熏煮火腿中志贺氏菌的热失活特性

张佩佩，李苗云*，赵改名，崔文明，高晓平，柳艳霞，赵莉君，王亚飞

（河南农业大学食品科学技术学院，河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室，河南郑州 450002）

摘要：为了研究志贺氏菌不同菌株在熏煮火腿中热失活规律，以55、63 ℃对接种10 8CFU/g志贺氏菌的熏煮火腿进行热处理，测定处理后样品中志贺氏菌的残存菌体浓度。应用Logistic模型和3rd degree polynomial模型拟合在两种温度下志贺氏菌的动力学模型，用D值（decimal reduction time）表示志贺氏菌在熏煮火腿中的耐热情况。结果表明：11 株志贺氏菌的热失活曲线运用3rd degree polynomial拟合较好，相关系数均在0.98以上。志贺氏菌不同菌株的D值不同，55 ℃条件下志贺氏菌在熏煮火腿中的D值为4.46～10.66 min，63 ℃条件下D值为0.48～3.22 min。不同菌株之间抗热性存在差异，其中菌株S-5的耐热性最强，S-6最弱。

关键词：志贺氏菌；熏煮火腿；热失活；动力学模型；D值

志贺氏菌（Shigella）是一种不形成芽孢的革兰氏阴性、兼性厌氧杆菌，是肠杆菌科感染的病原菌之一 [1]。它能够通过侵袭大肠引起患者典型菌痢症状，如发热、腹痛、腹泻等 [2]。据统计，2005年全球的人类痢疾病例有8 000万例，导致约70万人死亡 [3]。志贺氏菌属在我国感染性腹泻病原菌中居首位，志贺氏菌主要由食用未烹调的食物引起，如含碳水化合物和蛋白的沙拉 [4]。熏煮火腿是以生鲜猪肉或者鸡肉为原料，常压下经蒸煮和熏烤的火腿类熟肉制品。它属于低温肉制品的范畴，以营养丰富、易消化吸收、食用方便、风味独特以及便于携带和保存而深受广大消费者的青睐 [5]。食品杀菌的方法很多，包括物理、化学和生物法等。热处理是商业应用的标准灭活方式，它是食品工业最经济有效、最简便和使用最广泛的杀菌方法 [6]。在微生物杀菌研究中，预测微生物学结合化学、微生物学、统计学、数学以及计算机技术研究和建立不同环境因素影响下的失活参数模型，能够快速评估微生物残存情况,避免了传统方法的繁琐和滞后性，已获得了广泛的应用 [7-8]。

细菌菌株之间存在耐热性差异，其热失活曲线并不严谨遵循对数线性关系，在拟合细菌热失活规律时，经常出现细菌对数图凸形、凹形以及S形曲线等一系列非线性的现象 [9-12]。多项式拟合模型已经在生物学、医学、卫生学等诸多领域都具有广泛的应用 [13]，董庆利等 [14]将此模型应用于失活模型，发现可以很好地拟合气单胞菌的失活曲线。目前，有关单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等食源性致病菌的热失活的研究已有报道 [15-17]，而有关志贺氏菌热失活方面的研究鲜见报道，为了达到消毒且不损害食品品质的目的，工业上常用的灭菌方法是巴氏杀菌（温度一般在60～82 ℃），但是巴氏杀菌热处理程度比较低，杀菌后容易造成微生物的残存。本实验研究了2 种温度热处理对熏煮火腿中志贺氏菌不同菌株的影响，用3rd degree polynomial拟合熏煮火腿中志贺氏菌不同菌株的非线性失活曲线，建立了熏煮火腿中志贺氏菌不同菌株的热失活模型，用D值（decimal reduction time）比较了志贺氏菌在熏煮火腿中的耐热性情况，为熏煮火腿中志贺氏菌的控制提供理论参考。

1 材料与方法

11 株志贺氏菌，均为河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室从肉中分离并经过国标法生化鉴定、Vitek测定以及分子鉴定，－80 ℃甘油管保存。

营养肉汤（nutrient broth，NB）、营养琼脂（nutrient agar，NA）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（xylose lysine deoxycholate salt agar，XLD）青岛高科园海博生物技术有限公司；氯化钠（分析纯）天津市瑞金特化学品有限公司。

HVE-50高压蒸汽灭菌锅日本Hirayama公司；拍打式均质器法国AES Chemunex公司；SW-CJ-2F超净工作台苏州安泰空气计数有限公司；真空包装机温州市大江真空包装机械有限公司；JA2003N电子天平上海菁海仪器有限公司；DHP-9272型电热恒温培养箱、精密鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司；HH-501数显超级恒温水浴金坛市杰瑞尔电器有限公司；THZ-C台式恒温振荡器太仓市华美生化仪器厂。

取同一生产日期的熏煮火腿，紫外线照射30 min后去除外皮，无菌条件下将其绞碎，以每份（25±0.5） g进行真空封装。－25 ℃条件下保存，使用前置于4 ℃条件下解冻。

无菌操作条件下，将储存于－80 ℃条件下的志贺氏菌接种到NA平板上，37 ℃条件下培养24 h，挑取典型菌落至无菌的NB培养基中，37 ℃、150 r/min摇床培养至稳定期（菌体浓度约10 9CFU/mL）。得到的稳定期菌液稀释至10 8CFU/mL备用。

参考文献：[18]的方法，无菌操作取2.5 mL 1.3.2节制备的菌悬液，置于1.3.1节无菌真空袋样品中并压成均匀片状，用真空包装机0.1 MPa抽真空，并封口并使其袋子厚度小于1 mm，以确保传热的统一。放在（37±1） ℃的恒温培养箱培养18 h后备用。每一组温度时间的组合重复3 次。

表1 热处理温度、时间及时间间隔
Table1 Temperature, time and time intervals of heat treatments

处理温度/℃处理时间/min时间间隔/min 55805 63213

接种后的样品放置在预热的恒温循环水浴锅中进行热处理，水浴锅的设定温度分别为55、63 ℃，加热时间0.5～80 min（表1）。加热时将样品完全浸没热水中，按照预先设定的时间间隔，定时取出样品进行测定。热处理后的样品应立即放入预先准备好的冰水中，以阻止其继续进行热失活过程。从设定温度冷却至室温的时间小于10 s。

将热处理后的样品在洁净无菌的环境条件下，加入225 mL 0.85%无菌NaCl溶液，在均质器中拍打2 min，使之与样品混合均匀，获得1∶10（m/V）的悬浮液。拍打后进行梯度稀释，将样品原液或梯度稀释液涂布在刚配置的XLD培养基上。然后，放至37 ℃恒温培养箱培养，48 h后计数志贺氏菌菌落数目，计算菌体浓度。

热失活模型利用CurveExpert软件建立Logistic模型（式（1））和3rd degree polynomial模型（式（2））拟合，选择最合适的模型得出志贺氏菌不同菌株在熏煮火腿中热失活曲线，并得到相应的模型参数。

式中：y为志贺氏菌的残存菌体浓度（lg（CFU/g））；x为热处理时间/min；A 1、A 2、x 0、p、a、b、c、d为模型参数。

应用建立的志贺氏菌的热失活动力学模型求得72 ℃条件下的预测值，与在72 ℃条件下热失活实验中试剂检测的志贺氏菌数量进行比较，采用准确度（A f）和偏差度（B f）来评价所建模型的可靠性 [19]，分别按式（3）和（4）计算。

式中：N 实测为试验实际测得的志贺氏菌菌体浓度（lg（CFU/g））；N 预测为应用热失活模型预测得到的同一时间点的志贺氏菌菌体浓度（lg（CFU/g））；n为实验次数。

D值是指在某一温度下，活菌数死亡90%所需要的时间，即细菌残存曲线经一个对数周期所需的时间。D值是细菌死亡率的倒数，D值越大死亡速率越小，该菌的耐热性越强。用Linear模型拟合热致死曲线式中，t为热处理时间，x表示加热时间，y表示细菌活细胞的对数值，可得出该函数的斜率（k）的负倒数为所求的D值，即D＝－1/k。

采用SPSS 17.0软件进行数据处理与统计分析，所有数据均为3 个平行样品分别测定3 次的平均数，数据均以

±s表示。

2 结果与分析

图1 志贺氏菌不同菌株熏煮火腿中的热失活曲线
Fig. 1 Survival curves of different Shigella strains in smoked cooked ham

为了研究志贺氏菌不同菌株在熏煮火腿中的热失活情况，本实验选择了55 ℃和63 ℃ 2 个温度热处理熏煮火腿。如图1所示，志贺氏菌不同菌株的热失活情况有所不同，但是样品进行热处理4 min时，志贺氏菌的热杀菌效果显著，这与志贺氏菌刚进入热刺激环境不适应有关，随着热处理时间的延长，残菌量慢慢减少直至全部死亡。

表2 志贺氏菌不同菌株的3rd degree polynomial型和Logistic模型在两种温度下的相关系数
Table2 Correlation coefficients of the 3rd degree polynomial model and the logistic model for differentShiggeellllaa strains at two temperatures

菌株55 ℃63 ℃3rd degree polynomial模型Logistic模型3rd degree polynomial模型Logistic模型S-10.9930.9590.9990.994 S-20.9960.917 0.9940.944 S-30.9900.9210.9890.945 S-40.9890.9530.9910.944 S-50.9930.9480.9990.936 S-60.9980.9610.9990.938 S-70.9960.9510.9980.971 S-80.9950.9670.9980.972 S-90.9900.9610.9960.973 S-100.9960.9680.9940.938 S-110.978 0.9280.9950.949

志贺氏菌不同菌株在熏煮火腿的3rd degree polynomial模型在不同温度条件下的拟合很好，相关系数均在0.98以上；Logistic模型拟合也较好，相关系数均在0.88以上。由表2可知，志贺氏菌不同菌株在熏煮火腿中的热失活情况用3rd degree polynomial模型描述比Logistic模型拟合相关性更好，因此选用了3rd degree polynomial模型建立热失活模型。

图2 多项式拟合志贺氏菌不同菌株在熏煮火腿中的热失活规律
Fig. 2 Survival curves of different Shigella strains in the smoked cooked ham at 55 and 63 ℃ as modeled by regression for 3rd degree polynomial fitting models

将22 组实验数据进行3rd degree polynomial模型拟合，拟合的热失活曲线如图2所示。通常来说，残存菌体浓度的对数值随着加热时间的延长而减少。同时，细菌死亡速率随着温度的升高加快，温度越高，杀死细菌所需的时间越短。由图2可知，热失活曲线并不是直线，而是普遍向下凹，这说明随着加热时间的延长，志贺氏菌失活速率也跟着加快。此外从图2还可看出，早期志贺氏菌菌体浓度变化不明显，当加热时间超过一定阈值时，志贺氏菌的失活速率才随时间变化开始加快。这说明志贺氏菌的菌体浓度在刚开始加热时并没有马上减少，这种现象可能与样品的形状大小有关 [20]。在初始加热时间，温度对于中心位置存在的志贺氏菌并没有很大影响。而且本实验的进行过程中已经尽量地减少样品的厚度（＜1 mm），且在较低温度条件下（55 ℃和63 ℃），样品检测时间明显高于升温时间。所以本实验结果中出现“肩效应”可能是由于在明显观察到热致死效应前，加热过程需要克服一些起初的能量障碍，志贺氏菌做出一定的抵抗，而在热传递过程中会引发一些生化反应 [11]。

为了定量评价建立的3rd degree polynomial模型的可靠性，本实验采用了Ross提出的并且已经被许多学者所接受的准确度和偏差度 [21]。A f是用来衡量预测值和实测值之间的差异，B f是用来检查预测值上下波动的幅度。在72 ℃条件下随机选择2 株志贺氏菌在熏煮火腿中存活的真实值与应用预测模型计算得到的志贺氏菌存活的预测值来计算准确度和偏差度，以比较、评价和验证模型的可靠性（表3）。

表3 72℃条件下熏煮火腿中志贺氏菌失活预测值的准确度和偏差度
Table3 Accuracy and bias factor of the predicted values of Shiggeellllaa strains in the smoked cooked ham exposed to 72 ℃

菌株菌株数目A fB fS-560.8941.166 S-760.8871.172

由表3可知，本研究中预测值和实测值之间的A f在1.166～1.172之间，预测值上下波动的B f为10%左右。验证结果表明，本研究中建立的志贺氏菌的热失活模型能很好的预测不同温度处理对志贺氏菌的影响。

表4 志贺氏菌不同菌株在熏煮火腿中的耐热性
Table4 Heat resistance (expressed as D-values in min) forr Shiggeellllaa strains in the smoked cooked ham at 55 and 63 ℃

注：同列小写字母不同表示显著差异（P＜0.05）。

菌株D值/min 55 ℃63 ℃S-15.472 5±0.007 5 i0.624 7±0.000 3 iS-29.970 1±0.017 2 b1.600 0±0.007 2 bS-36.211 2±0.013 9 f0.796 3±0.003 3 fS-46.999 5±0.002 8 e1.024 1±0.002 7 eS-510.664 8±0.006 6 a3.216 8±0.011 8 aS-64.461 0±0.009 0 k0.486 6±0.0 00 5 kS-77.392 8±0.013 8 c1.189 1±0.002 1 cS-87.048 9±0.002 9 d1.149 9±0.000 9 dS-95.285 4±0.011 2 j0.504 4±0.000 6 jS-105.597 0±0.003 6 h0.764 1±0.002 2 hS-115.906 7±0.019 4 g0.778 5±0.001 5 g

细菌的耐热性常以D值来表示，由表4可知，在熏煮火腿中，55 ℃条件下D值为4.46～10.66 min，63 ℃条件下D值为0.48～3.22 min。志贺氏菌不同菌株D值不同，其中菌株S-5的D值最大，S-6的最小。说明不同来源的耐热能力是有所差异的，这和其他学者报道的结果是一致的。Osaili等 [22]报道的甲型副伤寒沙门氏菌在鸡肉制品中的D 60 ℃为0.46 min，Bucher等 [23]报道的肠炎沙门氏菌在鸡肉制品中的D 60 ℃为0.39 min，而Juneja等 [24]报道的汤普森氏沙门氏菌在鸡胸肉中的D 60 ℃为5.20 min。不同血清同一菌属的细菌内部结构有所差异，从而导致他们对刺激环境的适应能力不同。S-5在11 株志贺氏菌中耐热能力较强可能是由于其本身含有耐热基因rpoS、rpoE、rpoH或者含有耐热蛋白，当菌株S-5受到热刺激时，导致这些耐热基因的激活发挥抵抗作用 [25]。此外，细菌所在的介质会影响其耐热性，实验中用的熏煮火腿尽量保持同一批，但是因生产等原因不可能保证所含的营养成分完全一致。熏煮火腿中含有的蛋白质对细菌具有缓冲作用，同时也会加速细菌的自我修复和生长繁殖 [26]。脂肪的导热性差，水分活度低使脂肪同样具有缓冲保护作用 [27]，高脂肪含量的熏煮火腿导致志贺氏菌更高的耐热性。

3 结论

本实验应用多项式模型拟合了志贺氏菌不同菌株在熏煮火腿中的热失活曲线，相关系数均在0.989～0.999，并用72 ℃条件下实际的志贺氏菌存活数对模型进行验证，得到预测值和实测值之间的A f在1.166～1.172之间，预测值上下波动的B f为10%左右，表明多项式模型能很好的预测不同温度处理对志贺氏菌的热失活动态。采用D值比较了志贺氏菌在熏煮火腿中的耐热性情况，结果表明志贺氏菌不同菌株的耐热性存在差异，菌株S-5耐热性最强。本研究结果为热处理杀灭熏煮火腿中志贺氏菌提供理论参考，同时为进一步研究志贺氏菌的热失活机制提供了参考依据。

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ZHANG Peipei, LI Miaoyun*, ZHAO Gaiming, CUI Wenming, GAO Xiaoping, LIU Yanxia, ZHAO Lijun, WANG Yafei
(Henan Key Laboratory of Meat Processing and Quality Safety Control, College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Abstract：This study aimed to examine the thermal inactivation pattern of Shigella in smoked cooked ham. Shigella (10 8CFU/g) were inoculated into smoked cooked ham, cultured at constant temperature and constant humidity and then subjected to thermal treatment at 55 or 63 ℃. The number of surviving cells was counted on selective media. A Logistic model and a 3rd degree polynomial model were separately used to fit the thermal inactivation curve by CurveExpert software. Decimal reduction time (D values) represented the heat resistance of Shigella. The results showed that the curves for 11 Shigella strains f tted by the 3rd degree polynomial model were better, with correlation coeff cients (R 2) above 0.98. The D values of different Shigella strains were different, ranging from 4.46 to 10.66 min at 55 ℃ and from 0.48 to 3.22 min at 63 ℃ in the inoculated smoked cooked ham. The heat resistance of different Shigella strains were different, and strain S-5 had the strongest heat resistance while S-6 was the weakest.

Key words：Shigella; smoked cooked ham; thermal inactivation; kinetic model; decimal reduction time (D value)

张佩佩, 李苗云, 赵改名, 等. 熏煮火腿中志贺氏菌的热失活特性[J]. 食品科学, 2017, 38(2): 40-45. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702007. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Peipei, LI Miaoyun, ZHAO Gaiming, et al. Thermal inactivation properties of Shigella in smoked cooked ham[J]. Food Science, 2017, 38(2): 40-45. (in Chinese with English abstract)

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31401511）

作者简介：张佩佩（1991—），女，硕士研究生，研究方向为肉品安全与质量控制。E-mail：zhangpeipeii@163.com

*通信作者：李苗云（1976—），女，教授，博士，研究方向为肉品安全与质量控制。E-mail：limy7476@126.com

熏煮火腿中志贺氏菌的热失活特性

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论