发酵肉制品中高抗氧化肉品发酵剂的筛选鉴定

李 默1,2,朱 畅3,赵冬兵1,王利媛1,苟梦星1,刘学军1,*

(1.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林 长春 130118;2.通化师范学院制药与食品科学学院,吉林 通化 134002;3.吉林工程职业学院食品工程分院,吉林 四平 136000)

摘 要:为获得高抗氧化活性的天然肉品发酵剂,通过清除自由基、还原能力和抗脂质过氧化实验对来源于5 种发酵肉制品中30 株乳酸菌的发酵上清液、菌体细胞和胞内提取物的抗氧化活性进行研究,并按照肉品发酵剂的筛选标准对高抗氧化性的菌株进行筛选,鉴定出符合要求的菌株。结果表明:这30 株乳酸菌具有不同的抗氧化能力且不同组分的抗氧化活性之间存在很大差异,发现菌株L23、L26和L28具有较高的抗氧化活性,其中L23符合肉品发酵剂的筛选标准,可作为天然高抗氧化性肉品发酵剂用于生产。经鉴定L23为希腊魏斯氏菌。

关键词:发酵肉制品;乳酸菌;抗氧化活性;鉴定;希腊魏斯氏菌

肉及肉制品由于自身脂肪和蛋白质含量丰富,且水分活度高,在加工和贮运过程中极易发生氧化变质,从而影响其感官品质和营养价值[1-2],所以在肉制品中添加一些抗氧化剂对减缓甚至防止肉制品的氧化腐败非常重要[3]。工业上常使用一些产量大、价格低、抗氧化性强的合成抗氧化剂(如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、丁基羟基茴香醚和叔丁基对苯二酚等)[4-5],但有研究显示合成抗氧化剂具有一定的毒性和致癌作用,存在许多安全性问题[6-8]。因此,开发新型、天然、安全的抗氧化剂成为当今社会研究的热点[9-11]。目前许多研究证实一些乳酸菌具有抗氧化活性[12-14],能够抗癌、降低胆固醇、增强机体免疫力、延缓衰老等[15-16],是一种常见的天然抗氧化剂。

我国传统发酵肉制品主要依赖环境中的微生物自然生长进行发酵,产品中富集了大量生长特性良好的乳酸菌[17-19]。近年来有许多关于发酵肉制品中优良菌株筛选方面的报道,周超[20]从4 种不同的酸肉中筛选出2 株能产NO,具有KatA基因的希腊魏斯氏菌。吕彩霞[21]从传统牛干巴中得到具有肉品发酵剂的德式乳杆菌和干酪乳杆菌。Pringsulaka等[22]从泰国发酵鱼肉制品中分离出能够产生细菌素的魏斯氏菌。但对发酵肉制品中抗氧化乳酸菌的研究的报道很少,本研究从金华火腿、四川腊肉、宣威火腿、云南牛干巴和建昌板鸭5 种发酵肉制品中筛选出高抗氧化活性的乳酸菌菌株作为肉品发酵剂,在保持肉制品良好品质的同时延缓肉制品在加工贮藏过程中的脂肪氧化,并为天然抗氧化剂的开发和功能性食品的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、试剂及培养基

实验所用乳酸菌菌株均为5 种发酵肉制品中分离得到。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美国Sigma公司;吐温20、亚油酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、邻罗菲琳、铁氰化钾、乙二胺四乙酸、邻苯三酚等均为国产分析纯。

MRS液体/固体培养基[20]、系列筛选培养基[20]均为实验室配制。

1.2 仪器与设备

SPX生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;THZ-300恒温培养摇床 上海一恒科学仪器有限公司;MCV-131BNF(T)无菌操作台 日本Sanyo公司;JY99-IIDN超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;TU-1901双光束紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司;LPZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分离

取25 g样品加入225 g无菌生理盐水置于均质拍打机中拍打5 min,取梯度稀释后的样品涂布于含有3% CaCO3的MRS固体培养基平板上,37 ℃培养24 h。挑取产生透明溶钙圈的菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验,分离纯化革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株。用50%甘油在-20 ℃条件下保藏菌种。

1.3.2 乳酸菌的活化与培养

将保存的菌种接种于灭菌的MRS液体培养基中,置于37 ℃摇床培养16 h,传代3 次。将活化好的菌种以1%的接种量接入MRS液体培养基中,置于37 ℃摇床培养24 h。

1.3.3 乳酸菌各组分的制备

培养好的菌液5 000 r/min离心20 min,收集发酵上清液备用。菌体细胞用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)漂洗3 次,再将菌体重悬于PBS中,溶液分为2 组,一组收集备用,另一组菌液置于冰浴中超声破碎30 min,10 000 r/min冷冻离心20 min,收集上层清液备用即无细胞提取物。

1.3.4 乳酸菌抗氧化活性的检测

清除羟自由基(·OH)能力的测定参照文献[23];清除超氧阴离子自由基(O2·)能力的测定采用邻苯三酚自氧化法,具体方法参照文献[24];清除DPPH自由基能力的测定参照文献[25];抗脂质过氧化能力的测定参考文献[26];还原能力的测定参照文献[27]。

1.3.5 肉品发酵剂的筛选

将具有高抗氧化性的菌株进行耐盐、耐亚硝酸盐、产氨、产H2S、产黏、氨基酸脱羧酶等肉品发酵剂筛选实验,具体实验方法参照文献[28]。

1.3.6 乳酸菌的鉴定

1.3.6.1 乳酸菌形态学鉴定及生理生化鉴定

挑取菌株单菌落进行革兰氏染色和形态学检测,以及触酶实验、硝酸盐还原实验、产硫化氢实验及碳水化合物发酵产酸实验等生理生化实验。生理生化特征分析参照文献[28-30]。

1.3.6.2 乳酸菌的16S rDNA鉴定和进化分析

将保存的目标菌株活化3 代后,在MRS固体平板上划线。在37 ℃培养24 h,挑取乳酸菌单菌落,观察菌落形态和显微镜下细胞形态,送生工生物工程(上海)股份有限公司完成16S rDNA测序和测序结果比对工作。

1.4 数据处理

实验数据均为平行测3 次的值,用±s表示,采用SPSS 17.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离

从发酵肉制品中分离出127 株菌株,进一步筛选出能够产生明显透明钙圈、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的30 株菌株,初步定为乳酸菌,并编号为L1~L30。

2.2 乳酸菌抗氧化活性比较结果

2.2.1 清除•OH实验结果

通过对30 株乳酸菌的•OH清除能力的研究,结果显示,各组分呈现出不同的清除效果。其中胞内提取物表现出相对较弱的清除效果,清除率为0%~29.30%,而发酵上清液和菌体细胞都表现出相对较强的清除活性。如表1所示,除L19、L20、L21、L28和L30的菌体细胞对•OH的清除率高于发酵上清液外,其他25 株乳酸菌的发酵上清液对•OH的清除率均高于菌体细胞。此外,不同乳酸菌也表现出不同的清除效果。其中,L23的发酵上清液和L28的菌体细胞表现出相对较强的清除能力,清除率分别为64.28%和64.43%。结果表明,不同乳酸菌对•OH的清除效果不同,且清除•OH的活性物质主要存在于发酵上清液和菌体细胞表面。

表1 乳酸菌OH的清除率
Table1 Hydroxyl radical scavenging-activity of lactic acid bacteria %

2.2.2 清除·实验结果

表2 乳酸菌·清除率
Table2 Superoxide anion radical scavenging activity of lactic acid bacteria %

由表2可知,30 株乳酸菌的菌体细胞和胞内提取物表现出极其微弱的清除效果,清除率范围为0%~15.43%,而各菌株的发酵上清液均表现出相对较强的O2·清除活性。L15和L23的发酵上清液表现出较强的清除效果,清除率分别为30.96%和46.94%。这一实验结果表明,不同乳酸菌对O2·的清除效果不同,且乳酸菌清除O2·的活性物质主要存在于发酵上清液中。

2.2.3 清除DPPH自由基实验结果由表3可知,30 株菌株的菌体细胞和胞内提取物表现出相对较弱的清除能力,清除率范围为0%~34.76%。而发酵上清液的清除率范围为47.26%~91.24%,L26和L23的发酵上清液表现出相对较强的清除活性,清除率分别为

表3 乳酸菌对DPPH自由基的清除率
Table3 DPPH free radical scavenging activity of lactic acid bacteria %

91.24 %和89.32%。实验结果表明,清除DPPH自由基的活性物质主要存在于发酵上清液中。

2.2.4 还原能力测定结果

表4 乳酸菌还原能力
Table4 Reducing powder of lactic acid bacteria

由表4可知,乳酸菌的菌体细胞和胞内提取物表现出极其微弱的还原活性,OD700nm为0~0.080,而发酵上清液表现出相对较强的还原活性,OD700nm为0.179~2.639。L23的发酵上清液表现出最强的还原活性,OD700nm为2.639。这一实验结果表明不同乳酸菌具有还原能力的活性物质含量不同,且活性物质主要存在于发酵上清液中。

2.2.5 抗脂质过氧化能力测定结果

表5 乳酸菌对脂质过氧化的抑制率
Table5 Inhibitory percentages of lactic acid bacteria on lipoperoxidation %

通过测定30 株乳酸菌各组分在亚油酸氧化体系中抑制脂质过氧化的能力,结果显示,乳酸菌菌体细胞的抑制活性为0%~28.57%,均低于相应菌株的胞内提取物。如表5所示,除L11、L12、L14、L21、L23和L27外,其他24 株乳酸菌胞内提取物的抑制活性均高于发酵上清液的抑制活性,然而L23的发酵上清液表现出最强的抗脂质过氧化能力,抑制率为62.01%。结果表明不同乳酸菌的抗脂质过氧化能力不同且抗脂质过氧化的活性物质存在部位不同或活性物质在不同部位的含量不同。

经过上述5 种体外抗氧化的筛选实验可知,L28的菌体细胞具有最强的清除•OH能力(清除率为64.43%);L26的发酵上清液具有最强的DPPH自由基清除能力(清除率为91.24%);L23的发酵上清液具有最强的还原能力(OD700nm为2.639),并具有最强的抗脂质过氧化能力(抑制率为62.01%)和最强的清除O2·能力(清除率为46.94%)。由此,筛选得到L23、L26和L28三株抗氧化能力较强的乳酸菌进行下一步研究。

2.3 抗氧化肉品发酵剂的筛选结果

将筛选得到的L23、L26和L28三株抗氧化能力较强的乳酸菌进行肉品发酵剂的复筛实验,实验结果如表6所示,其中L26和L28都表现出氨基酸脱羧酶阳性、产氨阳性,且L26还表现出产H2S阳性,这些指标都不符合肉品发酵剂的筛选标准。然而,L23符合肉品发酵剂筛选标准,可以作为肉品发酵剂进行进一步的研究。

表6 菌株主要发酵特性
Table6 Fermentation characteristics of the selected strains

注:+.表示阳性;-.表示阴性。表8、9同。

2.4 乳酸菌L23的鉴定

2.4.1 乳酸菌L23的形态学鉴定及生理生化鉴定结果

表7 乳酸菌L23的菌落特征
Table7 Colony characteristics of strain L23

表8 乳酸菌L23的生理生化鉴定结果
Table8 Physiological and biochemical identification of L23

表9 乳酸菌L23的糖发酵实验结果
Table9 Carbohydrate fermentation characteristics of L23

将菌株L23在MRS固体平板培养基上划线分离,37 ℃条件下培养24 h后,观察单菌落的形态特征(表7)。经显微镜观察菌株L23细胞为短杆,成短链状,革兰氏阳性,再结合生理生化特征(表8)和碳水化合物发酵实验结果(表9),根据文献[28-30],可初步鉴定菌株L23为希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)。

2.4.2 乳酸菌L23 16S rDNA序列测定及系统进化树的构建

对菌株L23的16S rDNA序列进行PCR扩增并进行电泳检测。结果如图1所示,发现该菌株的序列在1 000~2 000 bp之间,进一步测序后,得到菌株L23的16S rDNA序列为1 494 bp。将所测得的菌株序列用BLAST软件在GenBank中进行相似性比对,结果发现菌株L23与希腊魏斯氏菌的相似度达99%。将GenBank中与菌株L23序列同源性高于98%的几株菌株进行BLAST分析,构建系统发育树。结果如图2所示,菌株L23与Weissella hellenica FJ654466亲缘关系最近,由此确定L23为希腊魏斯氏菌。

图1 菌株L23 16S rDNA PCR产物扩增图
Fig.1 Electrophorogram of PCR-amplified 16S rDNA products from strain L23

图2 菌株L23 16S rDNA序列系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain L23

3 结论与讨论

本研究从发酵肉制品中分离出127 株菌株,进一步筛选出能够产生明显透明钙圈、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的30 株菌株乳酸菌。这30 株乳酸菌不同组分的抗氧化活性进行了研究,结果表明这30 种乳酸菌具有不同的抗氧化能力且不同组分的抗氧化能力之间存在很大差异,其中菌株L23、L26和L28具有较高的抗氧化活性。本研究还通过肉品发酵剂的筛选实验,确定菌株L23满足肉品发酵剂的筛选标准。并结合菌株L23的形态学特征、生理生化特征和16S rDNA的分析鉴定,L23为希腊魏斯氏菌。

乳酸菌在自然界中广泛存在,而来源于肉制品的乳酸菌更有利于应用到肉制品中。抗氧化乳酸菌对延缓肉制品的脂肪氧化发挥重要作用。这一研究结果将为天然抗氧化剂的开发、抗氧化成分的提取以及功能性食品的研制等方面提供参考。

本研究从5 种发酵肉制品中筛选出一株具有较高抗氧化活性的肉品发酵剂希腊魏斯氏菌,该菌在肉品发酵剂方面的研究较罕见,由于时间关系并未对该菌的安全性方面进行评估,在以后的研究中还需进一步检测该菌的安全性问题;同时本研究只从5 种发酵肉制品中筛选出一株较高抗氧化活性的乳酸菌,并未进一步探讨该菌的具体抗氧化成分,在以后的研究中可以对该菌的抗氧化成分进行分析,并可以对其抗氧化成分进行分离提取,为天然抗氧化剂的开发提供理论支持。

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Screening and Identification of Meat Starters with High Antioxidant Activity from Fermented Meat Products

LI Mo1,2, ZHU Chang3, ZHAO Dongbing1, WANG Liyuan1, GOU Mengxing1, LIU Xuejun1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;2. College of Pharmaceutics and Food Science, Tonghua Normal University, Tonghua 134002, China; 3. College of Food Engineering, Jilin Engineering Vocational College, Siping 136000, China)

Abstract:This study aimed to obtain lactic acid bacteria (LAB) with high antioxidant activity for meat fermentation. Intact cells, cell-free extracts and fermentation supernatant of 30 LAB isolated from5 kinds of fermented meat products were evaluated for antioxidant activity by free radical scavenging assays, reducing power assay and linoleic acid peroxidation inhibition assay. According to the meat starters screening standard, eligible strains were identified. The results showed that the 30 strains of LAB had different antioxidant capacities and there were big differences between the antioxidant activities of their intact cells, cell-free extracts and fermentation supernatant. Strains L23, L26 and L28 were screened for excellent antioxidant activity, and L23, reaching the requirement of the meat starters screening standard, could be used as a natural meat starter for the production of fermented meat products. Strain L23 was identified as Weissella hellenica.

Key words:fermented meat products; lactic acid bacteria; antioxidant activity; identification; Weissella hellenica

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201712013

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)12-0083-06

引文格式:李默, 朱畅, 赵冬兵, 等. 发酵肉制品中高抗氧化肉品发酵剂的筛选鉴定[J]. 食品科学, 2017, 38(12): 83-88.

DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201712013. http://www.spkx.net.cn

LI Mo, ZHU Chang, ZHAO Dongbing, et al. Screening and identification of meat starters with high antioxidant activity from fermented meat products[J]. Food Science, 2017, 38(12): 83-88. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201712013. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-09-24

基金项目:吉林省重点科技攻关项目(20140204010NY)

作者简介:李默(1989—),女,助教,硕士研究生,研究方向为动物食品科学。E-mail:lm6739099@163.com

*通信作者:刘学军(1963—),男,教授,博士,研究方向为畜产品加工。E-mail:liuxuejun63@163.com