基于风味改善的食醋自吸式半连续酿造工艺优化

洪厚胜 1,2,赵 敏 1,骆海燕 1,窦冰然 3

(1.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏 南京 210009;2.南京汇科生物工程设备有限公司,江苏 南京 210009;3.南京工业大学理学院,江苏 南京 210009)

摘 要:采用自吸式发酵罐液态深层半连续法发酵食醋,该方法生产效率高、生产周期短,但食醋风味不足。在传统液态法食醋发酵工艺基础上,通过筛选原料、添加糖化曲和多菌协同酒精发酵,可以提高食醋不挥发酸的含量,改善食醋风味。研究结果表明:以小麦为原料调浆液化完成后,加入6.5%(质量分数)增香糖化曲,35℃保温糖化1 h,接种5%(体积分数)乳酸菌与0.28 g/100 mL酵母菌共同酒精发酵,控制温度32℃发酵4 d,最后接种醋酸菌。将该工艺应用在摇瓶水平上液态法发酵食醋,得到的食醋中不挥发酸含量可达0.47 g/100 mL。将该工艺应用于5 L自吸罐液态半连续发酵得到的食醋成品,总酸度≥6 g/100 mL,不挥发酸含量≥0.5 g/100 mL,达到了国标对固态醋不挥发酸含量的要求。

关键词:自吸式;半连续发酵;食醋;风味

食醋是人们日常生活中必不可少的调味品,国内市场上食醋的生产主要分为传统固态发酵工艺与液态深层法发酵工艺两类 [1-3]。传统固态发酵的食醋风味独特,酸味柔和,迎合了中国人的口感需求。传统固态工艺有着劳动强度大、生产效率低、生产周期长的缺点 [4-7]。液态深层发酵食醋工艺是借鉴抗生素、氨基酸等其他发酵工业的经验,应用现代发酵工程等技术建立起来的一类先进的新型制醋生产技术,正好弥补了固态制醋工艺的不足,具有自动化程度高、产量稳定等优点。随着人们生活水平的不断提高和食醋保健功能的深入研究 [8],“少盐多醋”已成为新型健康饮食的潮流,醋产业已经步入了发展的快车道 [9-11]。因此,液态深层发酵法将更加适应制醋工业的科学化、机械化与大型化发展方向。但是,液态深层发酵法得到的食醋产品,无法满足中国人对食醋风味的需求。如何改善液态法酿造醋的风味问题,已经成为液态法酿醋工艺推广应用的关键因素。最直接影响食醋风味中的成分就是不挥发酸含量,不挥发酸含量高可以有效缓和液态醋的刺激性酸味,使食醋产品口感柔和,风味改善 [12-20]

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与培养基

酿酒高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;醋酸菌实验室保藏;乳酸菌(徳氏乳杆菌保加利亚亚种) 中国工业微生物保藏中心;α-淀粉酶(酶活≥40 000 U/g)、糖化酶(酶活≥100 000) 国药集团化学试剂有限公司;增香糖化曲 武汉佳成生物制品有限公司;粮食原料、大曲、红曲、麸曲 市售。

醋酸菌斜面培养基:葡萄糖1%、酵母膏1%、碳酸钙1.5%、琼脂2%,121 ℃灭菌20 min,降温至60 ℃加入3.5%无水乙醇;醋酸菌活化培养基:葡萄糖1%、酵母膏1%,121 ℃灭菌20 min,降温至60 ℃加入3.5%无水乙醇;乳酸菌斜面培养基:蛋白胨1%、牛肉浸膏1%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、乙酸钠0.5%、柠檬酸二铵0.2%、吐温80 0.1%、磷酸氢二钾0.2%、七水合硫酸镁0.058%、七水合硫酸锰0.025%、琼脂2%、碳酸钙1%,121 ℃灭菌20 min;乳酸菌活化培养基:蛋白胨1%、牛肉浸膏1%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、乙酸钠0.5%、柠檬酸二铵0.2%、吐温80 0.1%、磷酸氢二钾0.2%、七水合硫酸镁0.058%、七水合硫酸锰0.025%, 121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

BSA124电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司;PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司;UVmini-1240紫外分光光度计 日本岛津有限公司;YSQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;HH-2恒温水浴锅 江苏金坛市宏华仪器厂;SW-CJ-1D超净工作台 苏州净化设备有限公司;15L自吸式发酵罐 南京汇科生物工程设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

1.3.1.1 酿酒高活性干酵母

称取所需量的活性干酵母,加入2%蔗糖水,在35~40 ℃条件下处理15~20 min,将温度降至34 ℃继续活化1~2 h,活化过程中有大量气泡产生,需搅拌消泡。1.3.1.2 醋酸菌

配制醋酸菌活化培养基,以装液量10%分装于若干三角瓶中,灭菌降温至30 ℃,每10 mL活化培养基从醋酸菌斜面上挑取2 环进行接种,30 ℃、200 r/min条件下摇床振荡培养30 h,得到醋酸菌种子液。

1.3.1.3 乳酸菌

配制乳酸菌活化培养基,以30%装液量装入三角瓶,灭菌后降温至35 ℃,每10 mL活化培养基从乳酸菌斜面上挑取2 环进行乳酸菌接种,37 ℃条件下密封、静置扩培48 h,得到乳酸菌种液。

1.3.2 分析检测指标测定

葡萄糖值:参照GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》;光密度:紫外分光光度法;还原糖含量(以葡萄糖计):快速费林法;残糖检测:3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法;酒精含量:蒸馏法;总酸含量(以醋酸计):氢氧化钠滴定法;pH值检测:酸度计法;不挥发酸含量:单沸式蒸馏法;总菌群计数:参照GB 47892—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》。

1.3.3 酿造工艺

1.3.3.1 工艺流程

本实验酿造小麦醋的工艺流程如下 [18,21]

1.3.3.2 操作要点

1)调浆液化

称取所需量原料,以原料质量分数22%加适量水配制成原料醪液,向醪液中加入12~14 U/g干物料的α-高温淀粉酶,控制温度90~95 ℃至液化完全后煮沸降温待用 [22]

2)醪液糖化及酒精发酵

待醪液液化完全后,降温至35~45 ℃,加入适量曲保温1~2 h后降温,向糖化醪液中接种活化好的酒精发酵阶段菌种,30 ℃进行酒精发酵。每隔12 h检测发酵液的糖度、酒精度,当酒精度不再上升则发酵完成。将发酵完全的酒醪静置沉降数天,取上层较清醪液备用。

3)醋酸发酵

采用深层液态半连续发酵,发酵罐空罐灭菌后加入适量乙酸作为发酵初始底酸,向罐中加入酒醪,一般控制初始酒精度不超过4%,初始酸度不超过4 g/100 mL,开启自动控温,并开始通气。当罐内温度稳定在30 ℃左右,接入酒醪体积分数10%的醋酸菌种子液,测定发酵液的酒精度和酸度;在发酵周期的末期,当酒精度值达到卸料点0.5%时,放出部分醋酸发酵液;同时,向罐中补充相同体积的酒醪,下一周期随即开始。每隔4 h检测发酵液的酸度、酒精度 [23-27]

1.3.4 工艺优化设计

为改进液态法酿造食醋的风味,研究不同原料进行制醋、原料糖化阶段采用多种糖化曲替代糖化酶进行糖化、酒精发酵阶段通过添加乳酸菌与酵母菌共酵这3 种主要措施对食醋风味的影响。根据这3 种措施的单因素试验结果,确定制醋工艺参数的适宜范围,在L 9(3 4)水平设计正交试验,试验设计的各因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平
Table1 Coded levels and corresponding actual levels for independent variables used in orthogonal array design

水平因素A原料种类B糖化曲种类C乳酸菌添加量/% 1糯米增香糖化曲3 2玉米红曲4 3小麦麦曲5

根据发酵过程中的单因素试验结果及相关文献 [28-30],选取糖化曲添加量(A)、酵母菌接种量(B)、发酵温度(C)作为响应面法考察因素,以1、0、-1代表其高、中、低水平,以酒精发酵后的酒精度(%)为响应值,设计三因素三水平17个试验点的响应面分析试验(表2)。

表2 Box-Behnken试验因素与水平
Table2 Coded levels and corresponding actual levels for independent variables used in Box-Behnken design

因素水平-101 A糖化曲添加量/%468 B酵母菌接种量/(g/100 mL)0.20.30.4 C发酵温度/℃303234

2 结果与分析

2.1 液态法酿醋风味改良单因素试验结果

2.1.1 原料种类对食醋风味的影响

以原料质量分数22%加各种原料和水调浆,加入16 U/g高温淀粉酶90 ℃液化100 min,降温加入3%(质量分数)增香糖化曲,35 ℃保温糖化1 h,活化0.35 g/100 mL酵母菌并接种,30 ℃酒精发酵4 d,在三角瓶中分别加入等量的各种粮食酒醪、乙酸和水,控温30 ℃,接种10%(体积分数)的醋酸菌种,220 r/min摇瓶至酸度不再上升,醋酸发酵结束,各种原料产酸量(总酸度减去乙酸含量)与不挥发酸含量见图1,可以看出,以玉米和小麦为原料的液态醋风味较好,其中小麦最优;糯米和高粱为原料的液态醋不挥发酸含量差别不大,但糯米为原料的液态醋产酸量优于高粱。

图1 原料种类对食醋风味的影响
Fig. 1 Influence of different raw materials on the flavor of vinegar

2.1.2 糖化曲种类对食醋风味的影响

图2 糖化曲种类对食醋风味的影响
Fig. 2 Influence of different saccharification agents on the flavor of vinegar

以小麦为原料,按原料质量分数22%加水调浆,加入16 U/g高温淀粉酶90 ℃液化100 min,降温加入适量各种曲,35 ℃保温糖化1 h,活化0.35 g/100 mL酵母菌并接种,30 ℃酒精发酵4 d,在三角瓶中分别加入等量的各种曲糖化发酵后酒醪、乙酸和水,控温30 ℃,接入10%的醋酸菌种,220 r/min摇瓶至酸度不再上升,醋酸发酵结束。从图2可以看出,增香糖化曲替代糖化酶糖化后经发酵出的液态醋不挥发酸含量最高,红曲和麦曲替代糖化酶糖化后经发酵出的液态醋的不挥发酸含量与产酸量综合都优于麸曲。

2.1.3 乳酸菌添加量对食醋风味的影响

以小麦为原料,按原料质量分数22%加水调浆,加入16 U/g高温淀粉酶,90 ℃液化100 min,降温加入3%的增香糖化曲,35 ℃保温糖化1 h,活化0.35 g/100 mL酵母菌并接种,同时分别接种不同体积分数的乳酸菌共酵,30 ℃酒精发酵4 d,在三角瓶中分别加入等量酒精发酵后酒醪、乙酸和水,控温30 ℃,接种10%的醋酸菌种,220 r/min摇瓶至酸度不再上升,醋酸发酵结束。从图3可以看出,不挥发酸含量随着乳酸菌添加量不断上升后趋于稳定,产酸量随着乳酸菌的添加呈下降趋势,综合发酵效率与风味效果,乳酸菌添加量控制在3%~5%之间。

图3 乳酸菌添加量对食醋风味的影响
Fig. 3 Influence of Lactobacillus inoculum size on the flavor of vinegar

2.2 液态法酿醋风味改良正交试验结果

对影响液态法酿造食醋风味改良的原料种类、糖化曲种类、乳酸菌添加量这3 个因素在L 9(3 4)水平正交试验,并确定最佳组合,正交试验结果见表3。

表3 正交试验设计及结果
Table3 Orthogonal array design with experimental results

试验号A原料种类不挥发酸含量/(g/100 mL)1 1 1 1 0.40 B糖化曲种类C乳酸菌添加量2 0.33 3 1 3 3 0.35 1 2 2 0.33 5 2 2 3 0.35 4 2 1 2 6 0.33 7 3 1 3 0.50 2 3 1 8 0.43 9 3 3 2 0.38 3 2 1 k 10.3600.4100.387 k 20.3370.3700.347 k 30.4370.3530.400 R0.1000.0570.053优水平A 3B 1C 3

由表2中极差值可以得出,在整个液态法醋酸发酵过程中,影响食醋风味较大的是原料种类,糖化曲种类与乳酸菌添加量对酒精发酵的过程影响相差不大。由各因素均值的大小得出,因素优水平组合为A 3B 1C 3,即液态法食醋风味改良工艺的最优化条件为:以小麦为原料、糖化过程用增香糖化曲替代糖化酶、酒精发酵过程加入5%乳酸菌与酵母菌共酵,最终可以使食醋成品的不挥发酸含量达到0.50 g/100 mL。经3 次验证实验发现,醋品中平均不挥发酸含量达0.47 g/100 mL,与以大米为原料经双酶液态法发酵所得的醋品提高了3 倍,风味改良效果明显。2.3 液态醋风味改良工艺确定后酒精发酵阶段单因素试验结果

2.3.1 糖化保温时间对酒精发酵的影响

以小麦为原料,按原料质量分数22%加水调浆,加入16 U/g高温淀粉酶,90℃液化100 min,降温加入3%的增香糖化曲,分别于35℃条件下保温糖化30、60、90、120、150 min,活化0.35 g/100 mL酵母菌并接种,同时接种5%的乳酸菌共酵,30 ℃酒精发酵4 d。从图4可以看出,糖化保温时间对酒精度的影响较小,将不会作为响应面优化设计因素。

图4 糖化保温时间对酒精发酵的影响
Fig. 4 Influence of saccharification time on alcohol fermentation

2.3.2 糖化曲添加量对酒精发酵的影响

图5 糖化曲添加量对酒精发酵的影响
Fig. 5 Influence of dosage of saccharification agent on alcohol fermentation

以小麦为原料,按原料质量分数22%加水调浆,加入16 U/g高温淀粉酶,90 ℃液化100 min,降温后分别加入2%、4%、6%、8%、10%的增香糖化曲,35 ℃条件下保温糖化120 min,活化0.35 g/100 mL酵母菌并接种,同时接种5%的乳酸菌共酵,30 ℃酒精发酵4 d。从图5可知,糖化曲添加量对酒精发酵有一定影响,随着糖化曲添加量的增加,酒精度不断上升并趋于平缓,较优的糖化曲添加量为6%。

2.3.3 发酵温度对酒精发酵的影响

图6 发酵温度对酒精发酵的影响
Fig. 6 Influence of temperature on alcohol fermentation

以小麦为原料,按原料质量分数22%加水调浆,加入16 U/g高温淀粉酶,90 ℃液化100 min,降温后分别加入3%的增香糖化曲,35 ℃条件下保温糖化120 min,活化0.35 g/100 mL酵母菌并接种,同时接种5%的乳酸菌共酵,分别在30、32、34、36、38℃酒精发酵4 d。从图6可知,在一定范围内,随着发酵温度上升酒精度增大,但发酵温度过高也会使酒精度下降,较优的发酵温度为32 ℃。

2.3.4 酵母菌接种量对酒精发酵的影响

图7 酵母菌接种量对酒精发酵的影响
Fig. 7 Influence of yeast inoculum size on alcohol fermentation

以小麦为原料,按原料质量分数22%加水调浆,加入16 U/g高温淀粉酶,90 ℃液化100 min,降温后分别加入3%的增香糖化曲,35℃条件下保温糖化120 min,分别活化0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/100 mL酵母菌并接种,同时接种5%的乳酸菌共酵,30 ℃酒精发酵4 d。从图7可知,酒精度随着酵母菌接种量的增加不断增大并趋于稳定,为了节省成本,将接种量定为0.3 g/100 mL。

2.4 液态醋风味改良工艺确定后酒精发酵阶段响应面试验结果

利用软件对表4中的17组试验数据进行二次多项式回归拟合,得到二次多元回归方程为:

Y=8.74+0.050A-0.045B+0.035C-0.055AB-0.01AC+0.025BC-0.13A 2-0.13B 2-0.098C 2

对上述回归方程进行方差分析,结果见表5。

表4 Box-Behnken试验设计与结果
Table4 Box-Behnken design with experimental results

试验号A糖化曲添加量B酵母菌接种量C发酵温度酒精度/% 1 0 0 0 8.78-1108.44 3 0 0 0 8.71 2 4 08.73 5 1-108.61 0 0 6-18.40 7 0-1-18.57 0 1 8-10-18.40 9 0-118.56 100008.73 11-1018.52 120008.73 131108.44 1410-18.51 150118.49 16-1-108.39 171018.59

表5 回归方程的方差分析
Table5 Analysis of variance for regression model

2:**.影响极显著(P<0.01);*.影响显著(P<0.05)。R 2=0.976 6,R Adj=0.946 5。

来源平方和自由度均方F值P值显著性A糖化曲添加量0.02010.02021.470.002 4** B酵母菌接种量0.01610.01617.390.004 2** C发酵温度0.00110.00110.520.014 2* AB0.01210.01212.990.008 7** AC0.000 410.000 40.430.533 2 BC0.00310.0032.680.145 4 A 20.7410.7479.96<0.000 1** B 20.7410.7479.96<0.000 1** C 20.04010.04043.410.000 3**模型0.2790.03032.46<0.000 1**残差0.00770.000 9失拟项0.00430.0011.860.276 6不显著纯误差0.00340.000 7总和0.2816

由表5可知,对回归方程结果分析:由失拟项P值为0.276 6说明失拟不显著,模型预测值与实际值在误差允许范围内。而模型P值为0.000 1表明该模型有极显著意义,可使用该方程模拟全麦粉酒精发酵阶段分析。由结果可知,对酒精度的影响排序为糖化曲添加量>酵母菌接种量>发酵温度。且模型的复相关系数R 2为0.976 6,大于90%,说明酒精度和糖化曲添加量、酵母菌接种量、发酵温度存在线性相关,模型拟合程度高。变异系数值为0.36%,其值比较小,表明试验结果可靠性较高。

回归方程分析表明:一次项A、B,二次项A 2、B 2、C 2,交互项AB为极显著因素(P<0.01),说明酒精度不但受糖化曲添加量、酵母菌接种量、发酵温度影响很大,也受到糖化曲添加量与酵母菌接种量交互作用影响;一次项C为显著因素(P<0.05),说明发酵温度对酒精发酵的酒精度有显著影响;交互项BC、AC为不显著因素(P>0.05),说明发酵温度与糖化曲添加量和发酵温度与酵母菌接种量的交互作用对酒精产量几乎不影响。

为了直观反映各因素及其交互作用对响应值的影响结果,固定其他因素为0水平,对上述回归方程绘制三维响应面图及其等高线图,见图8。

图8 各因素交互作用响应面图
Fig. 8 Response surface plots showing the effect of various factors on alcohol fermentation

从图8a可见,在本试验水平范围内,随着酵母菌接种量的增加,酒精度上升,但接种量超出一定量时,反而会使酒精度下降。因此,当酵母菌接种量在0.2~0.35 g/100 mL时,酒精度可达到8.7%。糖化曲的添加量并不是越高越好,只有添加量控制在5~8 g/100 g干物料时,才能获得酒精度8.7%。由图8b可知,当发酵温度控制在30~34℃时,酒精度随着糖化曲添加量适量增加而上升,当糖化曲添加量超过7%,对酒精度影响减小。由图8c可知,酵母菌接种量控制在0.225~0.35 g/100 mL,发酵温度控制在31~34 ℃时可达到较高酒精度8.7%。

通过软件分析得到最佳酒精发酵条件为糖化曲添加量6.5%、酵母菌接种量0.28 g/100 mL、发酵温度32℃,预计酒精度可达8.75%。为检验响应面优化结果的可靠性,采用上述条件进行全麦粉酒精发酵,3次平行实验得到的实际平均酒精度为8.69%,相对误差小于1%,因此,响应面优化得到的参数具有实际应用价值。

2.5 5 L自吸式发酵罐验证液态法食醋风味改良新工艺

图9 小麦醋半连续发酵过程
Fig. 9 Time-course curves of semi-continuous vinegar fermentation

图9 显示:5 L自吸式发酵罐深层液态法半连续发酵食醋过程,共分割9 次,稳定发酵后生产6 g/100 mL食醋共5 L,3 次测得不挥发酸含量均不小于0.5 g/100 mL。与以大米为原料经双酶液态法发酵所得的醋品相比,不挥发酸含量提高了3 倍,风味改良效果明显 [31]

3 结 论

通过正交试验 和响应面优化试验,对传统深层液态法食醋发酵过程进行了研究和改进,确定了改良液态醋风味的深层液态食醋发酵新工艺。具体工艺条件为:以小麦为原料,调浆液化完成后,加入6.5%的增香糖化曲,35 ℃保温糖化1 h,接种5%乳酸菌与0.28 g/100 mL酵母共同酒精发酵,控制温度32 ℃发酵4 d。将酒醪经5 L自吸式发酵罐上罐发酵后得到食醋,成品总酸度(以醋 酸计)不小于6 g/100 mL,不挥发酸含量不小于0.5 g/100 mL,达到了GB 18187—2000《酿造食醋》对固态醋不挥 发酸含量的要求。

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Optimization of Self-Suction Semi-Continuous Vinegar Fermentation for Flavor Improvement

HONG Housheng 1,2, ZHAO Min 1, LUO Haiyan 1, DOU Bingran 3
(1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China; 2. Nanjing Highke Bioengineering Equipment Co. Ltd., Nanjing 210009, China; 3. College of Sciences, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China)

Abstract:Semi-continuous submerged vinegar fermentation in a self-suction fermentor has the advantages of high production efficiency and short production cycle. However, the taste of the produced vinegar is not as good as desired. For increased non-volatile acid content and improved vinegar f avor, the traditional liquid-state fermentation process for vinegar production was modif ed by raw material selection, addition of saccharif cation agent and mixed-culture alcoholic fermentation. The vinegar production process was determined as follows: After addition of water, ground wheat was liquef ed and saccharif ed by addition of 6.5% (m/m) f avor-enhancing saccharif cation agent at 35 ℃ for 1 h; afterwards, the substrate was inoculated with a mixture of 5% (V/V) lactic acid bacteria and 0.28 g/100 mL yeast, fermented at 32 ℃ for 4 d, and f nally inoculated with acetic acid bacteria. The liquid-state fermentation carried out in shaking f asks yielded a product containing 0.47 g/100 mL non-volatile acids. The total acidity of vinegar produced in a 5 L self-suction fermentor by the semi-continuous submerged fermentation process was no less than 6 g/100 mL, and the volatile acid content was no less than 0.5 g/100 mL, both of which reached the requirements of the Chinese national standard.

Key words:self-suction; semi-continuous fermentation; vinegar; f avor

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702012

中图分类号:TS26

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)02-0075-07

引文格式:

洪厚胜, 赵敏, 骆海燕, 等. 基于风味改善的食醋自吸式半连续酿造工艺优化[J]. 食品科学, 2017, 38(2): 75-81. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702012. http://www.spkx.net.cn

HONG Housheng, ZHAO Min, LUO Haiyan, et al. Optimization of self-suction semi-continuous vinegar fermentation for flavor improvement[J]. Food Science, 2017, 38(2): 75-81. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702012. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-03-31

基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2012AA021201)

作者简介:洪厚胜(1965—),男,教授,博士,研究方向为生物过程装备。E-mail:hhs@njtech.edu.cn