重组大肠杆菌合成光学纯L-苯基乳酸

朱益波 1,鲁如彬 1,程 俊 1,王 颖 1,2,齐 斌 1,王立梅 1,*

(1.常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏 苏州 215500;2.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林 长春 130118)

摘 要:以巨大芽孢杆菌Z2013513基因组DNA为模板,分别PCR扩增得到L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh),将gdh与ldhL分别连接至表达载体pETDuet,获得共表达质粒pETDuet-ldhL-gdh。经转化和验证获得重组菌大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和比酶活力分析表明重组蛋白L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶均成功表达且具有酶活力。在37 ℃、200 r/min条件下,经60 min反应,催化底物苯丙酮酸合成24.26 mmol/L L-苯基乳酸。产物L-苯基乳酸光学纯度(>99%),底物摩尔转化率(59.55%),结果表明此重组体系可用于高效合成高光学纯L-苯基乳酸。

关键词:L-2-羟基-3-苯基丙酸;巨大芽孢杆菌Z2013513;L-乳酸脱氢酶;葡萄糖脱氢酶;NADH再生;全细胞催化

L-苯基乳酸(L-phenyllactic acid,L-PLA),即L-2-羟基-3-苯基丙酸 [1],是PLA的一种手性异构体,与手性对映异构体D-PLA天然共存于蜂蜜和乳酸菌发酵产物 [2]中。L-PLA因其多种特殊生物活性,在医药、精细化工和生物合成等领域应用广泛,特别是作为一些抗高血压、抗艾滋病病毒等重要合成药物的手性中间体 [3-4]。PLA用作动物饲料添加剂能提高动物免疫能力,是抗生素的有效替代物 [5]。新型功能聚合物材料聚L-PLA [6]是非常具有应用潜力的可生物降解材料 [7],有助于减少不可再生能源消耗和温室气体排放。近二十年来,国内外研究表明,L-PLA对多种食源性致病菌具有抑制作用 [1,8-9],其稳定性高,同时是苯丙氨酸代谢产物 [10],对人和动物细胞无毒害作用 [11],在食品防腐方面也具有很大发展潜力 [12-13]。而高光学纯度的L-PLA的生产成本较高、产量较低 [14],是其广泛应用的限制因素。

图1 辅因子再生偶联体系催化PPAA合成L-PLLAA示意图
Fig. 1 Schematic illustration of L-PLA production from PPA with NADH regeneration system

L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,L-LDH)是微生物立体特异性催化合成L-PLA的关键酶 [15-16],此反应需要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid,NADH) [17]。由于微生物细胞内自身L-LDH的表达受到严格代谢调控 [18],并且辅因子NADH不足也是L-PLA合成的关键限制因素(图1)。葡萄糖/葡萄糖脱氢酶(g l u c o s e dehydrogenase,GDH)系统 [19]因催化效率高、反应不可逆、底物葡萄糖价格低廉而适用于微生物体内NADH再生而应用广泛。光学纯化合物制备方法主要有化学合成法、微生物合成法 [20-21]和酶催化法 [22-23]。其中微生物全细胞转化法 [24]因其反应条件温和、操作安全、能耗低、底物转化率高和光学特异性选择性高等特点 [25-26]而受到广泛关注。因此,利用基因工程手段高效共表达L-LDH和GDH是促进L-PLA持续合成的有效途径。

本研究构建一株共表达L-LDH和GDH的基因工程菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)/pETDuetldhL-gdh,此辅因子再生偶联体系 [27]具有全细胞转化还原苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)生产高光学纯度L-PLA的能力,为进一步提高微生物合成L-PLA的生产强度、光学纯度和底物转化率提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

pMD19-T简易载体购自宝生物工程(大连)有限公司;E. coli JM109、E. coli BL21(DE3)、pETDuet-1均为苏州市食品生物技术重点实验室保藏。

1.1.2 培养基

Luria-Bertani(LB)培养基:酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L。根据需要,在培养基中添加100 μg/mL氨苄青霉素。

1.1.3 试剂

L-PLA、D-PLA、PPA 国药集团化学试剂有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨 英国Oxoid公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(i s o p r o p y l-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、DNA聚合酶、DNA Marker、NADH、氨苄青霉素、质粒小量提取及DNA片段胶纯化试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;T4 DNA连接酶、限制性内切酶 宝生物工程(大连)有限公司;B-PER细菌总蛋白提取试剂 美国Thermo公司;所有实验试剂如果无特殊说明均为分析纯。

1.2 仪器与设备

C1000 Touch基因扩增仪、DYCP-31BN琼脂糖水平电泳系统、Protein Ⅱ垂直电泳系统、Geltol EZ凝胶成像系统、X-Mark微孔板分光光度计 美国Bio-Rad公司;CR22GⅡ高速冷冻离心机 日本Hitachi公司;SC100水浴控制器 美国Thermo公司;CTO-20AC高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪日本岛津公司;HZQ-F280恒温振荡培养箱 太仓市华美生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 分子克隆

表1 ldhL和gdh基因引物
Table1 PCR primers for llddhhLL aanndd ggddhh geenneess

注:下划线为酶切位点。

引物序列内切酶ldhL上游引物5’-CGCGGATCCCATGAAAACACAATTTACACC- 3’BamHⅠldhL下游引物5’-ACACTGCAGGCCGATTACACAAAAGCTC-3’PstⅠgdh上游引物5’-CTAGCTCGAGCATTATCCGCGTCCTGCTT-3’XhoⅠ5’-GCGCCCATATGATGTATAAAGATTTAGAAGG-3’NdeⅠgdh下游引物

基因组DNA和质粒DNA提取纯化、DNA酶切、连接和转化、感受态细胞制备均参照产品说明书。根据NCBI中已知的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)WSH-002 ldhL(NCBI参考序列:NC_017138.1)和gdh(GenBank:CP003017.1)基因序列分别设计特异性引物(表1)。

以B. megaterium Z2013513(CCTCC:M2013244)基因组DNA为模板,对ldhL和gdh基因分别进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增。PCR反应体系(50 μL):10×PCR Buffer (含Mg 2+) 5 μL、dNTP(10 mmol/L) 1 μL、Taq Plus DNA聚合酶(5 U/μL) 1 μL、基因组DNA模板2 μL、上下游引物(10 pmol)各2 μL、灭菌超纯水37 μL。PCR扩增条件为:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性1 min,55 ℃ (ldhL)或58 ℃ (gdh)退火1 min,72 ℃延伸90 s,循环25 次,最后72 ℃终延伸10 min。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小是否正确,进行胶回收。目的基因片段与pMD19-T简易载体用T4 DNA连接酶16 ℃条件下连接过夜,热击转化至感受态细胞E. coli JM109中,复苏1 h后涂平板,根据蓝白斑筛选阳性克隆。通过双酶切鉴定后,获得阳性克隆子E. coli JM109/pMD19-T-ldhL和E. coli JM109/pMD19-T-gdh,DNA测序验证。引物合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.2 重组表达质粒pETDuet-ldhL-gdh的构建

将克隆载体pMD19-T-gdh经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切产物进行琼脂糖核酸电泳,胶回收获得目的基因gdh,连接至经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的表达质粒pETDuet-1双克隆位点MCS2中,转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,经质粒酶切和菌落PCR验证,获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-gdh。然后将克隆载体pMD19-T-ldhL经BamHⅠ和PstⅠ双酶切产物进行核酸电泳胶回收,获得目的基因ldhL,连接至经BamHⅠ和PstⅠ双酶切的表达质粒pETDuet-1和pETDuet-gdh双克隆位点MCS1中,转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,经质粒酶切和菌落PCR验证,获得E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL和E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh。

1.3.3 目的基因的诱导表达

挑取E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh和E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL单菌落分别接种于10 mL LB液体培养基(含100 μg/mL氨苄青霉素),37 ℃、200 r/min条件下培养过夜。按体积分数1%的接种量转接入100 mL LB培养基(含100 μg/mL氨苄青霉素)中,37 ℃、200 r/min条件下培养至OD 600 nm为0.4~1.0,添加诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L,25 ℃条件下低温诱导表达6 h。原始菌E. coli BL21(DE3)经无抗生素培养基过夜培养后同样进行低温诱导处理。以上3 种诱导后菌液离心、洗涤、稀释处理参照文献[28],采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析重组蛋白共表达情况 [28]

1.3.4 L-LDH和GDH比酶活力测定

取诱导后的菌液E. coli BL21(DE3)、E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL和E. coli BL21(DE3)/pETDuetldhL-gdh进行离心洗涤后稀释至OD 600 nm为1,取1 mL稀释液离心收集菌体,加入500 μL B-PER裂解液,充分混匀后30 ℃振荡10 min,4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min,取适量上清液进行L-LDH和GDH比活力测定 [29]

由于NADH在340 nm波长处有最大吸收峰,通过反应中光吸收峰值的改变定量测定酶活力。L-LDH酶活力测定参照文献[28]。GDH酶活力测定体系(3 mL):适量粗酶液5~30 μL,100 mmol/L磷酸缓冲液(pH 8.0),2 mmol/L NAD 和100 mmol/L葡萄糖。在30 ℃、pH 7.0条件下,每分钟消耗或生成1 μmol/L NADH所需的酶量为1 个比酶活力单位(U/mL)。蛋白质浓度测定采用Bradford法。比酶活力定义为:每毫克酶蛋白所含的酶活力单位(U/mg)。

1.3.5 重组E. coli全细胞转化PPA合成L-PLA

E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh和E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL经菌体活化和诱导表达后,分别离心收集菌体并用磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤2 次,重悬于10 mL磷酸钠缓冲液中,添加0.3 g/L葡萄糖和40 mmol/L PPA,于37℃、200 r/min条件下反应,每20 min取500 μL转化液于4 ℃条件下10 000 r/min离心5 min,上清液进行HPLC检测产物L-PLA和底物PPA浓度 [30-31]

1.3.6 HPLC分析方法

全细胞转化液经10 000 r/min离心5 min后,上清液与脱气流动相混合均匀,经0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC检测L-PLA物质的量和光学纯度。PPA和L-PLA定量检测和手性分析条件参考文献 [28]。L-PLA光学纯度检测条件为:手性柱OJ-RH、流动相乙腈-甲醇-三氟乙酸-去离子水(50∶50∶1.5∶900,V/V)、流速0.3 mL/min、柱温30 ℃、检测波长210 nm、进样量5 μL [32]。光学纯度用对映体过量(enantionmeric excesses,ee)值表示,按公式(1)计算。

式中:n L-PLA、n D-PLA分别为L-PLA、D-PLA的物质的量/mol。

1.3.7 PPA摩尔转化率计算

PPA摩尔转化率按公式(2)计算。

式中:n L-PLA、n PPA分别为L-PLA、PPA的物质的量/mol。

2 结果与分析

2.1 ldhL和gdh基因克隆及重组质粒的构建

图2 2 ldhLldhL和gdhgdh基因PCR扩增产物电泳图(A)和重组表达质粒pETDuet-Duet-ldhLldhL-gdhgdh双酶切验证(B)B
Fig. 2 PCR-amplified products of ldhL and gdh (A) and double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pETDuetldhL-gdh (B)

以B. megaterium Z2013513基因组为模板分别进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳和测序结果均表明,ldhL基因长度为957 bp,gdh基因长度为786 bp,与NCBI公布B. megaterium WSH-002序列大小相符,序列相似度99%(图2A)。重组表达质粒pETDuet-ldhL-gdh经双酶切验证结果表明,gdh和ldhL均已成功连接(图2B)。

2.2 ldhL和gdh诱导表达及酶活力测定

图3 SDS-PAGE分析重组E. ccoollii L-LDH和GDH蛋白表达
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of L-LDH and GDH coexpression in recombinant E. coli

图3 为SDS-PAGE电泳分析经IPTG诱导后,E. coli BL21(DE3)、重组E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL和E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh中ldhL和gdh基因的蛋白表达情况。与原始菌E. coli BL21(DE3)相比,E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL和E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh均在35~40 kD范围内有特异性条带,且携带双基因表达质粒pETDuet-ldhL-gdh中ldhL的表达量明显低于携带单基因表达质粒pETDuet-ldhL。E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh在25~29 kD范围内的特异性条带与GDH蛋白分子质量大小相符。SDS-PAGE结果表明E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh能成功转录并表达L-LDH和GDH蛋白。

表2 重组大肠杆菌中L-LDH和GDH比活力分析
Table2 Specific activities off LL-LDH and GDH of recombinant strains U/mg

注:ND.未检出(酶活力<0.1 U/mg)。

菌株L-LDH比活力GDH比活力E. coli BL21(DE3)NDND E. coli pETDuet-ldhL0.41ND E. coli pETDuet-ldhL-gdh0.216.53

测定3 种菌株粗酶液中L-LDH和GDH比活力(表2),未检测出重组菌株E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL和原始菌株E. coli BL21(DE3)裂解上清液中GDH的比活力,而重组菌株E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh裂解上清液中L-LDH和GDH比活力分别为0.21 U/mg和6.53 U/mg,说明重组ldhL和gdh在大肠杆菌中成功表达且具有酶学活性。

2.3 辅因子再生偶联体系转化PPA合成L-PLA

图4 E. ccoollii BL21(DDEE33)/pETDDuueett--llddhhLL-ggddhh和E. ccoollii BL21(DDEE33)/ pETDDuueett--llddhhLL转化对比图
Fig. 4 Time course of L-PLA production by E. coli BL21(DE3)/ pETDuet-ldhL-gdh or E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL

全细胞转化试验表明两株重组菌E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL和E. coli BL21(DE3)/pETDuetldhL-gdh均能够转化PPA立体特异性合成L-PLA。E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL的L-LDH表达量较高,比酶活力约是E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh的L-LDH的2 倍(表2),但在转化过程中,由于缺乏辅因子NADH,限制L-LDH的催化反应,不利于L-PLA的合成。而E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh细胞中GDH不断将葡萄糖催化生成葡萄糖酸,同时也伴随着NAD 转化成辅酶NADH,保持菌体代谢中的辅酶平衡,才使得细胞内足够的辅因子促使L-LDH以较高的反应速率催化PPA不对称合成L-PLA。反应40 min以后,因底物消耗殆尽而反应速率降低。相比E. coli BL21(DE3)/pETDuetldhL,E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh转化L-PLA为24.26 mmol/L,提高18.92%;底物PPA摩尔转化率为59.55%,提高17.42%(图4)。

图5 HPLCC分析E. ccoollii BL21(DDEE33)/pETDDuueett--llddhhLL-ggddhh全细胞转化产物L-PLA光学纯度
Fig. 5 HPLC analysis of L-PLA production by whole cells of E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh

由图5可知,HPLC手性分析结果表明此辅因子再生偶联体系不对称还原PPA合成的L-PLA光学纯度高达99%。虽然此辅因子再生体系的诱导表达和全细胞转化条件需要进一步优化以提高L-PLA产量和底物摩尔转化率,但是其立体特异性选择有助于合成光学纯L-PLA,为其在医学和食品行业中广泛应用提供参考依据。

3 结 论

辅因子再生对于生物体内大多数氧化还原反应持续进行具有重要的意义,既避免在反应过程中外部添加昂贵的辅因子,又缓解细胞内辅因子水平的限制,提高氧化还原反应催化效率。菌株Rubrivivax benzoatilyticus JA2 [14]转化1 mmol/L苯丙氨酸合成0.92 mmol/L L-PLA。筛选自土壤的假单胞菌菌株Pseudomonas sp.BC-18能将2-羟基-3-苯基丙腈转化得光学纯度为75%的L-PLA [32]。本研究设计了辅因子NADH再生途径,通过引入gdh和ldhL,底物葡萄糖不仅为细胞提供能量,也实现NAD/NADH在细胞内的平衡,促进L-PLA的大量积累。同时,良好的光学纯度是L-PLA合成重要手性药物的前提。此微生物全细胞一步转化法条件温和、工艺简单,为L-PLA工业化生产提供一定的参考依据。

参考文献:

[1] MU W M, YU S H, ZHU L J, et al. Recent research on 3-phenyllactic acid, a broad-spectrum antimicrobial compound[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2012, 95(5): 1155-1163. DOI:10.1007/ s00253-012-4269-8.

[2] WANG H K, YAN Y H, WANG J M, et al. Production and characterization of antifungal compounds produced by Lactobacillus plantarum IMAU10014[J]. PLoS ONE, 2012, 7(1): e29452. DOI:10.1371/journal.pone.0029452.

[3] TEKEWE A, SINGH S, SINGH M, et al. Development and validation of HPLC method for the resolution of drug intermediates: DL-3-phenyllactic acid, DL-O-acetyl-3-phenyllactic acid and (±)-mexiletine acetamide enantiomers[J]. Talanta, 2008, 75(1): 239-245. DOI:10.1016/j.talanta.2007.11.004.

[4] KANO S, YUASA Y, YOKOMA TSU T, et al. Highly stereocontrolled synthesis of the four individual stereoisomers of statine[J]. The Journal of Organic Chemistry, 1988, 53(16): 3865-3868. DOI:10.1021/ jo00251a042.

[5] WANG J P, LEE J H, YOO J S, et al. Effects of phenyllactic acid on growth performance, intestinal microbiota, relative organ weight, blood characteristics, and meat quality of broiler chicks[J]. Poultry Science, 2010, 89(7): 1549-1555. DOI:10.3382/ps.2009-00235.

[6] NGUYEN H D, JIN X, KANEKO D, et al. Syntheses of high molecular weight poly(L-phenyllactic acid)s by a direct polycondensation in the presence of stable Lewis acids[J]. Chemistry Letters, 2011, 40(6): 584-585. DOI:10.1246/cl.2011.584.

[7] SUN X Z, MINOWA T, Y AMAGUCHI K, et al. Evaluation of energy consumption and greenhouse gas emissions from poly(phenyllactic acid) production using sweet sorghum[J]. Journal of Cleaner Production, 2015, 87: 208-215. DOI:10.1016/j.jc lepro.2014.09.041.

[8] LAVERMICOCCA P, VALERIO F, VISCONTI A. Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2003, 69(1): 634-640. DOI:10.1128/AEM.69.1.634-640.2003.

[9] VALERIO F, LAVERM ICOCCA P, PASCALE M, et al. Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria: an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 233(2): 289-295. DOI:10.1016/ j. femsle.2004.02.020.

[10] YVON M, RIJNEN L. Cheese flavour formation by amino acid catabolism[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(4): 185-201. DOI:10.1016/S0958-6946(01)00049-8.

[11] OBERDOERSTER J, GUIZZETTI M, COSTA L G. Effect of phenylalanine an d its metabolites on the proliferation and viability of neuronal and astroglial cells: possible relevance in maternal phenylketonuria[J]. Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics, 2000, 295(1): 295-301. DOI:0022-3565/00/2951-0295$03.00/0.

[12] BELLO F D, CLARKE C I, RYAN L A M, et al. Improvement of the quality and shelf life of wheat bread by fermentation with the antifungal strain Lactobacillus plantarum FST 1.7[J]. Journal of Cereal Science, 2007, 45(3): 309-318. DOI:10.1016/j.jcs.2006.09. 004.

[13] SCHNURER J, MAGNUSSON J. Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives[J]. Trends in Food Science & Techn ology, 2005, 16: 70-78. DOI:10.1016/j.tifs.2004.02.014.

[14] PRASUNA M L, MUJAHID M, SASIKA LA C, et al. L-Phenylalanine catabolism and L-phenyllactic acid production by a phototrophic bacterium, Rubrivivax benzoatilyticus JA2[J]. Microbiological Research, 2012, 167(9): 526-531. DOI:10.1016/j.micres.2012.03.001.

[15] ZHANG X Q, ZHANG S L, SHI Y, et al. A new hig h phenyl lactic acid-yielding Lactobacillus plantarum IMAU10124 and a comparative analysis of lactate dehydrogenase gene[J]. FEMS Microbiology Letters, 2014, 356(1): 89-96. DOI:10.1111/1574-6968.12483.

[16] GU S A, JUN C, JOO J C, et al. Higher thermostability of L-lactate dehydrogenases is a key factor in decreasing the optical purity of D-lactic acid produced from Lactobacillus coryniformis[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2014, 58(9): 29-35. DOI:10.1016/ j.enzmictec.2014.02.008.

[17] BERRIOS-RIVERA S J, BENNETT G N, SAN K Y. Metabolic engineering of Escherichia coli: increase of NADH availability by overexpressing an NAD +-dependent formate dehydrogenase[J]. Metabolic Engineering, 2002, 4(3): 217-229. DOI:10.1006/ mben.2002.0227.

[18] JIA J H, MU W M, ZHANG T, et al. Bioconversion of phenylpyruvate to phenyllactate: gene cloning, expression, and enzymatic characterization of D- and L-lactate dehydrogenases from Lactobacillus pl antarum SK002[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology, 2010, 162(1): 242-251. DOI:10.1007/s12010-009-8767-9.

[19] WECKBECKER A, HUMMEL W. Glucose dehydrogenase for the regeneration of NADPH and NADH[J]. Microbial Enzymes & Biotransformations, 2008, 17: 225-238. DOI:10.1385/1-59259-846-3:225.

[20] KAWAGUCHI H, TERAMURA H, UEMATSU K, et al. Phenyllactic acid production by simultaneous saccharif cation and fermentation of pretreated sorghum bagasse[J]. Bioresource Technology, 2015, 182: 169-178. DOI:10.1016/j.biortech.2015.01.097.

[21] YU S H, ZHOU C, ZHANG T, et al. Short communication: 3-phenyllactic acid production in milk by Pediococcus pentosaceus SK25 during laboratory fermentation process[J]. Journal of Dairy Science, 2014, 98(2): 813-817. DOI:10.3168/jds.2014-8645.

[22] XU G C, ZHANG L L, NI Y. Enzymatic preparation of D-phenyllactic acid at high space-time yield with a novel phenylpyruvate reductase identified from Lactobacillus sp. CGMCC 9967[J]. Journal of Biotechnology, 2015, 222: 29-37. DOI:10.1016/j.jbiotec.2 015.12.011.

[23] YU S H, ZHANG L J, ZHOU C, et al. Enzymatic production of D-3-phenyllactic acid by Pediococcus pentosaceus D-lactate dehydrogenase with NADH regeneration by Ogataea parapolymorpha formate dehydrogenase[J]. Biotechnology Lett ers, 2014, 36(3): 627-631. DOI:10.1007/s10529-013-1404-2.

[24] LI L, SHIN S Y, LEE K W, et al. Production of natural antimicrobial compound D-phenyllactic acid using Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293 whole cells involving highly active D-lactate dehydrogenase[J]. Letters in Applied Microbiology, 2014, 59(4): 404-411. DOI:10.1111/lam.12293.

[25] ZHENG Z J, MA C Q, GAO C, et al. Efficient conversion of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by using whole cells of Bacillus coagulans SDM[J]. PLoS ONE, 2011, 6(4): e19030. DOI:10.1371/journal.pone.0019030.

[26] TAKERU I, KOHSUKE H, SAKAYU S. Whole organism biocatalysis[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2005, 9(2): 174-180. DOI:10.1016/j.cbpa.2005.02.001.

[27] ZHENG Z J, ZHAO M Y, ZHANG Y, et al. Production of optically pure L-phenylla ctic acid by using engineered Escherichia coli coexpressing L-lactate dehydrogenase and formate dehydrogenase[J]. Journal of Biotechnology, 2015, 207: 47-51. DOI:10.1016/ j.jbiotec.2015.05.015.

[28] ZHU Y B, HU F G, ZHU Y Y, et al. Enhancement of phenyllactic acid biosynthesis by recogn ition site replacement of D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus pentosus[J]. Biotechnology Letters, 2015, 37(6): 1-9. DOI:10.1007/s10529-015-1778-4.

[29] 胡发根. 重组大肠杆菌全细胞转化合成D-苯基乳酸的基础研究[D].苏州: 苏州大学, 2015: 22-23.

[ 30] 胡发根, 沈丽, 吉华兰, 等. 重组大肠杆菌全细胞合成苯基乳酸的研究[J]. 食品工业科技, 2015, 36(9): 147-151. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2015.09.024.

[31] 蒋卓越, 季伟, 钱蓓蓓, 等. 乳酸脱氢酶突变体D-LDHY52L在大肠杆菌中的重组表达及其合成D-苯基乳酸的研究[J]. 食品与发酵工业, 2016, 42(1): 1-6. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601001.

[32] 王颖, 范铭, 薛素妹, 等. 全细胞催化合成L-苯基乳酸重组大肠杆菌的构建[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(12): 13-17. DOI:10.13995/ j.cnki.11-1802/ts.201512003.

Production of Optically Pure L-Phenyllactic Acid by Using Whole Cells of Recombinant Escherichia coli

ZHU Yibo 1, LU Rubin 1, CHENG Jun 1, WANG Ying 1,2, QI Bin 1, WANG Limei 1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Suzhou 215500, China; 2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Abstract:The L-lactate dehydrogenase gene (ldhL) and glucose dehydrogenase gene (gdh) were respectively amplified from Bacillus megaterium Z2013513 by PCR and inserted into the plasmid pETDuet-1 to construct the recombinant vector pETDuet-ldhL-gdh. Then, the vector was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) to obtain the recombinant strain E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and enzymatic activity analysis showed that both ldhL and gdh were successfully co-expressed with biological functions in the recombinant strain. Using whole cells of recombinant E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh, 24.26 mmol/L L-phenyllactic acid was obtained from phenylpyruvic acid at 37 ℃ and 200 r/min after 60 min transformation. The product enantiomeric excess percent was over 99% with substrate molar conversion rate of 59.55%. The results showed the cofactor regeneration biotransformation system was capable of eff ciently producing optically pure L-phenyllactic acid.

Key words:L-2-hydroxyl-3-phenylpropionic acid; Bacillus megaterium Z2013513; L-lactate dehydrogenase; glucose dehydrogenase; NADH regeneration; whole-cell catalysis

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702010

中图分类号:TS201.2

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)02-0059-06

引文格式:

朱益波, 鲁如彬, 程俊, 等. 重组大肠杆菌合成光学纯L-苯基乳酸[J]. 食品科学, 2017, 38(2): 59-64. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702010. http://www.spkx.net.cn

ZHU Yibo, LU Rubin, CHENG Jun, et al. Production of optically pure L-phenyllactic acid by using whole cells of recombinant Escherichia coli[J]. Food Science, 2017, 38(2): 59-64. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702010. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-03-26

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31501459);国家自然科学基金面上项目(31470092);江苏省基础研究计划(自然科学青年基金)项目(BK20130380);常熟市科技计划项目(CN201412)

作者简介:朱益波(1980—),男,博士,研究方向为微生物与生物技术。E-mail:centuryrain@126.com

*通信作者:王立梅(1964—),女,教授,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail:wlmqb@126.com