腐败发酵蔬菜中产膜醭细菌的分离鉴定及其生长特性分析

何鹏晖1,钱 杨1,王 猛2,杨建涛1,赵婷婷1,蒋云露3,车振明1,饶 瑜1,*

(1.西华大学食品与生物工程学院,四川 成都 610039;2.四川东坡中国泡菜产业技术研究院,四川 眉山 620020;3.四川省食品药品检 验检测院,四川 成都 610097)

摘 要:以发酵蔬菜为研究对象,分离和鉴定其中形成腐败膜醭的主要微生物,并分析其生长特性。利用胰蛋白胨大豆琼脂培养基分离培养发酵蔬菜腐败膜醭中的微生物,挑取50 株单克隆回接到发酵盐卤胰蛋白胨培养基中培养,将能够在培养液表面显著形成膜醭的菌株进行16S rDNA或18S rDNA分子生物学鉴定。结果表明这6 株菌均为细菌,分别为枯草芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、科氏葡萄球菌科氏亚种、普罗威登斯菌、克雷伯氏杆菌属和阴沟肠杆菌。利用5 种发酵蔬菜模拟培养基培养上述6 株细菌,发现不同菌株在不同培养基中产膜醭情况不同。枯草芽孢杆菌和科氏葡萄球菌科氏亚 种除了能形成膜醭外,还能引起培养基pH值升高,并对氮源需求不高。克雷伯氏杆菌属和普罗威登斯菌仅在发酵盐卤胰蛋白胨培养基和发酵蔬菜汁胰蛋白胨培养基中形成膜醭。上述细菌可能是发酵蔬菜腐败膜醭形成的关键细菌和潜在威胁。

关键词:膜醭;发酵蔬菜;模拟培养基;16S rDNA;pH值变化

发酵蔬菜主要是以乳酸菌为主的复杂微生物体系(由蔬菜和辅料等带入)在相对封闭的池或坛中自然发酵而成[1],世界各地都有生产和食用,如中国泡菜、韩国泡菜[2]以及欧洲的sauerkraut和酸黄瓜等[3-4]。目前,大多数的发酵蔬菜产品都已逐渐由原来的家庭作坊生产转变成工业化生产,迈向工业化生产的成熟期[5]。但无论是家庭制作还是工业化生产的发酵蔬菜,在整个发酵过程中和发酵后都保留有丰富的微生物数量和多样性。这样复杂的微生物菌群中也会存在一些腐败微生物,它们在一定条件下会打破原有的微生物生态平衡并大量繁殖,通过生成令人不悦的风味物质或分泌胞外酶破坏蔬菜组织结构[6]、产生腐败膜醭(pellicle,俗称“生花”)[7]、代谢发酵体系中的乳酸引起pH值的升高并促使其他腐败微生物的生长[8],进而导致发酵蔬菜的腐败,对发酵蔬菜行业造成巨大的经济损失。

膜醭即聚集在空气与液体交界面的,被细胞自身分泌的胞外大分子物质包裹使得单细胞个体相互黏附在一起的、有组织的细胞群体[9]。其形成机理为:从细胞水平来看,单一运动细胞经过移动互相粘黏形成难运动的细胞长链,再通过产生细胞外基质使其对齐并相互黏附;从宏观来看,先形成薄的膜醭,再变厚,随后形成成熟膜醭[10]。它是发酵蔬菜腐败最常见的现象之一。一般认为发酵蔬菜盐卤表面腐败膜醭的形成主要由真菌引起,如克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)和白地霉(Galactomyces candidum)[6]。但敖晓琳等[7]在研究中发现,发酵蔬菜盐卤表面的腐败膜醭中存在着芽孢杆菌。王猛等[11]在比较分析不同盐浓度四川泡菜腐败前后的微生物时也发现,在腐败膜醭中有细菌存在,但是未对细菌是否形成膜醭进行探讨。国内外有很多研究者对细菌形成膜醭进行了报道[12-13],但对能在发酵蔬菜中存在并形成膜醭的细菌的报道却很少。因此,本实验从发酵蔬菜盐卤表面腐败膜醭中的微生物入手,对其进行分离、回接并鉴定,分析菌种种类及其膜醭形成特性,对发酵蔬菜表面腐败膜醭形成的预防和控制提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与材料

新鲜笋壳青菜为市售。蔬菜发酵菌种为Lactobacillus plantarum E11,发酵蔬菜前期研究中分离并保藏[14]

1.1.2 试剂与培养基

放线菌酮、DNA Marker、Taq DNA连接酶、dNTPs、DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒 北京天根生化科技有限公司;RNase A 美国Sigma公司。

胰蛋白胨大豆琼脂(tryptone soy agar,TSA)培养基:胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、1 000 mL蒸馏水,pH值为6.0±0.2,121 ℃灭菌30 min。

胰蛋白胨大豆肉汤(tryptone soy broth,TSB)培养基:胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、氯化钠5 g、1 000 mL蒸馏水,pH值为6.0±0.2,121 ℃灭菌30 min。

本研究中所用模拟培养基如表1所示。

表 1 用于分析发酵蔬菜膜醭形成菌特性的模拟培养基
Table 1 Preparation of model media used to characterize pellicleforming isolates from fermented vegetable

1.2 仪器与设备

台式冷冻离心机 美国Beckman公司;聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪、凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司;电泳仪 北京六一仪器厂;立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;SHA-B恒温振荡器 金坛市富华仪器有限公司;SW-CJ-IF洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;pHS-3C酸度计成都世纪方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蔬菜发酵

将新鲜笋壳青菜用清水洗净,晾干。取800 g洗净晾干的笋壳青菜于泡菜坛中,向坛中加入1 500 mL含食盐质量浓度为6 g/100 mL的凉开水,凉开水中已加入活化的L. plantarum E11(终浓度为106CFU/mL)。在室温下静置发酵和贮藏,直至发酵盐卤表面形成腐败膜醭。

1.3.2 产膜醭微生物的分离

从长有腐败膜醭的泡菜坛中用无菌玻璃棒挑取盐卤表面的薄膜于5 mL无菌生理盐水(0.9% NaCl),将其振荡摇匀后进行等梯度稀释至10-3~10-5,分别取100 μL各稀释度的菌悬液均匀涂布于TSA培养基,再倒置于30 ℃恒温培养箱中恒温培养24~36 h。

1.3.3 产膜醭微生物的回接

随机挑取5 0 个形态不同的单克隆(编号为P1~P50)于5 mL TSB培养基30 ℃摇床培养12~18 h后,取500 μL悬浮液接种于5 mL TFB培养基中,30 ℃静置培养5~7 d。

1.3.4 产膜醭微生物的分子生物学鉴定

将能够在TFB培养基表面形成膜醭的单克隆菌株进行分子生物学鉴定。用DNA提取试剂盒分别提取各单克隆菌株的基因组DNA,1.0%琼脂糖凝胶电泳检验结果。以提取的基因组DNA为模板,细菌以Eu27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3’)和1490R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为引物,PCR体外扩增条件为:95 ℃、5 min;95 ℃、1 min、50 ℃、1 min、72 ℃、2 min,35 个循环;72 ℃、10 min,进行扩增16S rDNA片段。真菌以NSl(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)和NS4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)为引 物,其PCR体外扩增条件为:94 ℃、3 min;94 ℃、30 s,40 ℃、1 min,72 ℃、1 min,30 个循环;72 ℃、10 min,进行扩增18S rDNA片段。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检验PCR结果。

PCR扩增产物经胶回收纯化,送成都擎科生物科技有限公司测序,测得的序列与NCBI GenBank数据库进行相似性分析,并通过Clustal X软件多重比对后用MEGA6.0软件中的Neighbor-Joining法进行构建系统发育树。

1.3.5 产膜醭微生物在不同培养基中产膜醭情况分析

将经过16S rDNA分子生物学鉴定后的菌株分别接种于TSB培养基,30 ℃、180 r/min摇床培养12~18 h。再分别取培养的菌悬液2 mL接种于50 mL TSB、VJ、FB、TFB、FVJ和TFVJ培养基中,摇匀后,分别分装到5 支无菌试管中,30 ℃静置培养10~12 d。于第1、3、5、7、11天观察膜醭形成情况并取出一支试管进行pH值的测定。

2 结果与分析

2.1 产膜醭菌株的分离

将制备的发酵蔬菜静置贮藏至盐卤表面形成腐败膜醭后,用无菌玻璃棒挑取膜醭于5 mL生理盐水,混匀进行10 倍梯度稀释后涂布TSA培养基。30 ℃倒置培养后,稀释度为10-4的TSA上长出212 个菌落,从中随机挑取50 个单克隆于5 mL TSB培养基振荡培养过夜,并分别编号为P1~P50。

2.2 产膜醭菌株的回接

取500 μL过夜培养的单克隆P1~P50于5 mL TFB培养基中,静置培养7 d后发现有部分菌株已形成膜醭。最终筛选出6 株形成膜醭速度快且膜醭较厚的菌株,其编号分别为P5、P11、P17、P29、P37和P48。由图1可知,P5、P17和P37形成的膜醭厚,且P5和P17的培养液比较透明。P11、P29和P48形成片状薄膜醭,且培养液比较浑浊。

图 1 6 株菌株在TFB培养基表面形成膜醭情况
Fig. 1 Pellicle formation by six isolates on the surface ofTFB

2.3 产膜醭微生物的分子鉴定结果分析

图 2 细菌基因组DNA(A)和16S rDNA片段PCR扩增产物(B)琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of different bacteria (A) and PCR-amplified products of their 16S rDNA (B)

将P5、P11、P17、P29、P37和P48用TSB液体培养基振荡培养过夜后,其菌液分别用DNA提取试剂盒提取总基因组DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳分析。从图2A可以看到,没有明显的拖尾现象,有亮带,且片段大小超过15 kb,达到DNA提取要求。以基因组DNA为模板,分别进行了16S rDNA和18S rDNA PCR扩增,仅出现16S rDNA扩增产物,片段大小在1~2 kb之间(图2B),琼脂糖凝胶电泳条带清晰。因此判断这6 株菌株均为细菌。

将PCR扩增的16S rDNA片段与GenBank数据库进行相似性分析,并通过Clustal X软件多重比对后,用MEGA 6.0软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树见图3。Devereux等[15]认为当16S rRNA的序列同源性不小于97%时可以认为是一个属,同源性不小于98%时则可以认为是同一个种。进行鉴定的6 株菌株属于6 个菌种,菌株P5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、P11为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、P17为科氏葡萄球菌科氏亚种(Staphylococcus cohnii subsp. cohnii)、P29为普罗威登斯菌(Providencia vermicola)、P37为克雷伯氏杆菌属(Klebsiella sp.)以及P48为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。

图 3 基于16S rDNA构建的发酵蔬菜中产膜醭细菌的系统发育树
Fig. 3 Phylogentic tree based on 16S rDNA sequences of pellicleforming strains

普遍认为,腐败的发酵蔬菜表面形成的膜醭主要是由真菌引起的,钟小廷[16]和饶瑜[6]等研究发现发酵蔬菜腐败膜醭中的真菌主要为毕赤酵母属;Chapot-Chartier等[17]发现在一定的条件下Lactococcus lactis能够形成膜醭。Armitano等[10]发现不仅革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌能够形成膜醭,革兰氏阴性菌如Acinetobacter也能形成膜醭。本实验通过把从膜醭中分离鉴定出来的6 株菌株回接到TFB中,发现这6 株菌株都能够形成不同程度的膜醭,充分证明了发酵蔬菜表面的腐败膜醭不仅是由真菌引起的,细菌也能够形成腐败膜醭。

2.4 产膜醭细菌在不同培养基中产膜醭特性分析

2.4.1 产膜醭细菌在不同培养基中产膜醭情况

将上述6 株菌株接种到TSB、VJ、FB、TFB、FVJ和TFVJ 6 种培养基中,30 ℃静置培养,观察其长膜情况(表2)。将不同程度的膜醭形成情况分为4 个层次如图4所示。由表2可知,枯草芽孢杆菌产膜醭能力很强,能在TSA、VJ、FB、TFB和TFVJ中形成膜醭,且产膜醭量比较多,培养3 d就能够产生片状薄膜醭,与Trejo等[18]的研究结果相吻合。科氏葡萄球菌科氏亚种产膜醭的相关文献报道非常少,只有少量文献报道了科氏葡萄球菌科氏亚种能够在非生命固体表面形成生物膜[19]。本实验中分离得到的科氏葡萄球菌科氏亚种能在6 种培养基中产生膜醭,在TFB培养基中产膜醭能力最强,能够产生片状厚膜醭,其产膜醭时间与枯草芽孢杆菌产膜时间大致相同,但在FVJ培养基中第7天才长膜醭,其原因可能是由于FVJ培养基的pH值较低(约3.5左右)。枯草芽孢杆菌和科氏葡萄球菌科氏亚种在VJ培养基中成膜情况比在FB和FVJ中好,表明这两株菌株形成膜醭易受到pH值的影响。

表 2 产膜醭细菌在不同培养基中的膜醭形成情况
Table 2 Pellicle-forming abilities of different bacteria in different media

注:空白表示菌株未生长;-.未长膜醭;+.有零星膜醭;++.有块状膜醭;+++.连成一片的薄膜醭;++++.连成一片且较厚的膜醭。

图 4 不同程度的膜醭
Fig. 4 Different degrees of pellicle formation

有很多文章报道了阴沟肠杆菌产生生物膜[20-22],但是关于产生膜醭的报道却很少,分析阴沟肠杆菌在6 种不同培养基中成膜情况,发现它在VJ、TSB、TFB和TFVJ等培养基中能够产生不同程度的膜醭,在FB和FVJ中不能产生膜醭,究其原因可能是FB和FVJ这两种培养基pH值较低(低于4.0),抑制其生长[23]。克雷伯氏杆菌属、弗氏柠檬酸杆菌和普罗威登斯菌在5 种模拟培养基中产膜情况大致相同。克雷伯氏杆菌属在TFVJ中产膜量增大,能产生片状厚膜醭,但在TFB只能产生零星膜醭。弗氏柠檬酸杆菌能在TFB中形成较厚的片状膜醭,但在TFVJ中能形成片状膜醭。而普罗威登斯菌在TFB和TFVJ中都只能形成少量膜醭。但是3 株菌株都不能在VJ培养基中形成膜醭,表明发酵体系的低pH值环境可能会胁迫这3 株菌株形成膜醭,进而抵抗外界环境的压力达到保护自己的目的[16]

分析培养基对细菌形成膜醭的影响发现,不同菌株在不同培养基条件下形成的膜醭情况不同。克雷伯氏杆菌属和普罗威登斯菌在TFB和TFVJ条件下,比TSB条件下更易形成膜醭,说明克雷伯氏杆菌属和普罗威登斯菌仅在发酵蔬菜条件下特异的形成膜醭并引发腐败。FB和FVJ这2种培养基是最不适合细菌形成膜醭的,虽然这2种培养基的成分与发酵蔬菜的营养成分也很接近,但缺乏氮源(没有添加胰蛋白胨),且pH值太低不利于产膜细菌的生长繁殖。而枯草芽孢杆菌和科氏葡萄球菌科氏亚种在FB或FVJ培养基中也能形成膜醭,说明其对氮源需求不高,更有可能是发酵蔬菜腐败膜醭形成的关键细菌和潜在威胁。

2.4.2 不同培养基培养产膜醭细菌过程中环境pH值的变化

图 5 不同培养基培养产膜醭细菌过程中的环境pH值变化
Fig. 5 Changes in pH value during the growth of pellicle-forming strains in different media

由图5可知,绝大多数培养基在培养产膜醭细菌的过程中pH值呈上升趋势,到7.5~8.0趋于稳定,部分培养基的pH值没有变化是因为菌株在培养过程中未能生长。结合表2和图5进行综合分析发现,菌株在生长和膜醭形成过程中培养基pH值升高,究其原因可能是某些模拟培养基中添加了胰蛋白胨,在被菌株利用后引起培养基pH值升高,或者是某些菌株在生长和产膜醭过程中利用代谢产物引起培养基pH值升高。如枯草芽孢杆菌和科氏葡萄球菌科氏亚种在FB或FVJ培养基中开始形成膜醭时pH值高于5.0,表明这两株菌株除了能形成膜醭外,还能引起培养基pH值升高,这一特性与能利用乳酸引起发酵蔬菜腐败的微生物相同,这也是发酵蔬菜腐败的另一典型特征[24-25]

3 结 论

从发酵蔬菜膜醭中分离出的6 株菌株,经16S rDNA分子生物学鉴定均为细菌,分别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、科氏葡萄球菌科氏亚种(Staphylococcus cohnii subsp. cohnii)、普罗威登斯菌(Providencia vermicola)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella sp.)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。将6 株 菌株接种到模拟培养基中,菌株在生长和膜醭形成过程中环境pH值升高,且不同的菌株在不同培养基中产膜醭情况不同。枯草芽孢杆菌和科氏葡萄球菌科氏亚种对氮源要求不高,能在没有加胰蛋白胨的FB和FVJ中形成膜醭,同时在生长繁殖过程中还能引起培养基pH值升高,这也是发酵蔬菜腐败的另一典型特征。克雷伯氏杆菌属和普罗威登斯菌仅在TFB和TFVJ形成膜醭,这些菌株可能是发酵蔬菜腐败膜醭形成的关键细菌和潜在威胁。在发酵蔬菜实际生产和腐败过程中,上述产膜醭细菌共存于同一发酵蔬菜体系,它们之间的时间和空间地位、协同或竞争作用等,还有待进一步研究。本实验将为发酵蔬菜腐败膜醭形成机理的研究和腐败膜醭的防控提供一定的理论基础。

参考文献:

[1] 王卫东, 陈安徽, 杨万根, 等. 人工发酵蔬菜的研究进展[J]. 食品科学, 2010, 31(21): 413-416.

[2] 卢沿钢, 董全. 中、日、韩三国泡菜加工工艺的对比[J]. 食品发酵与科技, 2011, 47(4): 5-9. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.2011.04.002.

[3] PEÑAS E, FRIAS J, SIDRO B, et al. Impact of fermentation conditions and refrigerated storage on microbial quality and biogenic amine content of sauerkraut[J]. Food Chemistry, 2010, 123(1): 143-150. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.04.021.

[4] SUZANNE D, JOHANNINGSMEIER, ROGER F, et al. Metabolism of lactic acid in fermented cucumbers by Lactobacillus buchneri and related species, potential spoilage organisms in reduced salt fermentations[J]. Food Microbiology, 2013, 35(1): 129-135. DOI:10.1016/j.fm.2013.03.004.

[5] 焦巧芳, 竺利红, 施跃峰, 等. 泡菜的营养保健价值及其规模化生产的研究进展[J]. 安徽农学通报, 2009, 15(7): 56-59. DOI:10.3969/ j.issn.1007-7731.2009.07.024.

[6] 饶瑜, 常伟, 龚丽, 等. 四川泡菜生花酵母的分离与鉴定[J].食品与发酵科技, 2013, 49(3): 19-22. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.2013.03-005.

[7] 敖晓琳, 蔡义民, 夏姣, 等. 引起泡菜生花腐败微生物的分离鉴定[J].食品科学, 2013, 34(21): 204-208. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201321042.

[8] FRANCO W, PEREZ-DIAZ I M. Microbial interactions associated with secondary cucumber fermentation[J]. Journal of Applied Microbiology, 2013, 114(1): 161-172. DOI:10.1111/jam.12022.

[9] KOBAYASHI K. Bacillus subtilis pellicle formation proceeds through genetically de ned morphological changes[J]. Journal of Bacteriology, 2007, 189(13): 4920-4931. DOI:10.1128/JB.00157-07.

[10] ARMITANO J, MÉJEAN V, JOURLIN-CASTELLI C. Gram-negative bacteria can also form pellicles[J]. Environmental Microbiology Reports, 2014, 6(6): 534-544. DOI:10.1111/1758-2229.12171.

[11] 王猛, 蒋云露, 杨建涛, 等. 不同盐质量浓度四川泡菜腐败前后微生物的分析比较研究[J]. 食品科学, 2015, 36(13): 184-189. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201513034.

[12] LIANG Y L, GAO H C, CHEN J R, et al. Pellicle formation in Shewanella oneidensis[J]. BMC Microbiology, 2010, 10: 291. DOI:10.1186/1471-2180-10-291.

[13] VISICK K L, QUIRKE K P, MCEWEN S M. Arabinose induces pellicle formation by Vibrio fischeri[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(6): 2069-2080. DOI:10.1128/AEM.03526-12.

[14] RAO Y, CHANG W, XIANG W, et al. Screening and performance of Lactobacillus plantarum E11 with bacteriocin-like substance secretion as fermentation starter of sichuan pickle[J]. Food Safety, 2013, 33(4): 445-452. DOI:10.1111/jfs.12075.

[15] DEVEREUX R, HE S H, DOYLE C L, el a1. Diversity and origin of Desulfovibrio species: phylogenetic de nition of a family[J]. Journal of Bacteriology, 1990, 172(7): 3609-3619.

[16] 钟小廷, 樊君, 罗红刚, 等. 泡菜生花酵母的鉴定及生理特性研究分析[J]. 食品与发酵科技, 2014, 50(5): 19-22. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.2014.05-004.

[17] CHAPOT-CHARTIER M P, VINOGRADOV E, SADOVSKAYA I, et al. Cell surface of Lactococcus lactis is covered by a protective polysaccharide pellicle[J]. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(14): 10464-10471. DOI:10.1074/jbc.M109.082958.

[18] TREJO M, DOUARCHE C, BAILLEUX V, et al. Elasticity and wrinkled morphology of Bacillus subtilis pellicles[J]. PNAS, 2013, 110(6): 2011-2016. DOI:10.1073/pnas.1217178110.

[19] WOJTYCZKA R D, ORLEWSKA K, KEPA M, et al. Biofilm formation and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus epidermidis strains from a hospital environment[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2014, 11(5): 4619-4633. DOI:10.3390/ijerph110504619.

[20] ZHOU G, LI L J, SHI Q S, et al. Efficacy of metal ions and isothiazolones in inhibiting Enterobacter cloacae BF-17 biofilm formation[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2014, 60(1): 5-14. DOI:10.1139/cjm-2013-0492.

[21] NYENJE M E , GREEN E, NDIP R N. Evaluation of the effect of different growth media and temperature on the suitability of biofilm formation by Enterobacter cloacae strains isolated from food samples in South Africa[J]. Molecules, 2013, 18(8): 9582-9593. DOI:10.3390/ molecules18089582.

[22] RASMUSSEN M, MINTEER S D. Long-term arsenic monitoring with an Enterobacter cloacae microbial fuel cell[J]. Bioelectrochemistry, 2015, 106: 207-212. DOI:10.1016/j.bioelechem.2015.03.009.

[23] FRANCO W, PEREZ-DIAZ I M. Role of selected oxidative yeasts and bacteria in cucumber secondary fermentation associated with spoilage of the fermented fruit[J]. Food Microbiology, 2012, 32(2): 338-344. DOI:10.1016/j.fm.2012.07.013.

[24] FRANCO W, PEREZ-DIAZ I M. Microbial interactions associated with secondary cucumber fermentation[J]. Journal of Applied Microbiology, 2013, 114(1): 161-172. DOI:10.1111/jam.12022.

[25] FRANCO W, P☒REZ-D☒AZ I M, JOHANNINGSMEIER S D, et al. Characteristics of spoilage-associated secondary cucumber fermentation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(4): 1273-1284. DOI:10.1128/AEM.06605-11.

Isolation, Identification and Growth Characteristic Analysis of Pellicle-Forming Bacteria from Spoiled Vegetable

HE Penghui1, QIAN Yang1, WANG Meng2, YANG Jiantao1, ZHAO Tingting1, JIANG Yunlu3, CHE Zhenming1, RAO Yu1,*
(1. College of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Sichuan Dongpo Chinese Paocai Industrial Technology Research Institute, Meishan 620020, China; 3. Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610097, China)

Abstract:The ma in microbes which could form pellicle in spoiled vegetable were isolated and identified. The growth characteristics of these microbes were also analyzed. Tryptone soy agar (TSA) medium was used to isolate the pellicleforming microorganisms. Fifty isolates were selected randomly from TSA medium and inoculated into tryptone soy broth medium supplemented with fermented brine (TFB). Six isolates which could form pellicle on the surface of the medium were subjected to 16S rDNA or 18S rDNA identification. The results showed that the pellicle-forming agents were all ba cteria, which were identi ed as Bacillus subtilis, Citrobacter freundii, Staphylococcus cohnii subsp. cohnii, Providencia vermicola, Klebsiella sp. and Enterobacter cloacae. The pellicle-forming abilities of each isolate in different model media were different. Bacillus subtilis and Staphylococcus cohnii subsp. cohnii could also increase the pH value of the medium and had lower nitrogen requirement. Klebsiella sp. and Providencia vermicola could form pellicle only in TFB and TSA supplemented with squeezed juice from fermented vegetable (TFVJ). The bacteria des cribed above might be the key agents for pellicle formation and pose a potential risk for fermented vegetable quality.

Key words:pellicle; fermented vegetable; model media; 16S rDNA; pH variation

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710016

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)10-0092-06

引文格式:

何鹏晖, 钱杨, 王猛, 等. 腐败发酵蔬菜中产膜醭细菌的分离鉴定及其生长特性分析[J]. 食品科学, 2017, 38(10): 92-97.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710016. http://www.spkx.net.cn

HE Penghui, QIAN Yang, WANG Meng, et al. Isolation, identification and growth characteristic analysis of pellicle-forming bacteria from spoiled vegetable[J]. Food Science, 2017, 38(10): 92-97. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spk x1002-6630-201710016. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-08-02

基金项目:四川省科技厅应用基础项目(2015JY0142);教育部春晖计划项目(Z2015123);西华大学研究生创新基金项目(ycjj2016046)

作者简介:何鹏晖(1991—),男,硕士研究生,研究方向为食品微生物安全。E-mail:240538743@qq.com

*通信作者:饶瑜(1982—),女,副教授,博士,研究方向为食品微生物安全。E-mail:ryfish@163.com