表1 牛肉饼的配方
Table 1 Formulation of beef patties
朱迎春1，王水晶2，马俪珍3,*，党晓燕1，王 洋4
（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2. 陕西博鸿生物科技有限公司，陕西 西安 710000；3.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384；4.天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）
摘要：探究不同脂肪添加量的牛肉饼在反复冻融过程中，其肌原纤维蛋白氧化、理化性质及感官品质的变化情况，阐明反复冻融、脂肪含量与蛋白氧化之间的关系，并分析由此导致的产品品质变化。将绞碎的牛背部脂肪按比例添加于绞碎的牛背最长肌肉中，分别添加相同的食盐等辅料，制得3 组脂肪含量不同的牛肉饼，即未添加牛脂肪组（F0）、添加10%牛脂肪组（F10）和添加20%牛脂肪组（F20）。真空包装后于－18 ℃冷冻贮藏，期间反复冻融5 次循环，每次冻融后测定样品的感官品质、硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid resctive substances，TBARS）值、色泽参数、解冻损失率，提取肌原纤维蛋白测定羰基含量、总巯基含量、蛋白溶解度，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）观察肌原纤维蛋白的聚集和降解程度。结果表明：随着冻融次数和脂肪含量的增加，牛肉饼的TBARS值、解冻损失率、亮度（L*）值、黄度（b*）值、羰基含量显著增加（P＜0.05），红度（a*）值、总巯基含量、蛋白溶解性显著降低（P＜0.05）。SDS-PAGE结果显示，随冻融次数和脂肪含量的增加，肌原纤维蛋白的肌球蛋白重链发生聚合，副肌球蛋白和肌动蛋白发生降解。牛肉饼经油煎熟制后进行感官评价，其品质随脂肪含量增加而提高，但随冻融次数增加而下降，特别是冻融3 次之后的牛肉饼质地变硬，多汁性下降。相关性分析表明，冻融次数及脂肪含量均与蛋白氧化指标（羰基、总巯基、蛋白溶解性）及理化指标（TBARS值、解冻损失率、L*、a*、b*）极显著相关（P＜0.01）。实验表明，反复冻融引起牛肉肌原纤维蛋白氧化，导致牛肉饼品质下降；脂肪含量的增加提高了感官得分，但同时加速了蛋白氧化和理化性质的变化。所以在实际的生产中，适当的脂肪含量可提高牛肉制品的品质，但注意冷冻贮藏要保持温度尽可能低且恒定。
关键词：牛肉饼；冻融循环；脂肪含量；肌原纤维蛋白；氧化；品质特性
朱迎春, 王水晶, 马俪珍, 等. 不同脂肪添加量的牛肉饼在反复冻融过程中的品质变化[J]. 食品科学, 2017, 38(11): 174-181. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711028. http://www.spkx.net.cn
ZHU Yingchun, WANG Shuijing, MA Lizhen, et al. Quality changes of beef patties with different fat contents during multiple freeze-thaw cycles[J]. Food Science, 2017, 38(11): 174-181. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201711028. http://www.spkx.net.cn
冷冻贮藏是目前应用最广泛的肉与肉制品保存方法，它能较好地保持产品品质并使产品具有较长货架期。在全球肉类进出口市场中，每年冷冻肉的进出口额超过130亿美元。但是如果冷链体系不规范，在贮存、运输、零售及销售过程中肉类极易经历反复的冷冻-解冻（冻融）过程[1]。随着冻融次数增加，肌纤维细胞会破裂使胞内酶释放到肌浆中，促进肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）氧化[2]。大量研究证实MP氧化不仅使蛋白质的凝胶性、乳化性、黏度、溶解度和持水能力等功能特性发生变化，也会使肉制品物理和化学性质发生改变，导致食用品质下降[3-6]。因此由反复冻融引起的肉类食用品质问题日益受到供应商和消费者的关注。
随着生活水平的提高和生活节奏的加快，方便、营养、卫生的快餐食品越来越受到人们的青睐。近30年来，以汉堡包为代表的西式快餐在快餐业占据着较大的份额。牛肉饼作为汉堡包中必不可少的组成部分承载着提供营养、增加口感的作用[7]。牛肉饼中适量的脂肪不仅可以提高产品的风味，增强产品的光滑性和多汁性，而且能够降低成本。但脂肪含量的增加在提高口感的同时，也可能会促进蛋白氧化，进而影响产品的食用品质和营养价值。另外，制作成型的牛肉饼在冷冻保存过程中存在着反复冻融的风险，目前对牛肉饼在反复冻融过程中其理化指标和MP氧化变化鲜有报道。
本研究以牛背最长肌为原料，绞碎成牛肉粒，添加不同比例牛背部脂肪和其他配料制得脂肪含量不同的牛肉饼，测定反复冻融过程中样品的感官品质、理化指标（硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、色泽参数、解冻损失率），提取MP测定蛋白氧化程度（羰基含量、总巯基含量、蛋白溶解度），并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）观察MP的聚集和降解程度，研究冻融次数和脂肪含量对MP氧化及牛肉饼品质特性的影响，阐明反复冻融、脂肪含量与产品品质之间的关系，为在实际生产中提高牛肉制品品质提供科学依据。
1.1 材料与试剂
牛背最长肌、牛背部脂肪购于天津科尔沁牛肉专卖店。
2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、三氯乙酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、Tris-HCl、乙醚、石油醚、硼酸、氯仿、乙酸乙酯、氧化镁、盐酸胍、甲醛、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、CuSO4、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide，BIS）、β-巯基乙醇、N-乙基马来酰亚胺（N-ethyl maleimide，NEM）、过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-methyl ethylenediamine，TEMED）、尿素、考马斯亮蓝G-250、SDS、牛血清白蛋白均为分析纯。
1.2 仪器与设备
PB-10酸度计 瑞典Sartorius公司；MM12绞肉机广东韶关市新通力食品机械有限公司；JT3101N分析天平上海精密实验设备有限公司；ST40R冷冻离心机 德国Theromo Scientific公司；FA25高速剪切乳化分散机上海弗鲁克流体机械制造有限公司；WFJT200可见分光光度计 尤尼柯仪器有限公司；PowerPacTM Bas电泳仪美国Bio-Rad公司；CM-5色差仪 日本Konica Minolta公司。
1.3 方法
1.3.1 肉饼制作及实验设计
取宰后经过排酸处理的牛背最长肌和牛背部脂肪，分别绞碎（绞肉机筛板3 mm），将瘦肉、牛背部脂肪、调味料、植物油等辅料按表1比例添加，根据牛背部脂肪添加量（按肉总质量的0%、10%和20%）分别标记为F0、F10和F20，搅拌均匀，4 ℃条件下腌制1 h，称取肉馅（100±2） g于特制模具中，制成直径为8 cm，高度为1 cm的牛肉饼（beef patties，BP），每个BP放于一个聚乙烯袋中，聚乙烯袋透氧性为0.6 cm3/（100 m2·24 h·0 ℃），透水性为0.6 g/（100 m2·24 h·38 ℃），真空包装后，取出0 d样品用于指标测定，其余样品在（－18±1） ℃条件下冻藏，7 d后全部取出，在室温条件下进行流水解冻，待肉样中心温度达到0～2 ℃即完成第1次冷冻-解冻的冻融循环过程，留出检测样品，剩余肉样冷冻并依次进行第2、3、4、5次冷冻-解冻循环并测定各项指标。
表1 牛肉饼的配方
Table 1 Formulation of beef patties
1.3.2 基本营养成分的测定
蛋白质含量测定：参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》；粗脂肪含量测定：参照GB 5009.6—2010《食品中脂肪的测定》；水分含量测定：参照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》；灰分含量测定：参照GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》。
1.3.3 色差的测定
取不同脂肪含量的牛肉糜填充于比色皿内，压实、抹平，保证测定表面平整无气泡。使用D65、10☒标准光源，将待测样品置于色差仪反射区（1 cm），使反射区完全覆盖。先利用仪器自带白板进行矫正，然后进行测量，并记录所测样品的亮度（L*）、红度（a*）、黄度（b*）值。
1.3.4 解冻损失率的测定
准确称量解冻前肉饼的质量m1和解冻后肉饼的质量m2，解冻损失率（thawing loss，TL）计算如公式（1）所示。
1.3.5 MP的制备
MP提取依照Jiang Xinjing等[8]的方法略加修改：准确称取5 g肉样，加4 倍体积的pH 7.0缓冲液（包含0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、10 mmol/L Na2HPO4），13 000×g匀浆30 s，在4 ℃ 2 000×g离心15 min，弃上清液，重复3 次，再加入8 倍的洗液（0.1 mol/L NaCl），13 000×g匀浆30 s，2 000×g、2 ℃离心15 min。弃上清液，再重复匀浆离心1 次，第3次加洗液匀浆后，用两层纱布过滤，用0.1 mol/L HCl调滤液的pH值为6.2。将调好pH值的蛋白2 000×g、2 ℃离心15 min，弃上清液即得到MP。将制备好的MP，保存在冰盒里放置在0～4 ℃冰箱中，48 h之内使用。
1.3.6 蛋白羰基含量的测定
羰基含量的测定参照Oliver等[9]的方法。取100 μL质量浓度为25 mg/mL的蛋白溶液放入10 mL塑料离心管中，每管中加入2 mL浓度为10 mmol/L DNPH，振荡1 h（期间每隔10 min旋涡振荡一次），添加2 mL 20%三氯乙酸停止反应，11 000×g离心3 min，倒掉上清液，用滤纸吸干外壁液滴，在通风厨中，加入4 mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V）振荡混匀，倒掉上清液，洗涤沉淀3次，将得到的沉淀自然风干，风干后加入3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液，在50 ℃条件下恒温水浴45 min使溶解沉淀，在370 nm波长处测定吸光度（A370nm）。对照组开始时只加入2 mL 2 mol/L盐酸，其余操作相同。使用分子吸光系数22 000 L/（mol·cm）计算羰基含量。在280 nm波长处测定吸光度，用牛血清白蛋白作为标准溶液绘制标准曲线，计算出蛋白含量。
式中：106为单位转换系数；ρ为用盐酸胍做空白在280 nm波长处测得的蛋白质量浓度/（mg/mL）。
1.3.7 蛋白总巯基含量的测定
蛋白质的总巯基含量的测定参考Ellman[10]的方法。吸取2 mg/mL的蛋白溶液0.5 mL置于10 mL的塑料离心管中，加入2.5 mL含8 mol/L 尿素的Tris-甘氨酸（10.4 g Tris，6.9 g甘氨酸，每升中加1.2 g EDTA，pH 8.0），每隔1.5 min加入20 μL DTNB（0.004 g DTNB用Tris-甘氨酸溶解定容到1 mL，避光），计时反应25 min后立即在412 nm波长处测吸光度（严格控制时间，反应时要避光），测得A412nm，对照组不加蛋白溶液，其他处理方法相同。总巯基含量计算使用摩尔消光系数13 600 L/（mol·cm），被溶解的蛋白含量使用考马斯亮蓝法测定，计算见公式（3）。
式中：106为单位转换系数；ρ为考马斯亮蓝法在595 nm波长处测得的蛋白质量浓度/（mg/mL）。
1.3.8 MP溶解性的测定
参照Benjakul等[11]的方法并略加修改。将提取的牛肉糜MP溶于pH 6.2的蛋白溶解液（0.6 mol/L NaCl、 2 mmol/L MgCl2、10 mmol/L焦磷酸钠、10 mmol/L PIPES）中，配成5 mg/mL的溶液，将配好的溶液在2 ℃条件下放置4 h（每隔10 min漩涡振荡一次），然后溶液在2 ℃、5 000×g离心15 min，用双缩脲法测定上清液中的蛋白含量。MP的溶解程度用溶解性（protein solubility，PS）来表示，计算见公式（4）。
1.3.9 SDS-PAGE分析
参照Laemmli[12]的方法并略作修改。2 mg/mL MP样品加入等量SDS-PAGE样品缓冲液成为1 mg/mL的样品，沸水浴加热3 min后置于冰中冷却，加入50 μL溴酚蓝，4 ℃、10 000×g离心3 min。吸取上清液20 μL进行点样，浓缩胶质量分数为4%，分离胶质量分数为12%。样品在浓缩胶中电流为20 mA，进入分离胶后电流改为40 mA。电泳结束后，染色液染色45 min，然后用脱色液脱至胶片透明，最后利用凝胶成像仪成像。SDS-PAGE标准分子质量蛋白由中国科学院上海生物化学研究所提供。
1.3.10 感官评定
将新鲜或充分解冻的牛肉饼置于电饼铛中烤制至中心温度达到75 ℃，立即请7 名专业人员组成的感官评定小组进行感官评分。评价标准包括牛肉饼的质构、多汁性、酸败味、整体接受性4 项，每项指标分值为1～10 分。对于质构，1～10 分为粗糙至光滑；对于多汁性，1～10 分为干燥至多汁；对于酸败，1～10 分为感觉不到至严重的刺激气味；对于整体接受性，1～10 分为低至高。
1.4 数据统计分析
实验均重复3次，结果用
±s表示。用Statistix 8.1软件进行数据显著性分析，采用Tukey HSD程序进行不同脂肪含量间或不同冻融周期的多重比较（P＜0.05），SPSS 17.0统计软件对实验数据进行相关性分析，采用Sigma Plot 10.0绘图软件作图。
2.1 不同脂肪含量的牛肉饼基本营养成分
表2 3 组牛肉饼的基本组成成分
Table 2 Basic components of beef patties with different fat contents %
注：同列肩标大写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由表2可知，由于牛背最长肌中含有一定量的脂肪，所以添加一定比例的脂肪后，3 组样品的实际脂肪含量分别为6.81%（F0）、15.62%（F10）和24.94%（F20），导致蛋白质、水分和灰分含量随着脂肪添加量的增加而降低（P＜0.05）。
2.2 冻融次数和脂肪含量对牛肉饼中MP氧化的影响
2.2.1 羰基含量的变化
图1 冻融次数和脂肪含量对牛肉饼中MP羰基含量的影响
Fig. 1 Effect of freeze-thaw cycles and fat content on carbonyl content of myofibrillar protein in beef patties
由图1可知，F0、F10和F203 组牛肉饼在未冷冻前其MP羰基含量为0.80～0.88 nmol/mg，差异并不显著（P＞0.05）。随着冻融次数的增加，羰基含量均显著增加（P＜0.05），在冻融5 次时，3 组牛肉饼（F0、F10和F20）羰基含量分别比新鲜状态时增加了2.75（F0）、4.05（F10）、4.76（F20） 倍，这可能是在反复冻融过程中，MP氨基酸侧链基团被氧自由基攻击发生了氧化或肽键发生了断裂，羰基化合物及其衍生物含量增加的缘故[13]。夏秀芳[14]、Reznick[15]等研究表明冻结-解冻循环过程中，细胞不断释放氧化酶和促氧化剂，蛋白质、脂肪的变性会促使氧化剂重新分布，加速了蛋白、脂肪的氧化，导致蛋白质羰基含量增加。从F0、F10和F203 组牛肉饼之间比较可知，脂肪添加比例越大，其羰基含量越高，说明脂肪的氧化促进了蛋白的氧化。Eymard等[16]研究表明蛋白氧化和脂肪氧化具有相同的催化剂，它们既可单独进行反应又可相互作用，脂肪氧化所生成的醛基可与蛋白氧化所生成的氨基进行反应形成席夫碱（Schiff base）而使羰基含量增加。Xiong Youling L.[17]也认为蛋白氧化与脂肪氧化具有类似的自由基链式反应，脂肪氧化产生的过氧化物能加速蛋白氧化。
2.2.2 总巯基含量的变化
图2 冻融次数和脂肪含量对牛肉饼中MP总巯基含量的影响
Fig. 2 Effect of freeze-thaw cycles and fat content on total sulfhydryl content of myofibrillar protein in beef patties
冻融次数和脂肪含量对牛肉饼中MP总巯基含量的变化如图2所示。3 组新鲜牛肉饼（冻融0 次）总巯基含量为123.79～127.43 nmol/mg，差异不显著（P＞0.05），随着冻融次数增加，所有样品中总巯基含量显著降低（P＜0.05）。冻融5 次后，F0、F10和F203 组牛肉饼中MP总巯基含量分别降低到49.59、37.71 nmol/mg和21.58 nmol/mg。巯基（—SH）是蛋白分子中非常重要的功能基团，总巯基含量的减少可能是由于巯基之间形成了二硫键或是巯基与低分子质量的水溶性蛋白分子片段发生了交联作用[18]。比较不同脂肪含量的样品（F0、F10和F20）可知，F20组总巯基含量下降速率大于其他两组，可能原因除了脂肪氧化促进二硫键的形成外，也可能同时促进了半胱氨酸的氧化[5]。半胱氨酸位于肌球蛋白头部的酶促反应中心，往往最易于遭受氧自由基的攻击而被氧化并最终导致巯基含量降低[19]。
2.2.3 溶解性的变化
冻融次数和脂肪含量对牛肉饼中MP溶解性的影响如图3所示。总体来看，冻融次数和脂肪含量对MP溶解性都有明显的影响，反复冻融是导致牛肉饼中MP溶解性下降的重要原因，冻融5 次后3 组牛肉饼的MP溶解性由0 次的69.27%～73.84%降至5 次的12.26%～29.42%。与此同时，脂肪含量也起着很重要的作用，脂肪含量越高，对MP溶解性的破坏性越大，特别是F20组，冻融5 次时MP溶解性降为12.26%，显著低于其他组（P＜0.05）。如前所述，冻融次数和脂肪含量的增加易使牛肉饼中MP发生氧化，MP发生聚集后改变了蛋白质的立体结构，起连接作用的氢键断裂，内侧的一些疏水基团暴露在外侧，相对减少了蛋白质表面的有效电荷，降低了蛋白质亲水性，从而导致MP溶解性明显下降[20]。
图3 冻融次数和脂肪含量对牛肉饼中MP溶解性的影响
Fig. 3 Effect of freeze-thaw cycles and fat content on solubility of myofibrillar protein in beef patties
从图1～3综合来看，牛肉饼中MP溶解性下降的趋势与羰基含量及总巯基含量的变化存在显著相关性，蛋白氧化使牛肉饼中MP羰基生成量增加，分子间二硫键交联加强，蛋白质表现出较低的溶解性。
2.2.4 冻融次数和脂肪含量对牛肉饼中MP聚合和分解程度的影响
SDS-PAGE图谱中高分子质量条带的扩展、模糊、弱化、消失及低分子质量条带的出现及浓度加强是蛋白质分子不断降解的外在表现。图4是牛肉饼中MP的SDS-PAGE降解模式，MP主要有6 条带，从上到下分别为：分子质量为220 kD的肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）、分子质量为100 kD的副肌球蛋白、分子质量为43 kD的肌动蛋白、分子质量为36 kD的原肌球蛋白、分子质量为35 kD的肌原蛋白的一个亚基（原肌球蛋白结合亚基）、分子质量为17～20 kD 的肌球蛋白轻链。贮藏初始阶段，MP各条带清晰可见。随着反复冻融次数的增加，副肌球蛋白及肌动蛋白条带变细，分子质量21～46 kD的条带弱化，表明大分子蛋白的降解和小分子蛋白的生成[21]；随着脂肪含量的增加，MHC条带加粗、加深，表明MP聚合的程度加剧。
图4 SDS-PAGE分析冻融次数和脂肪含量对牛肉饼中MP降解的影响
Fig. 4 Effect of freeze-thaw cycles and fat content on myofibrillar protein degradation evaluated by SDS-PAGE
2.3 冻融次数和脂肪含量对牛肉饼理化性质的影响
2.3.1 对牛肉饼TBARS值的影响
图5 冻融次数和脂肪含量对牛肉饼TBARS值的影响
Fig. 5 Effect of freeze-thaw cycles and fat content on TBARS value of beef patties
TBARS被广泛的用来评价肉类食品中脂质氧化的程度[22]，TBARS值越大，说明脂肪氧化的程度越高，产生的小分子物质如醛、酮、酸等越多，酸败越严重[23]。由图5可以得知，随着冻融次数的增加，3 组牛肉饼TBARS值均呈明显的上升趋势。新鲜状态下F0、F10和F20组TBARS值分别为0.02、0.04 mg MDA/kg和0.04 mg MDA/kg，反复冻融5 次后，TBARS值分别增加到0.22（F0）、0.27 mg MDA/kg（F10）和0.35 mg MDA/kg（F20）。这可能是各种氧化酶和促氧化剂在冻融过程中更容易从破裂的细胞器中释放出来并发挥作用的缘故[24]。脂肪含量越高，TBARS值增速越快，F20组在反复冻融4～5 次时TBARS值达到0.28～0.35 mg MDA/kg，显著高于其他两组（P＜0.05）。Utrear等[7]研究了不同脂肪含量的牛肉饼在冻藏过程中TBARS值的变化，也得出相同的结论。
2.3.2 对牛肉饼解冻损失率的影响
图6 冻融次数和脂肪含量对牛肉饼解冻损失率的影响
Fig. 6 Effect of freeze-thaw cycles and fat content on thawing loss of beef patties
解冻损失率是衡量肉的持水性的重要指标，解冻损失率越高，说明肉的持水性越低。从图6可以看出，牛肉饼的解冻损失率随着冻融次数增加均显著增加（P＜0.05），冻融1 次后3 组解冻损失率维持在8.12%～9.14%之间，冻融5 次后解冻损失率增加了1.46～1.95 倍。从脂肪含量对牛肉饼的解冻损失率影响可看出，当牛肉饼冻融5 次时，F0组解冻损失率为12.70%，而F10和F20组则分别达到15.06%和17.89%，3 组之间差异显著（P＜0.05）。持水力来源于蛋白-水之间的相互作用[25]，Lund等[26]认为蛋白氧化的发生减弱了这种相互作用，导致持水力降低。Estéves[27]认为蛋白氧化时羰基化过程改变了MP的电化学结构，蛋白极性基团和水分子之间连接弱化，水分自由度变大。Liu Zelong等[25]则认为蛋白氧化使蛋白分子的一些构象改变导致蛋白交联，蛋白-蛋白分子之间相互作用和蛋白-水之间的相互作用失衡，持水性受到影响。解冻损失的增加，不仅造成质量损失，还导致营养成分流失，同时影响肉品的色泽和感官品质。
2.3.3 对牛肉饼肉色的影响
由表3可以得知，反复冻融和脂肪含量的增加都导致牛肉饼的L*值和b*值显著增加（P＜0.05），而a*值显著降低（P＜0.05），牛肉饼的可接受程度逐渐降低。牛肉饼颜色变化的原因较为复杂，主要是由于肌红蛋白（myoglobin，Mb）或氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，MbO2）氧化造成了高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MMb）的积累。反复冻融过程中蛋白和脂肪的氧化产生大量的铁离子或羰基化合物[28]，这些物质作为Mb和MbO2氧化的促进剂可生成MMb。Mariana等[29]研究证实脂肪氧化产生的自由基和蛋白质氧化产生的羰基可以与肌肉蛋白质褐色素中的自由氨基反应，加速褐色素物质的生成，导致肌肉的a*值下降。Thanonkaew等[30]研究了反复冻融对乌贼鱼色泽的影响，发现脂肪氧化会使L*值增加并导致黄色素大量生成。夏秀芳等[14]证实脂肪氧化是冻融过程中导致猪肉颜色变化的主要因素。本实验中，添加了牛背部脂肪的F10和F20样品色泽值与F0样品色泽值差异显著（P＜0.05）。
表3 冻融次数和脂肪含量对牛肉饼肉色的影响（n=54）
Table 3 Effect of freeze-thaw cycles and fat content on color parameters of beef patties (n= 54)
注：肩标大写字母不同表示相同冻融次数不同脂肪含量样品差异显著（P＜0.05）；肩标小写字母不同表示相同脂肪含量不同冻融次数的样品差异显著（P＜0.05）。下同。
2.4 冻融次数和脂肪含量对牛肉饼感官品质的影响
由表4可知，冻融次数显著地影响牛肉饼的感官品质。随着冻融次数增加，尤其是在反复冻融3 次以后，牛肉饼的质地变得粗糙（P＜0.05），多汁性显著降低（P＜0.05），酸败味显著增加（P＜0.05），整体可接受性显著变差（P＜0.05）。这是因为随着反复冻融的进行，MP的凝胶性变差，导致牛肉饼的质地粗糙；同时反复冻融过程中由于汁液流失使肉饼的多汁性降低；反复冻融容易使蛋白发生氧化变性，蛋白和醛类相互作用发生聚集，使牛肉饼质地变得坚硬。
此外，随着脂肪添加量的增加，牛肉饼的质地、光滑性和多汁性显著增加（P＜0.05），在脂肪添加量达到20%时质构和多汁性得分最高。但是脂肪氧化的终产物（醛、酮类）会产生酸败味，较高的脂肪添加量产生较多的醛和酮类物质，所以酸败味也随着脂肪添加量的增加而增加。
表4 牛肉饼感官评价结果
Table 4 Sensory evaluation of beef patties
2.5 指标的相关性分析
表5 指标相关性分析
Table 5 Correlation analysis
注：n=54；**.在α=0.01水平（双侧）上极显著相关；*.在α=0.05水平（双侧）上显著相关。
牛肉饼各指标之间的相关性如表5所示，冻融次数和脂肪含量两个指标均与TBARS值、L*、b*、羰基含量及解冻损失率均呈极显著正相关（P＜0.01），而与a*、总巯基含量、蛋白溶解性呈显著或极显著负相关（P＜0.05或P＜0.01），表明随着冻融次数和脂肪含量的增加，蛋白氧化程度加剧，保水力变差，色泽变暗，这会降低牛肉饼的品质。
反复冻融引起了牛肉饼脂肪氧化加剧、持水性降低、色泽发生变化和感官品质劣变，其原因是反复冻融导致牛肉MP发生氧化损伤，使羰基含量显著增加，总巯基含量和蛋白溶解性显著下降，SDS-PAGE图谱也显示冻融使蛋白发生小片化和聚合的程度加剧。因此牛肉饼在贮藏过程中应尽可能避免温度波动导致的反复冻融，以免因MP氧化变性而引起食用品质的下降。添加10%～20%的脂肪会提高牛肉饼的感官品质，但同时加速了蛋白氧化的发生，导致牛肉饼理化性质发生变化。建议在实际生产中牛背部脂肪添加要控制在适当的范围之内，以保持牛肉饼鲜嫩多汁的口感。
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Quality Changes of Beef Patties with Different Fat Contents during Multiple Freeze-Thaw Cycles
ZHU Yingchun1, WANG Shuijing2, MA Lizhen3,*, DANG Xiaoyan1, WANG Yang4
(1. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2. Shaanxi Biohong Biological Technology Co. Ltd., Xi’an 710000, China; 3. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, Department of Food Science and Biological Engineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 4. Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, Department of Aquacultural Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)
Abstract：The present study aimed to investigate the effect of fat contents on myofibrillar protein (MP) oxidation, physicochemical characteristics and sensory properties of beef patties during repeated freeze-thaw cycles, and to elucidate the correlation of freeze-thaw treatment and lipid content with protein oxidation. Round beef patties ((100 ± 2) g per piece) with different fat contents were manufactured by adding 0% (F0), 10% (F10), and 20% (F20) beef tallow and the same proportions of salt and other accessory materials to ground beef loin and then stored at -18 ℃ and one-week frozen storage followed by thawing under running water to a core temperature of 0–2 ℃ were carried out five times during the process. The color parameters (a*, b* and L*) and thawing loss rate were determined and MP was extracted from the patties forthe measurement of carbonyl content, total sulfhydryl content and protein solubility after each freeze-thaw cycle. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was used to evaluate MP aggregation and degradation. The results indicated that a* value, total sulfhydryl content and protein solubility decreased significantly, while b* and L* values, thawing loss and carbonyl content increased with increasing number of freeze-thaw cycles and increasing fat addition. SDS-PAGE analysis showed that myosin heavy chains (MHC) were aggregated and paramyosin and actin were degraded with increasing number of freeze-thaw cycles and increasing fat addition. The sensory quality of beef patties increased with the increase in fat content, but decreased with increasing number of freeze-thaw cycles, especially after three freeze-thawing cycles. In addition, harder texture and increased juice loss were observed. Correlation analysis showed that color parameters (L*, a* and b*), thawing loss and protein oxidation indexes (carbonyl content, total sulfhydryl content, protein solubility) were significantly correlated with freeze-thaw cycles and fat content (P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01). The results proved that freeze-thaw cycles could induce protein oxidation in beef patties and quality deterioration. Increased fat content enhanced sensory scores, but accelerated protein oxidation and affected physicochemical properties of beef patties. In practice, proper fat content and constant low temperature are necessary for better quality of beef products.
Key words：beef patty; freeze-thaw cycle; fat content; myofibrillar protein; oxidation; quality
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201711028
中图分类号：TS254.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）11-0174-08引文格式：
收稿日期：2016-12-28
基金项目：天津市水产产业技术体系创新团队项目（ITTFRS2017020）；山西农业大学博士科研启动基金项目（2015ZZ06）
作者简介：朱迎春（1970—），女，副教授，博士，研究方向为肉制品品质与安全。E-mail：yingchun0417@163.com
*通信作者：马俪珍（1963—），女，教授，博士，研究方向为肉制品品质与安全。E-mail：Malizhen-6329@163.com