不同贮藏时间普洱生茶水提物的特征性成分分析

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.云南大益茶业集团，云南昆明 650217；3.西南大学茶叶研究所，重庆 400716；4.云南省普洱茶发酵工程研究中心，云南昆明 650217）

摘要：以同公司、同批号、不同贮藏时间的普洱生茶（7542）为研究对象，真空冷冻干燥制备普洱生茶水提取物，利用分光光度计和超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测其内含成分，并进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（cluster analysis，CA），得出不同贮藏时间普洱生茶水提物的特征性成分和聚类树状图。结果表明，不同贮藏时间的普洱生茶水提物，随着贮藏时间的延长，茶多酚、儿茶素和游离氨基酸呈逐渐下降趋势，黄酮呈逐渐上升趋势，可溶性总糖和咖啡碱呈不规则变化；不同贮藏时间的普洱生茶提取物经UPLC-MS/MS共检测到107 种化合物，经PCA，得到不同贮藏时间普洱生茶水提物的特征性成分包括柠檬酸、没食子酸、表儿茶素、茶氨酸、咖啡碱、表没食子儿茶素没食子酸酯等26 种物质；CA表明，贮藏年份越接近的普洱生茶水提物样越易聚为一类，贮藏时间达到3 a和8 a时，茶叶聚类分类发生较大变化。

关键词：普洱生茶；超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）；特征性成分；多元统计分析

普洱茶是因地名而得名的一类茶，在清代设有普洱府，因作为贡茶而闻名天下。2008年国家质量监督检验检疫总局将普洱茶设定为地理标志产品，并定义为以云南大叶种晒青毛茶为原料，采用特定加工工艺制成，有独特品质风格的茶叶，可分为普洱生茶和普洱熟茶 [1]。

普洱生茶是将精制过的晒青茶经蒸压成型、干燥等工艺加工而成的紧压茶，其干茶色泽墨绿、滋味浓厚回甘、香气持久、汤色绿黄明亮、叶底肥厚；且因其独特的品质特点和保健功效备受大众喜爱。不同贮藏时间的普洱生茶具有不同的品质风格，有普洱茶越陈越香和售价越高的说法 [2]。普洱生茶新茶品质接近绿茶，陈茶汤色呈琥珀黄、口感浓厚回甘，老茶入口顺滑生津，达到一定贮藏时间的老茶浓郁爽口。研究表明普洱茶具有抗菌、抗诱变 [3]、解毒、助消化、降甘油三酯和胆固醇、减肥 [4]、保护肝脏、抗癌 [5]、防治心血管类疾病 [6]等作用；此外普洱生茶含有的抗氧化活性化合物较多，抗氧化活性、清除自由基和保护细胞的效果均优于普洱熟茶 [7]，且具有抗疲劳的效果 [8]。贮藏时间对普洱生茶化学成分有较大影响，随着贮藏时间的延长，水分含量和黄酮类物质逐渐增加，茶多酚类物质尤其儿茶素类、咖啡碱及氨基酸呈逐渐下降趋势 [7,9]。

基于贮藏时间对普洱生茶成分和品质的影响，本实验以2013—2004年大益普洱生茶（7542）为原料，采用分光光度计和超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析不同贮藏时间普洱生茶水提物的化学成分；同时结合简单分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）筛选出供试普洱生茶水提物的主要特征性成分；采用聚类分析（cluster analysis，CA）方法对不同贮藏时间的供试普洱生茶水提物进行分类聚类研究。

1 材料与方法

2013—2004年大益普洱生茶（7542）样品由云南大益集团提供；均采用同一标准采摘的云南大叶种加工而成；贮藏于大益集团恒温恒湿条件的仓库中（温度20 ℃、相对湿度60%），保证了贮藏环境的一致性。

硫酸亚铁、酒石酸钾钠、95%乙醇、香荚兰素、浓硫酸、三氯化铝、水合茚三酮、氯化亚锡、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、碱式乙酸铅、葡萄糖（均为分析纯），浓盐酸（优级纯）成都市科龙化工试剂厂；咖啡因（生化试剂）上海试剂二厂；蒽酮（分析纯）上海科丰实业有限公司；乙腈、甲酸、甲醇（均为一级色谱纯）天津市四友精细化学品有限公司；茶氨酸、槲皮素（均为标准品，纯度＞99.0%）美国Sigma公司。

UPLC-MS/MS仪美国Waters公司；KQ5200DE超声波振动仪江苏昆山市超声仪器有限公司；IEC CL31 multispeed高速离心机美国Thermo公司；UV-2450紫外-可见分光光度计日本岛津公司；SCIENTZ-30 ND冷冻干燥设备宁波新芝生物科技股份有限公司；FA2004A电子天平上海精天电子仪器有限公司；722型可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱上海齐欣科学仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅常州澳华仪器有限公司。

水分含量：按GB/T 8304—2013《茶水分的测定》进行测定 [10]；水浸出物含量：按GB/T 8305—2013《茶水浸出物的测定》进行测定 [11]；茶多酚含量：采用酒石酸亚铁比色法 [12]测定；儿茶素含量：采用香荚兰素比色法 [13]测定；黄酮含量：采用三氯化铝（AlCl 3）比色法 [13]测定；可溶性总糖含量：采用蒽酮-硫酸比色法 [13]测定；咖啡碱含量：按GB/T 8312—2013《茶咖啡碱的测定》中的紫外分光光度法进行测定 [14]；游离氨基酸总量：按GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》进行测定 [15]。

浸提时间：2014年8月。提取物制备工艺：浸提（第1次：1∶15料液比（g/mL），75～80 ℃，45 min；第2次：1∶10料液比（g/mL），75～80 ℃，30 min）→提取液合并过滤→真空冷冻干燥。

式中：Z为制备率/%；M 1为干燥后的提取物质量/g；M为茶叶原料质量/g；C为水浸出物含量/%。

称取0.10～0.20 g样品（普洱生茶水提物），加入20 mL水，再加入5 mL甲醇，超声振动提取10 min，高速离心5 min，过0.22 μm有机相滤膜，上UPLC-MS/MS进行测定。

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS，T3（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温35 ℃；样品温度5 ℃；进样量5 μL；流动相A：0.1%甲酸溶液，流动相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；流速0.25 mL/min。梯度洗脱见表1。

MS条件：电喷雾离子源正负模式；毛细管电压3.0 kV；离子源温度120 ℃；锥孔反吹气流量50 L/h；脱溶剂气温度380 ℃；脱溶剂气流量800 L/h；碰撞气流量0.18 mL/min；质量扫描范围m/z 50～1 000；锥孔电压10～50 kV。

以样品中每组目标物的峰面积与该组选择标准参照物峰面积的比较相对定量，其中正离子电离模式选择茶氨酸，负离子电离模式选择槲皮素作为标准参照物进行定量。

每组实验做3 次平行，取平均值。采用Origin 9.0作图，IBM SPSS Statistics 19.0对生化成分和UPLC-MS/MS检测数据进行单因素方差分析、PCA和CA。

2 结果与分析

由表2可知，普洱生茶的含水量在9.3%～10.1%之间；其中贮藏5 a的最高，贮藏7 a的最低，分别为10.01%、9.37%。普洱生茶的水浸出物含量在42.0%～49.0%之间；其中贮藏6 a的最高，贮藏10 a的最低，分别为48.62%、42.23%。方差分析表明，普洱生茶的含水量和水浸出物各自在大部分贮藏时间之间不存在显著差异，尤其是贮藏1 a与贮藏10 a的无显著差异；说明普洱生茶在贮藏过程中贮藏条件好，保存得当，避免了因贮藏条件造成的样品生化成分的差异。普洱生茶提取物制备率在67.0%～82.0%之间；其中提取物制备率最高的是贮藏10 a的普洱生茶，最低的是贮藏6 a的，分别为81.61%、67.72%。所有样品的水浸出物含量均在40.0%以上，提取物制备率均在67.0%以上，表明普洱生茶内含物质丰富，提取物制备方法较优。

真空冷冻干燥技术能够使水分由固态冰晶直接升华为水蒸气被蒸发，从而达到干燥的目的。因此本研究采用真空冷冻干燥的方式对普洱生茶提取物进行干燥，其在干燥过程中始终保持较低的温度，能够最大程度地保存其生化成分 [16]；将普洱生茶提取物作为后续的检测样品，便于最大可能重现茶饼中的原始生化成分。

文献[7]报道不同贮藏时间普洱生茶的品质、风味及其主要生化成分不同，为了研究不同贮藏时间的普洱生茶主要生化成分的变化情况和规律，本实验采用分光光度法测定普洱生茶中对品质和风味影响较大的6 类生化成分，并比较分析其随着贮藏时间呈现的变化规律。

由图1A可知，随着贮藏时间的延长，普洱生茶茶水提物的茶多酚含量呈下降趋势；表现为贮藏1 a时最高，贮藏10 a时最低，降幅8.64%；贮藏时间达7 a时，茶多酚含量呈显著下降。由图1B可知，随着贮藏时间的延长，普洱生茶水提物的儿茶素含量呈下降趋势；表现为贮藏1 a时最高，贮藏10 a时最低，降幅为12.64%；贮藏时间达5 a时，儿茶素含量显著下降。普洱生茶受贮藏环境的影响，易发生氧化、降解等现象，导致多酚类物质的减少；茶多酚是茶汤滋味苦涩浓强的主要贡献物质且其氧化聚合形成茶色素（茶黄素、茶红素和茶褐素）影响茶汤色泽；因此随着多酚类物质的减少和转化，普洱生茶滋味变醇和，汤色变红浓明亮，品质和风味更佳 [9]。本研究结果也表现为普洱生茶水提物茶多酚和儿茶素含量随着贮藏时间的延长而下降，与其他报道 [9,17]相符。

由图2可知，随着贮藏时间的延长，普洱生茶水提物的黄酮含量呈上升趋势；表现为贮藏10 a时最高，贮藏1 a时最低，增幅为46.72%；其中贮藏5 a时，黄酮含量呈显著增加。黄酮类物质由黄酮苷和黄酮醇类组成，呈柔和的涩味且阈值低；贮藏过程中茶叶受酶或热作用水解糖苷释放溶于水的黄酮醇；同时因其母核常含甲氧基、羟基等助色基团，使黄酮类物质多呈黄色；因此，黄酮类物质随着贮藏时间的延长而增加，使普洱生茶茶汤色泽更红黄明亮且滋味更醇和 [18]。

由图3可知，普洱生茶水提物随着贮藏时间的延长无明显规律；普洱生茶水提物贮藏5 a时最低，贮藏3 a时最高，分别为8.46%和10.64%。可溶性总糖主要为单糖和双糖 [19]，是构成茶汤滋味和香气的重要来源，在茶汤中呈甜味，对苦涩味有协调和掩盖作用 [20]。贮藏过程中，普洱生茶的可溶性糖含量无明显变化规律，其原因可能是随着贮藏时间的延长，一方面大分子碳水化合物被分解，导致可溶性糖含量增加；另一方面微生物大量繁殖，微生物作用增强，导致可溶性糖的消耗。

由图4可知，咖啡碱含量随着贮藏时间的延长无明显变化规律；普洱生茶水提物贮藏8 a时最高，贮藏2 a时最低，分别为8.99%和7.81%。咖啡碱是茶叶中重要的滋味成分，在茶汤中呈现苦味，能与茶黄素缔合形成具有鲜爽味的复合物 [18]；咖啡碱对普洱茶品质有一定的影响，Liang Yuerong等 [21]研究表明，咖啡碱、茶多酚、香叶醇、芳樟醇氧化物等能评价普洱茶品质。咖啡碱在普洱生茶贮藏过程中无明显的变化规律，一方面可能是因为甲基转移或被微生物分解利用的结果；另一方面贮藏过程中微生物大量繁殖，可能促进了咖啡碱的合成 [22]，因此其含量出现波动，无明显规律。

由图5可知，随着贮藏时间的延长，普洱生茶水提物的游离氨基酸含量呈下降趋势；表现为贮藏1 a时最高，含量为5.46%，贮藏10 a时最低，含量为2.26%，降幅为58.61%；不同贮藏时间的样品，游离氨基酸含量存在显著差异，游离氨基酸含量在贮藏2 a时，即表现显著下降。茶氨酸是游离氨基酸中含量最高的，约占游离氨基酸的70%，呈鲜味和甜味，同时能抑制茶汤的苦涩味；由于谷氨酸、脯氨酸等的协同增效作用，使茶氨酸对普洱生茶的鲜味贡献度更大 [23]。贮藏过程中氨基酸含量下降，氨基酸组成也发生改变，导致普洱生茶在香气和滋味上均发生改变。普洱生茶中游离氨基酸含量随着贮藏时间的延长呈下降趋势 [9]，与可溶性蛋白的分解、氨基酸自身的氧化降解以及与其他物质发生反应生成不溶性物质等有关 [24]。

不同贮藏时间普洱生茶水提物的部分生化成分存在显著或极显著的差异，随着贮藏时间的延长，茶多酚、儿茶素和氨基酸呈下降趋势；黄酮呈上升趋势；咖啡碱和总糖无明显变化规律。茶叶中这6 类生化成分组成复杂，如儿茶素类物质由表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、儿茶素和表儿茶素（epicatechin，EC）等组成；游离氨基酸由茶氨酸（Thea）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）等组成，且上述测定中有5 类生化成分均为复合物总量，因此无法根据结果推测和筛选出普洱生茶水提物年份差异的特征性物质。由此提出在明确6 类生化成分变化规律的基础上，采用UPLC-MS/MS进一步测定不同贮藏时间普洱生茶水提物的生化成分，以期评价和筛选出其特征性成分。

本实验以不同贮藏时间的普洱生茶水提物为原料，采用UPLC-MS/MS测定普洱生茶水提物的生化成分，并通过文献报道和数据分析（PCA和CA）综合评价和筛选出不同贮藏时间普洱生茶水提物的特征性成分。

表3 不同贮藏时间普洱生茶提取物UPLC-MS/MS检测成分相对含量
Table3 The relative contents of components of raw Pu-erh tea extract with different storage times analyzed by UPLC-MS/MMSS %

化合物种类化合物名称编号贮藏时间/a 12345678910有机酸类奎宁酸X 10.850 7 1.273 2 0.372 4 0.946 7 0.650 9 0.621 7 0.463 6 1.249 6 0.727 6 1.093 5苹果酸X 20.091 2 0.679 6 0.868 0 0.572 3 0.594 1 0.603 6 0.249 3 1.414 9 0.587 0 0.548 2抗坏血酸X 30.130 6 0.133 1 0.129 0 0.085 4 0.123 7 0.120 5 0.003 6 0.208 5 0.118 2 0.076 7柠檬酸X 41.886 4 2.682 4 1.817 6 1.738 2 1.540 7 1.377 2 0.859 3 2.880 1 1.622 0 1.349 1琥珀酸X 50.077 2 0.047 7 0.080 1 0.047 8 0.057 3 0.090 3 0.013 8 0.101 1 0.062 2 0.043 4非黄酮类酚酸顺式单咖啡酰酒石酸酯X 60.133 6 0.140 8 0.099 2 0.156 0 0.128 9 0.084 6 0.090 1 0.242 3 0.126 9 0.185 9反式单咖啡酰酒石酸酯X 70.133 6 0.140 8 0.099 2 0.156 0 0.128 9 0.084 6 0.090 1 0.243 1 0.126 9 0.185 9顺式对单香豆酰酒石酸酯X 80.009 1 0.024 6 0.009 8 0.015 7 0.010 0 0.007 8—0.020 6 0.013 7 0.012 6反式对单香豆酰酒石酸酯X 90.009 1 0.024 6 0.009 8 0.015 7 0.010 0 0.007 8—0.020 7 0.013 7 0.012 6单阿魏酰酒石酸酯X 10——0.006 8—0.004 9——0.004 9—对羟基肉桂酸X 110.225 1 0.144 4 0.096 1 0.126 3 0.095 1 0.124 4 0.005 4 0.388 5 0.129 4 0.130 8咖啡酸X 120.274 0 0.247 6 0.110 2 0.140 0 0.089 2 0.105 9 0.073 9 0.174 3 0.140 2 0.147 3阿魏酸X 13——0.005 7——0.003 2 0.001 4 0.003 5 0.002 0 0.005 9芥子酸X 14—0.012 1 0.003 7 0.006 4—0.005 3 0.004 7 0.008 4 0.008 5 0.015 5顺式乌头酸X 150.064 3 0.061 7 0.041 7 0.027 9 0.034 6 0.036 5 0.029 8 0.100 5 0.032 1 0.027 3反式乌头酸X 160.064 8 0.061 7 0.041 7 0.027 9 0.034 6 0.036 5 0.029 8 0.100 9 0.032 1 0.027 3水杨酸X 170.153 8 0.103 1 0.088 1 0.083 6 0.096 3 0.107 1 0.004 6 0.101 8 0.100 4 0.086 3原儿茶酸X 180.271 9 0.019 6 0.241 2 0.270 1 0.144 6 0.296 4 0.087 0 0.598 1 0.012 7 0.506 8香草酸X 190.006 7 5.541 0 0.006 3 0.012 9 0.012 3 0.016 7 0.003 9 0.008 6 2.877 2 0.014 8 GAX 203.076 2 5.607 0 3.101 7 4.530 1 2.602 2 2.988 9 1.854 9 6.478 4 2.911 4 5.745 6丁香酸X 210.019 8 0.009 5 0.012 1 0.012 7 0.005 7 0.007 0 0.004 5 0.022 2 0.006 4 0.013 4没食子酰基葡萄糖类X-氧基-没食子酰基葡萄糖X 220.111 0 0.146 7 0.085 1 0.118 8 0.085 1 0.071 9 0.063 0 0.183 8 0.115 4 0.100 4 X-氧基-没食子酰基葡萄糖X 230.111 0 0.146 7 0.085 1 0.118 8 0.085 1 0.071 9 0.063 0 0.183 8 0.115 4 0.100 4 X-氧基-没食子酰基葡萄糖X 240.111 0 0.146 7 0.085 1 0.118 8 0.085 1 0.071 9 0.063 0 0.183 8 0.115 4 0.100 4 X-氧基-双没食子酰基葡萄糖X 250.007 2 0.008 9 0.003 8 0.015 9 0.004 9 0.005 5—0.013 4 0.008 5 0.016 6 X-氧基-双没食子酰基葡萄糖X 260.007 2 0.008 9 0.003 8 0.015 9 0.004 9 0.005 5—0.013 4 0.008 5 0.016 6 X-氧基-双没食子酰基葡萄糖X 270.007 2 0.008 9 0.003 8 0.015 9 0.004 9 0.005 5—0.013 4 0.008 5 0.016 6 X-氧基-双没食子酰基葡萄糖X 280.007 2 0.008 9 0.003 8 0.015 9 0.004 9 0.005 5—0.013 4 0.008 5 0.016 6 X-氧基-双没食子酰基葡萄糖X 290.007 2 0.008 9 0.003 8 0.015 9 0.004 9 0.005 5—0.013 4 0.008 5 0.016 6 1,3,6-三氧基-没食子酰基葡萄糖X 30—0.021 8 0.009 4 0.013 9 0.016 1 0.010 6—0.016 5 0.012 6 0.011 3 X-氧基-三没食子酰基葡萄糖X 31—0.021 8 0.009 4 0.013 9 0.016 1 0.010 6—0.016 7 0.012 6 0.011 3羟基桂皮奎宁酯类没食子酰基奎宁酸X 329.536 6 11.242 1 4.572 0 7.536 6 4.350 7 5.252 3 4.513 9 12.027 2 5.332 1 7.365 5没食子酰基奎宁酸X 331.412 8 1.895 1 1.102 2 1.193 3 1.061 6 1.173 9 0.894 3 3.649 9 1.512 9 1.163 0香豆酰奎宁酸X 344.412 5 4.302 7 1.756 8 2.122 8 1.436 3 1.826 2 0.005 2 7.730 6 2.444 2 2.375 6香豆酰奎宁酸X 350.813 1 0.382 9 0.345 7 0.728 2 0.319 2 0.334 2 0.005 9 0.787 8 0.356 3 0.832 0香豆酰奎宁酸X 360.096 2 0.086 3 0.096 3 0.165 4 0.093 5 0.104 3 0.005 1 0.222 4 0.107 5 0.217 5香豆酰奎宁酸X 370.803 2 0.382 9 0.345 7 0.728 2 0.319 2 0.334 2 0.005 9 0.796 0 0.356 3 0.832 0香豆酰奎宁酸X 380.097 2 0.086 3 0.096 3 0.165 4 0.093 5 1.419 6 0.005 1 0.222 4 0.107 5 1.734 1 5-咖啡酰奎宁酸X 391.298 1 3.316 4 2.066 8 2.649 8 1.152 1 1.486 8 0.525 9 1.865 1 1.895 1 1.816 2 3-咖啡酰奎宁酸X 401.298 1 3.316 4 2.066 8 2.649 8 1.152 1 1.486 8 0.525 9 1.865 1 1.895 1 1.816 2咖啡酰奎宁酸X 415.971 3 2.820 6 1.403 0 2.171 6 1.462 5 1.812 0 0.883 7 7.056 5 2.035 0 1.826 7咖啡酰奎宁酸X 421.298 1 3.316 4 2.066 8 2.649 8 1.152 1 1.486 8 0.525 9 1.856 5 1.895 1 1.816 2儿茶素类GCX 432.090 6 3.897 9 2.323 4 1.851 7 1.695 5 1.599 3 0.938 9 2.955 1 2.208 2 1.836 1 EGCX 442.090 6 3.897 9 2.323 4 1.851 7 1.695 5 1.599 3 0.938 9 2.997 9 2.208 2 1.836 1儿茶素X 451.098 5 2.409 0 1.745 7 1.312 4 1.402 5 1.323 8 0.031 4 1.497 7 1.542 0 1.333 6 ECX 461.098 5 2.409 0 1.745 7 1.312 4 1.402 5 1.323 8 0.031 4 1.497 7 1.542 0 1.333 6表没食子儿茶素没食子酸酯X 470.229 2 3.927 4 1.165 3 1.426 6 0.925 9 0.944 1 0.005 2 3.525 2 1.378 4 1.268 2没食子儿茶素没食子酸酯X 480.229 2 3.927 4 1.165 3 1.426 6 0.925 9 0.944 1 0.005 2 3.589 3 1.378 4 1.268 2表儿茶素没食子酸酯X 490.122 6 1.038 7 0.529 0 0.614 0 0.354 4 0.345 5 0.006 8 0.159 6 0.419 6 0.487 3儿茶素没食子酸酯X 500.122 6 1.038 7 0.529 0 0.614 0 0.354 4 0.345 5 0.006 8 0.159 6 0.419 6 0.487 3表阿夫儿茶精X 510.029 5 0.253 7 0.280 8 0.271 1 0.187 2 0.156 2 0.000 6 0.037 6 0.184 2 0.204 2

续表3 %

注：—.未检出。

化合物种类化合物名称编号贮藏时间/a 12345678910儿茶素苷类没食子儿茶素-3,3’-双氧基-没食子酸酯X 520.009 8 0.007 2 0.008 6 0.006 3 0.006 6 0.008 2 0.008 6 0.017 0 0.005 8 0.006 0表没食子儿茶素-3,3’-双氧基-没食子酸酯X 530.009 9 0.007 2 0.008 6 0.006 3 0.006 6 0.008 2 0.008 6 0.017 0 0.005 8 0.006 0表阿夫儿茶精-3-氧基-没食子酸酯X 540.013 5 0.078 0 0.031 9 0.026 6 0.022 5 0.028 3 0.017 1 0.021 0 0.018 2 0.026 9花青素类原花青素B 1X 550.429 0 0.798 4 0.013 9 0.483 5 0.390 4 0.344 0 0.114 8 0.655 2 0.510 3 0.425 8原花青素B 2X 560.430 0 0.798 4 0.608 8 0.483 5 0.390 4 0.344 0 0.114 8 0.655 2 0.510 3 0.425 8茶黄素类茶黄酸X 570.001 0 0.024 3 0.010 3 0.005 9 0.011 5 0.003 0 0.003 0 0.003 9 0.009 5 0.005 1茶黄素X 580.002 7 0.011 4 0.005 0 0.003 6 0.004 9——0.002 5 0.004 3 0.005 1茶黄素-3-没食子酸酯X 59—0.004 4 0.000 7 0.001 4 0.000 7——0.000 7 0.002 3茶黄素-3,3’-没食子酸酯X 600.003 5 0.001 6 0.002 1 0.000 8 0.001 1——0.003 1 0.002 3 0.001 3茶黄素-3’-没食子酸酯X 61—0.004 4 0.000 7 0.001 4 0.000 7——0.000 7 0.002 3山柰酚类山柰酚-3-氧基-葡萄糖基鼠李糖半乳糖苷X 620.011 8 0.594 0 0.661 9 0.433 6 0.448 2 0.443 2—0.024 3 0.491 7 0.379 9山柰酚-3-氧基-葡萄糖基鼠李糖葡萄糖苷X 630.011 9 0.594 0 0.661 9 0.433 6 0.448 2 0.443 2—0.024 4 0.491 7 0.379 9山柰酚-3-氧基-鼠李糖半乳糖苷X 640.151 7 1.907 6 1.438 4 1.194 0 1.082 6 0.876 3 0.025 6 0.281 0 1.311 3 0.944 4山柰酚-3-氧基-芸香糖苷X 650.151 7 1.907 6 1.438 4 1.194 0 1.082 6 0.876 3 0.025 6 0.281 0 1.311 3 0.944 4山柰酚-3-氧基-半乳糖苷X 660.229 5 2.298 5 1.755 8 1.551 0 1.236 6 0.968 7 0.000 5 0.489 0 1.475 9 1.508 6山柰酚-3-氧基-葡萄糖苷X 670.229 5 2.298 5 1.755 8 1.551 0 1.236 6 0.968 7 0.000 5 0.489 0 1.475 9 1.508 6槲皮素苷类槲皮素-3-氧基-葡萄糖基鼠李糖半乳糖苷X 680.019 3 0.612 2 0.575 6 0.393 2 0.346 7 0.411 7—0.019 7 0.040 7 0.388 0槲皮素-3-氧基-葡萄糖基鼠李糖葡萄糖苷X 690.019 5 0.612 2 0.575 6 0.393 2 0.346 7 0.411 7—0.019 7 0.040 7 0.388 0槲皮素-3-氧基-鼠李糖半乳糖苷X 700.278 5 3.983 7 3.071 1 2.080 0 2.048 7 1.234 5 0.000 6 0.439 7 2.481 9 1.856 1槲皮素-3-氧基-芸香糖苷X 710.278 5 3.983 7 3.071 1 2.080 0 2.048 7 1.234 5 0.000 6 0.439 7 2.481 9 1.856 1槲皮素-3-氧基-半乳糖苷X 720.260 5 2.031 0 1.728 3 1.298 8 1.095 9 0.873 4 0.002 2 0.538 9 1.555 1 0.927 9槲皮素-3-氧基-葡萄糖苷X 730.260 5 2.031 0 1.728 3 1.298 8 1.095 9 0.873 4 0.002 2 0.538 9 1.555 1 0.927 9槲皮素-3-氧基-鼠李糖苷X 740.039 8 0.184 8 0.088 2 0.119 3 0.071 8 0.059 3—0.037 1 0.078 7 0.143 2异鼠李素-3-氧基-葡萄糖苷X 750.005 1 0.076 0 0.047 7 0.043 3 0.038 8 0.024 4—0.012 6 0.038 1 0.037 1槲皮素-4’-氧基-葡萄糖苷X 760.261 3 2.031 0 1.728 3 1.298 8 1.095 9 0.873 4 0.002 2 0.538 9 1.555 1 0.927 9槲皮素-3-氧基-葡萄糖苷酸X 770.000 9 0.001 2 0.016 0 0.000 7—0.000 6—0.001 7 0.001 6 0.000 6杨梅酮苷类杨梅素-3-氧基-鼠李糖葡萄糖苷X 780.020 5 0.423 4 0.412 8 0.282 0 0.284 8 0.217 9 0.000 6 0.023 8 0.373 9 0.260 0杨梅素-3-氧基-半乳糖苷X 790.082 8 1.326 1 1.247 5 0.722 3 0.979 7 0.759 5—0.138 4 1.130 2 0.545 6杨梅素-3-氧基-葡萄糖苷X 800.083 6 1.326 1 1.247 5 0.722 3 0.979 7 0.759 5—0.138 4 1.130 2 0.545 6杨梅素-3-氧基-鼠李糖苷X 810.000 6 0.010 5 0.015 4 0.015 1 0.012 4 0.015 3—0.003 2 0.013 7 0.008 6氨基酸类赖氨酸X 820.002 8 0.001 0 0.001 4 0.000 4 0.001 2 0.001 6 0.000 4 0.002 4 0.001 2 0.002 7组氨酸X 830.015 6 0.022 9 0.019 9 0.011 8 0.020 2 0.016 8 0.007 1 0.025 0 0.019 3 0.007 8精氨酸X 840.953 6 1.224 0 0.900 0 0.751 9 0.844 2 0.909 6 0.302 2 1.522 4 0.807 3 0.618 8胱氨酸X 850.001 2 0.002 3 0.001 4 0.001 6 0.002 9 0.002 2 0.000 6 0.001 9 0.001 5 0.002 2甘氨酸X 860.000 2 0.000 2—0.000 1 0.000 1—0.000 1 0.000 1 0.000 1 0.000 2丝氨酸X 870.011 1 0.007 5 0.003 1 0.002 2 0.004 3 0.004 5 0.004 7 0.010 5 0.004 0 0.019 4天冬酰胺X 880.056 5 0.049 0 0.032 0 0.040 0 0.023 2 0.029 5 0.022 6 0.062 7 0.030 2 0.036 3天冬氨酸X 890.042 5 0.040 1 0.011 5 0.014 3 0.012 7 0.014 5 0.019 4 0.049 1 0.015 4 0.012 2丙氨酸X 900.022 0 0.005 9 0.004 6 0.002 3 0.003 8 0.004 4 0.003 9 0.013 2 0.006 4 0.002 2谷氨酰胺X 910.002 8 0.001 0 0.001 4 0.000 4 0.001 2 0.001 6 0.000 4 0.002 4 0.001 2 0.002 7谷氨酸X 920.059 2 0.001 8 0.045 3 0.014 2 0.035 3 0.031 2 0.024 0 0.073 9 0.004 7 0.016 8 γ-氨基丁酸X 930.020 4 0.016 7 0.022 4 0.013 9 0.011 0 0.016 2 0.004 5 0.022 5 0.009 9 0.012 6苏氨酸X 940.011 1 0.012 5 0.005 9 0.006 0 0.006 0 0.005 9 0.005 3 0.015 2 0.007 4 0.004 4脯氨酸X 950.229 6 0.295 2 0.153 8 0.180 4 0.181 2 0.232 1 0.109 5 0.335 0 0.173 7 0.121 0缬氨酸X 960.199 9 0.091 4 0.136 6 0.067 8 0.103 9 0.124 3 0.100 4 0.275 2 0.088 9 0.035 0茶氨酸X 970.953 6 1.224 0 0.900 0 0.751 9 0.844 2 0.909 6 0.304 3 1.522 4 0.807 3 0.618 8蛋氨酸X 980.004 3 0.002 1 0.004 0 0.158 4 0.220 2 0.005 6 0.001 5 0.007 0 0.005 0 0.002 1异亮氨酸X 990.383 4 0.176 4 0.197 2 0.139 3 0.193 6 0.223 9 0.162 1 0.471 4 0.232 7 0.108 2亮氨酸X 1000.385 6 0.176 4 0.197 2 0.091 6 0.112 9 0.223 9 0.162 1 0.471 4 0.232 7 0.108 2酪氨酸X 1010.187 7 0.195 9 0.164 0 0.126 5 0.155 9 0.170 1 0.116 3 0.271 1 0.148 0 0.117 3苯丙氨酸X 1021.892 3 0.962 4 2.011 8 0.891 1 1.828 9 2.206 0 0.822 4 2.979 8 2.037 3 0.665 9 S-甲基蛋氨酸X 1030.185 3 0.101 0 0.211 0 0.090 2 0.182 4 0.245 0 0.080 0 0.325 4 0.182 9 0.063 6色氨酸X 1040.063 5 0.056 0 0.030 1 0.030 5 0.038 3 0.043 0 0.016 7 0.062 5 0.037 8 0.025 7生物碱类可可碱X 1050.398 8 0.267 8 0.176 4 0.117 3 0.222 3 0.222 9 0.222 7 0.441 0 0.244 5 0.125 3茶叶碱X 1060.005 2 0.009 5 0.008 4 0.035 2 0.007 4 0.007 3 0.000 5 0.010 7 0.007 1 0.049 9咖啡碱X 1073.412 5 6.231 5 2.707 7 3.532 8 3.281 9 3.425 3 0.023 0 4.127 9 3.279 5 4.278 9

不同贮藏时间普洱生茶水提物经UPLC-MS/MS分析得到107 种物质见表3。被检测到的物质共分为8 大类：有机酸类化合物（5 种）、非黄酮类酚酸化合物（16 种）、没食子酰基葡萄糖类化合物（10 种）、羟基桂皮奎宁酯类化合物（11 种）、黄烷醇类化合物（19 种，其中儿茶素类9 种、儿茶素苷类3 种、花青素类2 种、茶黄素类5 种）、黄酮苷类化合物（20 种，其中山柰酚类6 种、槲皮素苷类10 种、杨梅酮苷类4 种）、氨基酸类化合物（23 种）、生物碱（3 种）。

由表3可知，被检出物质中相对含量较高的物质：机酸类（柠檬酸）、非黄酮类酚酸类（没食子酸（gallic acid，GA））、羟基桂皮奎宁酯类（没食子酰基奎宁酸、香豆酰奎宁酸和咖啡酰奎宁酸）、儿茶素类（GC、EGC、儿茶素和EC）、氨基酸类（Phe和Thea）、生物碱类（咖啡碱）。

随着贮藏时间的延长相对含量呈增加趋势的化合物：非黄酮类酚酸类（顺、反式单咖啡酰酒石酸酯、GA和丁香酸）、羟基桂皮奎宁酯类（X-氧基-香豆酰奎宁酸）、儿茶素苷类（表阿夫儿茶精-3-氧基-没食子酸酯）、山柰酚类（山柰酚-3-氧基-鼠李糖半乳糖苷、山柰酚-3-氧基-芸香糖苷、山柰酚-3-氧基-半乳糖苷和山柰酚-3-氧基-葡萄糖苷）、槲皮素苷类（槲皮素-3-氧基-葡萄糖基鼠李糖半乳糖苷、槲皮素-3-氧基-葡萄糖基鼠李糖葡萄糖苷、槲皮素-3-氧基-鼠李糖半乳糖苷、槲皮素-3-氧基-芸香糖苷、槲皮素-3-氧基-鼠李糖苷和异鼠李素-3-氧基-葡萄糖苷）、生物碱类（茶叶碱）。

随着贮藏时间的延长相对含量呈降低趋势的化合物：儿茶素苷类（没食子儿茶素-3,3’-双氧基-没食子酸酯和表没食子儿茶素-3,3’-双氧基-没食子酸酯）、氨基酸类（组氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和S-甲基蛋氨酸）、生物碱类（可可碱）。

仅在部分贮藏时间检测到的化合物：非黄酮类酚酸类（单阿魏酰酒石酸酯、阿魏酸和芥子酸）、没食子酰基葡萄糖类（三没食子酰基葡萄糖）、茶黄素类（茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3,3’-双没食子酸酯和茶黄素-3’-没食子酸酯）、槲皮素苷类（槲皮素-3-氧基-葡萄糖苷酸）。

不同贮藏时间普洱生茶水提物经UPLC-MS/MS检测得出的化合物较多（107 种），故采用PCA便于筛选出与贮藏时间相关的特征性成分。PCA是一种多元数据统计分析方法，能在保持原有数据主要信息条件下，以更少的变量代替原有变量，起到降低分析难度和降维的作用 [25]。以10 个年份UPLC-MS/MS检测得到的107 种成分构成的10×107矩阵进行PCA，如表4所示。前4 个主成分的累积贡献率达86.52%，表明前4 个主成分可以基本反映全部成分变量的信息 [26]。前4 个主成分的特征值依次为40.12、33.16、11.84、7.46。其中PC1可解释全部成分变量信息的37.49%；PC2可解释30.99%；PC3可解释11.06%；PC4可解释6.97%。通过降维，将原来的107 个成分变量转化为4 个新的变量指标，降低了分析的复杂性，且基本保持了原有成分变量的信息。根据4 个主成分的特征向量，可以得到原各成分变量分别对4 主成分的贡献率。

PC1中，各成分变量对其贡献率较高的依次为X 8、X 9、X 56、X 44、X 43、X 4、X 107、X 47、X 48、X 45以及X 46；PC2中，对其贡献率较高的依次为X 99、X 100、X 62、X 63、X 78、X 96、X 53、X 52、X 51、X 41、X 64、X 65、X 105、X 92、X 79、X 80、X 70、X 71、X 66以及X 67；PC3中，对其贡献率较高的依次为X 106、X 25、X 26、X 27、X 28、X 29、X 83、X 87、X 37、X 35、X 36、X 38、X 14、X 102、X 103、X 86、X 18以及X 6；PC4中，对其贡献率较高的依次为X 86、X 13、X 5、X 19、X 81、X 18、X 103、X 102、X 77、X 36、X 89、X 2、X 38、X 12、X 59、X 61、X 93以及X 54。

综上分析可知，不同贮藏时间普洱生茶水提物中贡献性大且有较明显变化规律的物质有26 种，可作为不同贮藏时间普洱生茶水提物的特征性成分。这26 种化合物分别为有机酸类（柠檬酸）、非黄酮类酚酸（顺式单咖啡酰酒石酸酯、反式单咖啡酰酒石酸酯和GA）、没食子酰基葡萄糖类（5 种X-氧基-双没食子酰基葡萄糖）、儿茶素类（GC、EGC、儿茶素、EC和表阿夫儿茶精）、儿茶素苷类（没食子儿茶素-3,3’-双氧基-没食子酸酯、表没食子儿茶素-3,3’-双氧基-没食子酸酯和表阿夫儿茶精-3-氧基-没食子酸酯）、氨基酸类（精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、茶氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸）、生物碱类（可可碱和咖啡碱）。

以10 个年份普洱生茶水提物经UPLC-MS/MS检测得到的107 种化合物相对含量为指标，利用欧氏距离的平方为度量准则，以组间连结法为组群合并准则，对10 个年份普洱生茶水提物进行系统CA，结果见图6。当横坐标距离为15时，可将10 个年份聚为3 类。贮藏8 a的为1 类；贮藏1 a和2 a的为1 类；剩余年份聚为1 类。可总结出，贮藏1～2 a的普洱生茶品质接近；贮藏3 a时，生茶成分和品质将发生一定的改变；贮藏时间为4～7 a的生茶成分和品质接近，聚在一起；贮藏时间为9～10 a的生茶成分和品质与之前贮藏时间的生茶有一定的差异，其聚在一起。由图6可知，普洱生茶在贮藏的第3年和第8年生化成分和品质都发生了较大的改变，且贮藏4～7 a和9～10 a都分别聚在一起，表明虽然贮藏时间的延长会导致普洱生茶品质发生改变，但其品质在一定贮藏时间范围内保持稳定。普洱生茶是由晒青毛茶经特殊工艺加工而成，在贮藏的过程中，其香气CA、滋味等都发生了变化，随着贮藏时间的延长，普洱生茶品质得到提升 [17]。通过CA，能较好地将不同贮藏时间的普洱生茶水提物样进行分类，可考虑扩大普洱生茶贮藏时间，获得贮藏时间更长的普洱生茶年份分类基础数据，为普洱生茶贮藏时间的鉴定提供理论依据。

3 结论

本实验以同公司、同批号、不同贮藏时间的普洱生茶为原料，经测定分析得以下结论：贮藏过程中，普洱生茶的含水量变化不大，表明普洱生茶贮藏得当，吸湿不明显。随着贮藏时间的延长，茶多酚、儿茶素和游离氨基酸的含量呈下降趋势；黄酮的含量呈增加趋势；可溶性总糖和咖啡碱无明显变化规律。由于6 类成分包含物质多，因此不能评价和筛选出不同贮藏时间普洱生茶水提物的特征性成分。普洱生茶水提物经UPLC-MS/MS检测，共检出107 种物质；通过PCA得出不同贮藏时间普洱生茶水提物的特征性成分26 种，包括柠檬酸、顺式单咖啡酰酒石酸酯、反式单咖啡酰酒石酸酯、GA、5 种X-氧基-双没食子酰基葡萄糖、GC、EGC、儿茶素、EC、表阿夫儿茶精、没食子儿茶素-3,3’-双氧基-没食子酸酯、表没食子儿茶素-3,3’-双氧基-没食子酸酯、表阿夫儿茶精-3-氧基-没食子酸酯、Arg、Ala、Val、Thea、Ile、Leu、Phe、可可碱和咖啡碱。

经系统CA发现，不同贮藏时间的普洱生茶水提物样能较好地被分类聚类；其中贮藏时间达到3 a或8 a时普洱生茶品质将发生较为明显的变化，表明贮藏时间虽会导致普洱生茶品质发生改变，但在一定的贮藏时间范围内，其品质相对稳定。

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Characteristic Components of Aqueous Extracts of Raw Pu-erh Tea with Different Storage Times

ZENG Liang 1,2,3, TIAN Xiaojun 1, LUO Liyong 1,3, GUAN Xingli 2,4, GAO Linrui 2,4,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. TAETEA Group, Kunming 650217, China; 3. Tea Research Institute, Southwest University, Chongqing 400716, China; 4. Yunnan Pu’er Tea Fermentation Engineering Research Center, Kunming 650217, China)

Abstract：Aqueous extracts of raw Pu-erh tea (7542) samples from the same batch obtained from the same producer with different storage times were prepared by vacuum freeze drying in this study and their characteristic components were detected by spectrophotometry and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The experimental data were analyzed with principal component analysis (PCA) and cluster analysis (CA) to establish the characteristic components of Pu-erh tea aqueous extracts and a dendrogram for cluster analysis of raw Pu-erh tea samples stored for different times. The results showed that the contents of tea polyphenols, catechins and free amino acid of raw Puerh tea aqueous extracts decreased gradually with storage time of Pu-erh tea while flavones increased; the contents of total soluble sugars and caffeine showed an irregular fluctuation. A total of 107 substances were detected from raw Puerh tea aqueous extracts with different storage times by UPLC-MS/MS. Using PCA, the 26 characteristic components of raw Pu-erh tea aqueous extracts were determined to include citric acid, gallic acid, epicatechin, theanine, caffeine, and epigallocatechin gallate. Cluster analysis results indicated that the clustering of raw Pu-erh tea samples changed significantly after storage for 3 years and 8 years and that aqueous extracts of raw Pu-erh tea samples with similar storage times were more likely to be clustered.

Key words：raw Pu-erh tea; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); characteristic components; multivariate statistical analysis

基金项目：大益博士后项目年份茶研究项目（DYBX004）；中央高校基本科研业务费专项（XDJK2013B036）；特质性农产品营养组分识别与验证评估项目（GJFP201601501）

作者简介：曾亮（1980—），女，副教授，博士，主要从事茶资源开发利用研究。E-mail：zengliangbaby@126.com

*通信作者：高林瑞（1968—），男，高级工程师，硕士，主要从事茶叶加工、微生物及代谢化学研究。E-mail：gaolinrui@126.com

曾亮, 田小军, 罗理勇, 等. 不同贮藏时间普洱生茶水提物的特征性成分分析[J]. 食品科学, 2017, 38(2): 198-205. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702032. http://www.spkx.net.cn

ZENG Liang, TIAN Xiaojun, LUO Liyong, et al. Characteristic components of aqueous extracts of raw Pu-erh tea with different storage times[J]. Food Science, 2017, 38(2): 198-205. (in Chinese with English abstract)

不同贮藏时间普洱生茶水提物的特征性成分分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论