四川泡菜中产γ-氨基丁酸微生物的系统发育与表达能力评估

曾林 1,2，刘波 1，许小艳 1，张庆 1,2,*，杨颖 3，卢倩文 1,2，赵婷婷 1,2，唐洁 1

（1.西华大学食品与生物工程学院，四川省食品生物技术重点实验室，四川成都 610039；2.西华大学古法发酵（酿造）生物技术研究所，四川成都 610039；3.山东省食品药品检验研究院，山东济南 250101）

摘要：为拓展产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）微生物资源，以四川泡菜为分离源，从中分离产GABA的乳酸菌和酵母，并对其GABA表达能力进行评估。通过分离纯化，从四川泡菜中获得了338 株乳酸菌和67 株酵母。采用纸色谱测定，筛选获得12 株乳酸菌和3 株酵母菌具有产GABA的能力。生理生化和系统发育研究揭示12 株乳酸菌分别被鉴定为Lactobacillus acidophilus（占比8.3%）、Lactobacillus fermentum（8.3%）、Lactobacillus kimchii（8.3%）、Lactobacillus suebicus（8.3%）、Lactobacillus brevis（16.7%）、Lactobacillus parafarraginis（8.3%）、Lactobacillus similis（8.3%）、Lactobacillus plantarum（25.2%）和Lactobacillus pentosus（8.3%）；3 株酵母中，2 株被鉴定为Saccharomyces cerevisiae；1 株被鉴定为Candida tanzawaensis。进一步采用高效液相色谱对菌株GABA的表达能力评估发现，乳酸菌Lactobacillus plantarum BC114和Lactobacillus brevis BC237发酵产GABA的能力较强，分别达1 720 mg/L和1 080 mg/L；酵母菌Saccharomyces cerevisiae JM037发酵产GABA的能力较强，达670 mg/L。

关键词：γ-氨基丁酸；四川泡菜；微生物；系统发育；表达能力

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）是由谷氨酸脱羧生成的一种非蛋白质类氨基酸，广泛存在于微生物、植物和动物中 [1-3]。在脊椎动物中，GABA以一种重要的抑制性神经递质存在于中枢神经系统中 [4-5]，具有降低血压、利尿、增强记忆等多种生理功能 [6-8]。目前，获得GABA的方法主要有化学合成、植物富集法和微生物发酵法三大类 [9]。相比而言，化学合成GABA法反应条件复杂、污染大；植物富集法产GABA难度大、含量低；而微生物发酵法产GABA条件温和、安全性好 [10]，成为了目前GABA生产的理想方法。然而，优良菌株的缺乏制约了GABA发酵法的进一步发展。因此，如何获取优良菌株成为了开发GABA微生物发酵法的重要任务。

四川泡菜风味独特、营养丰富，具有开胃、健脾、预防高血压等保健功效，是一种深受消费者喜爱的传统蔬菜发酵食品 [11]。在已有报道中，田伟等 [12]利用16S rRNA分析传统四川发酵泡菜中的细菌多样性，Lactobacillus属占88.4%；张先琴等 [13]利用变性梯度凝胶电泳分析四川泡菜中微生物的多样性，细菌中Lactobacillus为优势菌种，真菌中主要为季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）和奥默柯达酵母（Kodamaea ohmeri）的近缘种。这些结果揭示了四川泡菜中主要微生物为乳酸菌和酵母菌，但只关注了四川泡菜中的益生菌对泡菜营养价值的影响，而对其代谢产物在泡菜中的功能性未关注。乳酸菌和酵母是发酵食品中重要的发酵剂，且其中的谷氨酸脱羧酶活性高，具有发酵生产GABA能力 [14]。徐冬云等 [15]从土壤、泡菜、酸奶等样品中分离筛选的一株嗜酸乳酸菌，发酵液中GABA质量浓度达463 mg/L；Diana等 [16]从西班牙奶酪中分离的L. brevis CECT8183，产GABA质量浓度为100 mg/L；但以四川泡菜为源，对产GABA微生物进行系统发育树的构建与表达能力的评估尚未报道。

本实验以四川泡菜为原料，对分离、筛选产GABA的微生物进行生理生化实验及系统发育树的构建，并利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）对微生物发酵产GABA的能力进行评估。以期为筛选高产GABA微生物、拓宽产GABA菌种资源提供有效依据，而且对功能性四川泡菜的开发具有重要意义。

1 材料与方法

L-谷氨酸钠（L-monosodium glutamate，L-MSG，含量≥98.5%）成都市科龙化工试剂厂；GABA（含量≥99%）上海金穗生物科技有限公司；丹磺酰氯（dansyl chloride，DNS-Cl），含量≥98%）成都华夏化学试剂有限公司；其他试剂为分析纯级试剂。

培养基：MRS肉汤和改良MRS琼脂培养基（含0.75 g/100 mL的CaCO 3）均按文献[17]配制，马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基。

Heraues Multifuge X1R冷冻高速离心机美国Thermo Fisher公司；BHC-1300ⅡA2生物安全柜苏州安泰空气技术有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪德国耶拿分析仪器有限公司；2695型HPLC仪（配有2998紫外检测器）美国沃特世公司。

取泡菜样液25 mL，加入225 mL无菌生理盐水的均质袋中，用拍击式均质器均质5 min。取适量均质液用无菌生理盐水10 倍梯度稀释后涂布于改良MRS培养基和PDA培养基进行分离，于改良MRS培养基中37 ℃条件下倒置培养48 h，于PDA培养基中28 ℃条件下培养72 h。分别挑取单菌落划线纯化3 次。

采用纸色谱定性分析法初筛产GABA微生物。展开剂组分为正丁醇-冰乙酸-水（5∶3∶2，V/V），再添加1.2 g/100 mL茚三酮。以L-MSG标品溶液（5 g/L）和GABA标品溶液（5 g/L）为对照，吸取2 μL发酵液，在滤纸上逐个点样，并编号。再将滤纸在30 ℃恒温条件下展开，展开后将滤纸放入70 ℃烘箱中显色10 min [18]。

按照《酵母菌的特征与鉴定手册》 [19]和《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》 [20]中的鉴定方法进行。

根据X i a n g W e n l i a n g等 [2 1]的方法提取细菌D N A。1 6 S r R N A扩增引物为E u 2 7 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，30 个循环后72 ℃延伸10 min。

根据李可 [22]的方法提取真菌DNA。18S rRNA扩增引物：18S-F（5’-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’）和18S-R（5’-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3’）。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸55 s，36 个循环后72 ℃延伸10 min。

扩增产物连接到pGM-T载体后克隆入感受态细胞大肠杆菌DH5α中，提取重组质粒并对16S rRNA和18S rRNA测序。所得序列提交至NCBI进行BLAST比对，利用MEGA 5.0软件构建系统发育树。

纸色谱法初筛得到的产GABA乳酸菌菌株，将其接种到MRS肉汤（含10 g/L L-MSG）中30 ℃条件下静置发酵48 h，将真菌菌株接种到PDA培养基（含10 g/L L-MSG），28 ℃、120 r/min发酵72 h。发酵液于8 000 r/min条件下离心5 min，取上清液，备用。

利用HPLC对上述菌株产GABA能力进行评估。参照张术聪 [23]的方法对发酵液中GABA进行柱前衍生。HPLC分析条件：色谱柱为岛津-GL INERTSIL ODS-3（4.6 mm×150 mm，5 μm）；紫外检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL；流动相A为甲醇，流动相B为醋酸钠（pH 6.2）-甲醇-四氢呋喃（420∶75∶5，V/V）；流速1 mL/min；梯度洗脱时，流动相B比例为：0～6 min，80%～50%；6～9 min，50%～20%；9～10 min，20%～0%；10～11 min，维持0%；11～15 min，返回80%。

2 结果与分析

从传统四川泡菜样品中共筛选出338 株乳酸菌菌株，67 株真菌菌株。乳酸菌菌落形态（图1A）多数是圆形或椭圆形，表面光滑，直径多数在1～2 mm。显微镜观察乳酸菌菌体形态为杆状或短杆状，革兰氏染色阳性。真菌菌落形态（图1B）菌落多为乳白色，表面光滑、湿润、黏稠、容易挑起，质地均匀，直径多数为2～5 mm。

由图2可知，根据茚三酮显色反应的颜色深度初步判断，利用纸层析方法从获得的338 株乳酸菌和67 株真菌中筛选出12 株乳酸菌和3 株真菌，且发酵底物中L-MSG消耗明显。真菌JM037和乳酸菌BC114发酵液中GABA含量较高。

对筛选出的15 株产GABA菌株进行生理生化实验，结果见表1。将产GABA的15 株菌株全部进行测序，测得序列经Mallard 1.02软件检测后，再通过BioEdit 7.0软件检测，无异常序列。Stackbrandt等 [24]认为细菌16S rRNA序列同源性不低于97%可以认为是一个种（真菌序列比对目前无明确判断标准，参照细菌16S rRNA序列比对标准）。因此，15 株菌株分别被鉴定为Lactobacillus acidophilus（1 株）、Lactobacillus fermentum（1 株）、Lactobacillus malefermentans（1 株）、Lactobacillus suebicus（1 株）、Lactobacillus brevis（2 株）、Lactobacillus kimchii（1 株）、Lactobacillus similis（1 株）、Lactobacillus plantarum（3 株）、Lactobacillus pentosus（1 株）、Saccharomyces cerevisiae（2 株）、Candida tanzawaensis（1 株）。这与生理生化实验中糖和醇的利用结果相符。

为了更明确显示各菌株的分类学地位和系统发育关系，选取相似菌株和代表菌株序列，用MEGA 5.0软件以邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，结果见图3、4。乳酸菌菌株在系统发育树中基本分为8 个分支：1）菌株BC120、BC203、BC114和BC002与L. pentosus和L. plantarum聚为一个分支，其中BC120与L. pentosus相似度为100%，BC203、BC114、BC002与L. plantarum的相似度为100%；2）菌株BC200与L. similis聚为一个分支，相似度为99%；3）BC201与L. kimchii聚为一个分支，相似度为99%；4）BC186和BC237与L. brevis聚为一个分支，相似度为100%；5）BC202与L. suebicus聚为一个分支，相似度为100%；6）BC019与L. malefermentans聚为一个分支，相似度为99%；7）BC110与L. fermentum聚为一个分支，相似度为99%；8）BC112与L. acidophilus聚为一个分支，相似度为99%。图4显示了所筛选的3 株真菌的分类学地位，JM009和JM037与S. cerevisiae聚为一分支，相似度为100%；JM024与C. tanzawaensis聚为一分支，相似度为99%。

表1 生理生化实验结果
Table1 Results of physiological and biochemical tests

注：＋.阳性概率大于等于90%；－.阴性概率大于等于90%；d.阳性概率为11%～89%；N.未检测。

生化特征BC002 BC019 BC110 BC112 BC114 BC120BC186BC200BC201BC202BC203BC237JM009JM024JM037阿拉伯糖d－d－d++d++d+NNN纤维二糖＋－d＋＋＋－d＋d＋－NNN果糖＋－＋＋＋＋＋＋＋－＋＋NNN半乳糖＋－＋＋＋＋d＋d＋＋d＋－＋葡糖糖＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋乳糖＋－＋＋＋＋d－－－＋d＋＋＋麦芽糖＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－＋－甘露醇＋－－－＋＋－－－－＋－－－－甘露糖＋－＋＋＋＋－＋＋－＋－NNN蜜二糖＋－＋d＋＋＋＋－－＋＋NNN棉籽糖＋－＋d＋＋dd－－＋d＋－＋鼠李糖－－－－－d－－－－－－＋＋＋核糖＋＋＋－＋＋＋－＋－＋＋NNN山梨醇＋－－－＋＋－－－－＋－－－－蔗糖＋－＋＋＋＋d＋＋－＋＋－＋－海藻糖＋－dd＋＋－＋＋－＋－＋＋＋木糖d－d－d＋dd＋－dd－－d

利用HPLC对菌株产GABA能力进行评估。其标准曲线为Y＝9×10 6X－18 007（R 2＝0.999 2），可用于菌株发酵液中的GABA定量分析。15 株菌株GABA高效液相定量结果如图5所示。菌株发酵液中GABA质量浓度为280～1 720 mg/L，其中乳酸菌中菌株BC114（L. plantarum）和菌株BC237（L. brevis）发酵产GABA质量浓度较高，分别达1 720 mg/L和1 080 mg/L。周青等 [25]从泡菜中筛选到一株植物乳杆菌，发酵液中GABA质量浓度达1 261 mg/L，并通过正交试验优化发酵条件及其培养基成分，发酵液中GABA产量提高了79%。因此，菌株BC114发酵生产GABA更具有优势，下一步可对其进行发酵条件及其培养基成分的优化，提高该菌株产GABA的能力。真菌中菌株JM037（S. cerevisiae）发酵产GABA质量浓度最高，达670 mg/L，是在四川泡菜中首次分离筛到具有产GABA能力的酿酒酵母菌株，可进一步通过酒精发酵能力实验探讨其在功能性果酒酿造中的应用。

3 结论

从传统四川泡菜中分离筛选出338 株乳酸菌、67 株真菌，利用纸色谱分析法初筛得到具有产GABA能力的12 株乳酸菌和3 株真菌。经鉴定12 株乳酸菌为Lactobacillus属，分别被鉴定为L. acidophilus（占比8.3%）、L. fermentum（8.3%）、L. kimchii（8.3%）、L. suebicus（8.3%）、L. brevis（16.7%）、L. parafarraginis（8.3%）、L. similis（8.3%）、L. plantarum（25.2%）和L. pentosus（8.3%），3 株真菌中2 株为S. cerevisiae、1 株为C. tanzawaensis。并对其GABA表达能力进行了评估，结果显示，菌株发酵液中GABA质量浓度为280～1 720 mg/L。其中，菌株BC114（L. plantarum）发酵液中GABA质量浓度高达1 720 mg/L。该研究结果不仅扩宽了产GABA菌株资源，为高产GABA微生物的筛选提供有效依据，而且对指导富含GABA功能性泡菜的生产具有重要的理论和实践意义。

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Phylogeny and Performance Assessment of γ-Aminobutyric Acid-Producing Microorganisms from Sichuan Pickles

ZENG Lin 1,2, LIU Bo 1, XU Xiaoyan 1, ZHANG Qing 1,2,*, YANG Ying 3, LU Qianwen 1,2, ZHAO Tingting 1,2, TANG Jie 1
(1. Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, College of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Biotechnology Institute of Ancient Brewing, Xihua University, Chengdu 610039, China; 3. Shandong Institute for Food and Drug, Jinan 250101, China)

Abstract：In order to broaden and evaluate microbial resources for producing γ-aminobutyric acid (GABA), lactic acid bacteria and yeast strains with the ability to produce GABA were isolated, screened and identif ed from Sichuan pickles. A total of 338 strains of lactic acid bacteria and 67 strains of yeast were initially isolated from Sichuan pickles. Further, 12 strains of lactic acid bacteria (LAB) and 3 strains of yeast which could produce GABA were screened out by paper chromatography. Then the 12 LAB strains were identif ed as Lactobacillus acidophilus (8.3%), Lactobacillus fermentum (8.3%), Lactobacillus kimchii (8.3%), Lactobacillus suebicus (8.3%), Lactobacillus longer (16.7%), Lactobacillus parafarraginis (8.3%), Lactobacillus similis (8.3%), Lactobacillus plantarum (25.2%) and Lactobacillus pentosus (8.3%), while the 3 yeast strains were identif ed as two strains of Saccharomyces cerevisiae and one strain of Candida tanzawaensis using physiological and biochemical tests and phylogenetic analysis. The GABA-producing ability of these selected strains was further assessed by high-performance liquid chromatography (HPLC). Our results indicated that Lactobacillus plantarum BC114, Lactobacillus brevis BC237 and Saccharomyces cerevisiae JM037 showed higher GABA-producing capability, and the cultured broth supernatants contained 1 720, 1 080 and 670 mg/L GABA, respectively.

Key words：γ-aminobutyric acid; Sichuan pickles; microorganism; phylogeny; performance assessment

基金项目：教育部春晖计划项目（Z2014060）；四川省应用基础项目（2016JY0253）；四川省大学生创新训练项目（201510623081）；西华大学研究生创新基金项目（YCJJ2016048）

作者简介：曾林（1992—），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物技术。E-mail：18202837933@163.com

*通信作者：张庆（1979—），男，副教授，博士，研究方向为食品微生物技术。E-mail：biozhangq@163.com

曾林, 刘波, 许小艳, 等. 四川泡菜中产γ-氨基丁酸微生物的系统发育与表达能力评估[J]. 食品科学, 2017, 38(2): 87-91.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702014. http://www.spkx.net.cn

ZENG Lin, LIU Bo, XU Xiaoyan, et al. Phylogeny and performance assessment of γ-aminobutyric acid-producing microorganisms from Sichuan pickles[J]. Food Science, 2017, 38(2): 87-91. (in Chinese with English abstract)

四川泡菜中产γ-氨基丁酸微生物的系统发育与表达能力评估

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论