珀酸为主；木瓜醋中醋酸含量最高，其次是苹果酸和酒石酸。VC是果蔬以及果蔬产品的主要抗氧化物质之一，在制汁、加热等加工处理和贮藏过程中通常不稳定 [17-18]。但木瓜中含量较高的VC在两种木瓜发酵产品中均未检测到，说明木瓜经过前处理、酒精发酵以及干酒陈酿等工序后VC已逐渐氧化甚至降解消失。
表5 木瓜酒和木瓜醋有机酸含量
Table 5 Contents of organic acids in Chaenomeles sinensis fruit wine and vinegar
样品草酸酒石酸甲酸苹果酸α-酮戊二酸乳酸醋酸柠檬酸富马酸琥珀酸木瓜酒5.54263.10152.63902.4148.6844.37432.6721.190.16121.07木瓜醋1.34222.9621.81678.1840.4423.44 2 819.7437.5813.05125.93
李琼等 [2]报道，光皮木瓜中含有苹果酸、酒石酸、柠檬酸等，其中苹果酸占有机酸总量的80%以上。由表5可知，木瓜经过发酵酿成木瓜酒和木瓜醋后，这些主要有机酸含量仍然存在于发酵产品中，木瓜酒中苹果酸含量高达9 024.1 mg/L，比苹果酒 [19]、荔枝酒 [20]、拐枣酒 [11]及菠萝酒 [21]等的苹果酸含量都要高。苹果酸具有生青、新鲜、涩感 [19]，这也是木瓜干酒酸涩味较重、柔和度不足的重要原因之一 [9]。
果酒发酵过程中常伴随着苹果-乳酸发酵或者苹果酸-酒精发酵 [22-23]。而苹果酸-酒精发酵主要是由酵母菌，如粟酒裂殖酵母的代谢以及一些可以通过胞内苹果酸酶将苹果酸转化为丙酮酸的酵母引起 [24]。酒精发酵中，由于酵母菌通常不能有效将苹果酸完全转化，而且也会出现苹果-乳酸发酵停滞现象 [22,25]。在苹果-乳酸发酵过程中，乳酸菌，如酒酒球菌能将苹果酸转化成乳酸和CO 2 [24]。木瓜干酒乳酸含量较低（44.37 mg/100 mL），说明木瓜酒精发酵过程中苹果-乳酸发酵不足。因此，在木瓜干酒降酸时可以考虑在发酵中接种苹果酸转化能力强的乳酸菌，达到促进苹果-乳酸发酵，改善木瓜干酒口感的作用。
酒度为7%的木瓜酒经液态深层发酵后，滴定酸度可达4.52%，满足GB 18187—2000《酿造食醋》对酸度的要求。醋酸菌将酒精转化为醋酸，醋酸为木瓜醋的最主要的有机酸，苹果酸、酒石酸和琥珀酸等非挥发有机酸也较为丰富，共同构成了木瓜醋浓厚、丰满的酸味体系。
光皮木瓜营养丰富、保健功效突出，可以发酵成木瓜干酒和木瓜醋。光皮木瓜加1.5 倍水榨汁，调整初始糖度为18%，接种0.1%的果酒干酵母，采用带渣发酵方式于24 ℃发酵64 h，木瓜酒酒度为9.45%。醋酸发酵采用液态深层-分割留种发酵法，调整初始酒度为7%，接种10%活化的醋酸菌，在34 ℃第一轮醋酸发酵80 h，木瓜醋总酸度为4.52%；分割留种发酵仅需24 h即可完成醋化过程。
从木瓜酒、醋中检出10 种有机酸，分别是草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸。木瓜干酒中主要有机酸为苹果酸、醋酸和酒石酸；木瓜醋中含量最高的是醋酸，其次是苹果酸和酒石酸。
实验优化的工艺参数能为木瓜酒和木瓜醋工业化发酵生产提供参考。木瓜发酵产品中有机酸的分析与鉴定可为木瓜干酒针对性降酸处理提供理论依据，也可为木瓜醋产品的深度开发提供参考。
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Fermentation and Organic Acid Composition of Wine and Vinegar from Chaenomeles sinensis Fruits
XIANG Jinle
1,2,3, LUO Lei
1,2, MA Liping
1,3, ZHANG Binbin
1, FAN Jinling
1,2, ZHU Wenxue
1,2,*
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. Henan Engineering Research Center of Food Material, Luoyang 471023, China; 3. Luoyang Engineering and Technology Research Center of Microbial Fermentation, Luoyang 471023, China)
Abstract：Wine was produced from fruits of Chaenomeles sinensis and further subjected to submerged fermentation to produce vinegar. After adjusting the sugar concentration, the crushed fruits of Chaenomeles sinensis were subjected to semisolid-state fermentation with active dry yeast under the conditions: addition of water at a mass ratio of 1.5:1 (m/m), initial sugar concentration of 18%, inoculum size of 0.1%, temperature of 24 ℃, and time of 64 h, yielding an alcohol concentration of 9.45% in the wine. Subsequently, after adjusting the alcohol concentration to 7%, the acetic acid fermentation was carried out with an inoculum size of 10% at 34 ℃ for 80 h, giving a total titratable acidity of 4.52%. The fermentation process took only 24 h when it was carried out in a cyclic mode by portion-wise addition of the substrate. Ten organic acids (oxalic acid, tartaric acid, formic acid, malic acid, α-ketoglutaric acid, lactic acid, acetic acid, fumaric acid and succinic acid) were identif ed in the wine and the vinegar by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). The fermentation process presented in this study and analysis of organic acids can provide a theoretical basis for the development of Chaenomeles sinensis fruit wine and vinegar.
Key words：Chaenomeles sinensis; fruit wine; fruit vinegar; fermentation process; organic acids
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201623032
中图分类号：TS264.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）23-0191-05
引文格式：
向进乐, 罗磊, 马丽苹, 等. 木瓜酒和木瓜醋发酵工艺及其有机酸组成分析[J]. 食品科学, 2016, 37(23): 191-195.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201623032. http://www.spkx.net.cn
XIANG Jinle, LUO Lei, MA Liping, et al. Fermentation and organic acid composition of wine and vinegar from Chaenomeles sinensis fruits[J]. Food Science, 2016, 37(23): 191-195. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201623032. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-01-21
基金项目：河南省高等学校重点科研项目（17A550011）；河南科技大学博士科研基金项目（13480034）；河南科技大学大学生训练计划（SRTP）项目（2016066）
作者简介：向进乐（1980—），男，副教授，博士，研究方向为发酵食品与功能性。E-mail：xjl5013@haust.edu.cn
*通信作者：朱文学（1967—），男，教授，博士，研究方向为食品加工与功能食品。E-mail：zwx@haust.edu.cn