大豆发芽富集γ-氨基丁酸的培养液组分优化及盐胁迫下的富集机理

曾 晴1,谢 菲1,尹京苑2,高海燕1,*

(1.上海大学生命科学学院,上海市能源作物育种及应用重点实验室,上海 200444;2.上海大学计算机工程与科学学院,上海 200444)

摘 要:以东北大豆为原料,研究培养液组分对大豆发芽富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的影响,利用响应面法优化了大豆发芽富集GABA的培养液组分,在此基础上对低盐胁迫下大豆发芽富集GABA的机理进行研究。结果表明:优化后有效的培养液组分为谷氨酸钠1.0 mg/mL、磷酸吡哆醛2.0 mmol/L、CaCl22.0 mmol/L、NaCl 100 mmol/L,在此条件下,富集得到的发芽大豆中GABA含量较高,为(269.93±4.73)mg/100 g,比大豆发芽前提高了约10 倍;盐胁迫下,发芽大豆谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)活性和GABA含量随NaCl浓度加大和胁迫时间延长而提高,同时大豆发芽期间GABA含量与其他指标之间相关性分析表明,盐胁迫下发芽大豆GABA含量与芽长、GAD活性、游离氨基酸和可溶性蛋白含量之间呈显著正相关,在低盐胁迫下,大豆发芽受到抑制,但促进了GAD活性的升高,游离氨基酸和可溶性蛋白质含量增加,富集产生了较多的GABA。

关键词:γ-氨基丁酸;响应面优化;盐胁迫;富集工艺

大豆营养丰富,除了富含优质蛋白外,还含有人体必需的多种维生素和矿物质以及不饱和脂肪酸、大豆异黄酮、大豆多肽、大豆卵磷脂、大豆低聚糖等功能性成分[1-3]。众多研究表明,种子萌发过程中生理代谢旺盛[4-6],此时种子中的酶不断形成或被活化,细胞生理活动加强,一些大分子物质如淀粉和蛋白质被分解。种子发芽后,可降低或消除豆类中有毒、有害或抗营养物质含量,并且提高营养成分和蛋白质的消化率以及某些限制性氨基酸和维生素等物质含量[7-9],尤其可富集对人体有生理调节功能的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)等物质[10-11]

GABA是一种四碳非蛋白质氨基酸,具有降血压、改善脑功能、抗癫痫和抗衰老等多种功效[12]。然而欲利用动植物中的GABA加工为功能产品,则需要对生物体中的GABA含量富集提高。植物正常生长条件下体内GABA产量很低,通常在0.3~32.5 μmol/g之间[13],但受到盐胁迫[14-16]、热激[17]、机械损伤[18]、低氧[19-20]等逆境胁迫或植物激素作用时会提高数倍甚至数十倍。

大豆发芽时GABA的富集量除受发芽条件影响外,还受培养液组分的影响。培养液组分中,L-谷氨酸是谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)的唯一底物,可以促进GAD的活性,从而富集GABA[21]。由于谷氨酸钠(monosodium glutamate,MSG)价格比较便宜,大豆发芽培养时一般都采用MSG;磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate,PLP)是GAD的辅酶,有促进GAD活性的作用;植物来源的GAD是一种钙调素(CaM)结合蛋白,其活性受Ca2+/CaM控制,研究表明[22-24],CaM与GAD结合可以调节GAD的活性,从而控制谷氨酸和GABA的代谢,这是植物的正常生长需要;有报道表明,NaCl的影响与抗逆机制有关,植物在盐逆境下会促进GABA的产生[25]

毛健[7]、郭元新[22]等研究了发芽条件对大豆发芽富集GABA的影响,但培养液组分对大豆发芽富集GABA效果的影响目前鲜有报道。本研究以东北大豆为原料,以MSG、Ca2+、PLP和NaCl添加量为考察对象,在单因素试验基础上,采用响应面法对其进行优化。在此条件下,对低盐胁迫下大豆发芽富集GABA的机理进行了初步研究,以期为开发富含GABA的芽类食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆(云鹤YH-NJ,产自中国东北吉林省) 沃尔玛超市;GABA标准品、甲醇(均为色谱纯)、邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)(生化试剂) 美国Sigma公司;其他化学试剂均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;DHG-970电热恒温鼓风干燥箱 上海浦东荣丰科学仪器有限公司;1100 Series高效液相色谱仪 美国安捷伦公司;MDFU32v超低温冰箱 松下电器公司。

1.3 方法

1.3.1 浸泡工艺

用自来水冲洗大豆,除去杂质和悬浮的瘪粒,用体积分数1%的次氯酸钠浸泡消毒5 min,再用去离子水清洗大豆3 遍。称取200 g大豆移入大烧杯,添加3 倍体积的培养液,25 ℃水浴12 h。

1.3.2 发芽工艺

将浸泡后的大豆取出,沥干种子表面水分,分装平铺于垫有两层滤纸的培养皿上,转入30 ℃恒温培养箱发芽51 h,大豆发芽期间,用去离子水喷洒,保持湿润。

1.3.3 培养液组分对大豆发芽GABA富集的影响

1.3.3.1 单因素试验

不同培养液配制如下:MSG质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL,PLP浓度为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L,CaCl2浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L,NaCl浓度为5、50、100、150、200、250 mmol/L。所有溶液都是由磷酸缓冲液配制而成,调节pH 5.5,每个处理按1.3.1节工艺浸泡、1.3.2节工艺发芽,取样用液氮速冻处理后,贮藏在-40 ℃冰箱中,备用测定GABA含量,每个处理重复3 次。

1.3.3.2 Box-Behnken试验设计

在单因素试验的基础上,采用软件JMP,选择Box-Behnken设计评价各因素之间的交互作用对大豆发芽富集GABA含量的影响,因素与水平设计见表1。

表1 Box-Behnken设计因素与水平
Table1 Actual and coded values for variables used in Box-Behnken design

1.3.4 盐胁迫下大豆发芽富集GABA机理

将用最优组分培养液浸泡后的大豆进行下列处理:1)用浓度分别为100 mmol/L的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、FeCl3、AlCl3溶液在30 ℃恒温培养箱中培养大豆48 h,测定GABA含量,以去离子水培养的发芽大豆作对照;2)用0、50、100、150、200 mmol/L NaCl溶液在30 ℃恒温培养箱中培养大豆48 h,研究不同NaCl浓度胁迫对GABA含量的影响;3)用100 mmol/L NaCl在30 ℃恒温培养箱中培养大豆60 h,每隔12 h取样一次,研究盐胁迫下大豆富集GABA含量的变化、生长情况、GAD活性,以去离子水培养的发芽大豆作对照。所有处理的样品取出后,鲜样用于直接测定芽长,对于游离氨基酸、可溶性蛋白、GAD及GABA含量等指标的测定,样品用去离子水清洗,吸水纸吸干表面水分后,迅速用液氮速冻,然后贮藏于-40 ℃冰箱中备用待测,每个处理重复3 次。

1.3.5 GABA含量测定

1.3.5.1 样品处理

将样品用中药粉碎机粉碎后过60 目筛,准确称取3 g,置入100 mL容量瓶中,加适量60%乙醇溶液,55 ℃恒温水浴中提取6 h,其间每隔30 min摇匀样品30 s。冷却至室温后定容至100 mL,取20 mL提取液置入50 mL离心管中,10 000 r/min离心10 min,取上清液经0.45 μm滤膜过滤,备用。

1.3.5.2 标准溶液配制

准确称取适量GABA标准品,用超纯水稀释配成0.1 mg/mL标准储备液待用。

1.3.5.3 衍生化处理

称取0.5 g OPA,加10 mL甲醇溶解后,加入1 mL 0.4 mol/L的硼酸盐缓冲液(pH 9.6)和400 μL 2-巯基乙醇,此衍生剂溶液可保持2 d。取样品或标准溶液100 μL,加入上述溶液100 μL,混匀进样。

1.3.5.4 色谱条件[27]

Waters色谱柱C18反相柱(3.9 mm×150 mm,4 μm);流动相A:醋酸钠20 mmol/L,pH 5.86;流动相B:甲醇100%;A-B体积比72∶28;流速1.0 mL/min;进样量20 μL。检测波长338 nm;柱温40 ℃。

1.3.6 芽长的测定

随机选取20 粒大豆,将大豆置于平面,用游标卡尺测量芽长,计算平均值。

1.3.7 游离氨基酸含量的测定

采用水合茚三酮显色法[28]

1.3.8 可溶性蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝G-250染色法[29]

1.3.9 GAD活性测定

将处理完成的大豆置于滤纸上吸干水分,用镊子剥去种皮,用研钵研磨后分别称两份,每份1 g,一份加入10 mL磷酸缓冲液(内含l%谷氨酸,pH 5.5),另一份加入10 mL磷酸缓冲液(pH 5.5)做空白,两份样品在40 ℃水浴振荡2 h后,迅速放入沸水浴中煮沸5 min灭酶活,离心取上清液,再加入8%三氯乙酸溶液10 000 r/min离心10 min,取上清液按照1.3.5节方法测定GABA含量。以每克GAD每30 min生成1 μmol的GABA作为一个酶活力单位(U/g)。

1.4 数据处理

所有实验数据重复测定3次,结果以±s表示。方差分析和相关性分析应用SPSS(Version 16.0)软件,P<0.05表示显著,P<0.01表示极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 MSG质量浓度对大豆发芽富集GABA含量的影响

图1 MSG质量浓度对GABA含量的影响
Fig.1 Effect of MSG concentration on the GABA content

从图1可以看出,MSG质量浓度在0.5~3.0 mg/mL范围内,大豆发芽GABA富集量随MSG质量浓度的变化呈先升后降的趋势。达到1.0 mg/mL时,GABA含量达到最大值,之后开始下降,可能是此时底物与酶达到一个最适比例。这表明大豆发芽富集GABA时,MSG的最佳质量浓度为1.0 mg/mL。

2.1.2 PLP浓度对大豆发芽富集GABA含量的影响

图2 PLP浓度对GABA含量的影响
Fig.2 Effect of PLP concentration on the GABA content

从图2可以看出,PLP浓度在0.5~3.0 mmol/L范围内,大豆发芽GABA富集量随PLP浓度的升高呈先升后降的趋势,可能是由于PLP显著促进了GAD活性,提高了大豆中GABA的含量。这表明大豆发芽富集GABA时,PLP的最佳浓度为2.00 mmol/L。

2.1.3 CaCl2浓度对大豆发芽富集GABA含量的影响

从图3可以看出,CaCl2浓度在0.5~3.0 mmol/L范围内,大豆发芽GABA富集量随CaCl2浓度的升高呈先升后降的趋势。CaCl2浓度为2.0 mmol/L时大豆中GABA富集量最高。这表明大豆发芽富集GABA时,CaCl2的最佳浓度为2.0 mmol/L,这与文献报道的结果一致[30]

图3 CaC12浓度对GABA含量的影响
Fig.3 Effect of CaCl2concentration on the GABA content

2.1.4 NaCl浓度对大豆发芽富集GABA含量的影响

图4 NaCl浓度对GABA含量的影响
Fig.4 Effect of NaCl concentration on the GABA content

从图4可以看出,NaCl浓度在5~250 mmol/L范围内,大豆发芽GABA富集量呈先升后降的趋势。可能是NaCl在一定浓度范围内造成植物处于盐胁迫逆境,而植物在逆境情况下会促进GABA的生成。NaCl添加量100 mmol/L,GABA富集量达到最大。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 Box-Behnken试验设计与结果

使用JMP软件进行Box-Behnken设计,试验设计与结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table2 Box-Behnken design with experimental and predicted GABA contents

续表2

2.2.2 方差分析

利用JMP软件对试验结果进行多元回归统计分析,回归系数及其显著性检验见表3。

表3 回归系数及其显著性检验Table3 Significance test of each of the regression coefficient for the quadratic
Table3 Significance test of ea model odel

从表3可以看出,X2、X4、X1X2、X2X3、X2X4、X3X4、X12、X22、X32、X42对GABA富集量都有显著影响(P<0.05),四因素对GABA含量影响大小顺序为X4>X2>X1>X3,即NaCl浓度>CaCl2浓度>MSG质量浓度>PLP浓度。根据试验分析结果得到各因素效应系数,建立GABA含量与3 个变量之间关系的多元二次方程:

Y=271.88-8.07X1+9.044 650X2+4.887 871 6X3-10.438 27X4+19.870 014X1X2+11.152 951X1X3+ 36.355 053X1X4-5.914 092X2X3+14.562 692X2X4-15.299 17X3X4-73.217 66X12-38.350 91X22-45.371 81X3

2-76.176 76X42该回归方程的相关系数R2为96%,说明该模型方程能够较好地用于大豆发芽富集GABA培养条件的预测。从表4回归方差分析可以看出,模型的回归效果显著,说明该模型能够较好地模拟试验数据。

表4 回归方程的方差分析
Table4 Analysis of variance for the quadratic model

2.2.3 响应面分析

图5 不同培养液组分对GABA含量影响的响应面及等高线图
Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of various medium components on the GABA content

图5是根据多元回归方程绘制出的响应面及其等高线图,可以看出当4 个变量中的两个因素水平固定的条件下,其他两个因素共同作用对GABA含量影响呈曲面效应,变化趋势都是先增大后减小,且响应面均存在一个极大值点。等高线呈圆形说明两因素之间交互作用不显著,呈椭圆形则表明作用显著。从图5a、d、e、f可以看出,等高线呈椭圆形,表明图中的两因素交互作用显著。从图5b、图5c等高线图可以看出,等高线较圆,表明图中两因素交互作用不显著,即MSG质量浓度和PLP浓度、MSG质量浓度和NaCl浓度的交互作用对GABA含量影响不显著,与显著性分析结论一致。

2.2.4 最优条件验证

得到优化的培养条件为MSG质量浓度0.98 mg/mL、PLP浓度2.08 mmol/L、CaCl2浓度2.06 mmol/L、NaCl浓度96.78 mmol/L,在此培养条件下,GABA含量为(273.34±4.17)mg/100 g。为了实际操作方便将最佳工艺参数整理为MSG质量浓度l.0 mg/mL、PLP浓度2.0 mmol/L,CaCl2浓度2.0 mmol/L、NaCl浓度100 mmol/L。在最佳工艺条件下进行验证实验,重复3 次,平均值为(269.93±4.73)mg/100 g,与预测值的误差为1.24%,两者吻合较好,证明模型可行。

2.3 低盐胁迫下大豆发芽富集GABA机理

2.3.1 盐种类对于大豆发芽富集GABA的影响

图6 盐种类对GABA含量的影响
Fig.6 Effect of salt species on the GABA content

由图6可知,实验中大豆发芽在所考察的不同种类盐的胁迫下均比空白对照的GABA含量要高。盐的种类不同,在相同浓度条件下,大豆发芽富集GABA的含量不同,NaCl胁迫下GABA含量最高,差异性显著(P<0.05),且NaCl为食用盐,因此在后面的盐胁迫实验研究中均采用NaCl进行处理。

2.3.2 NaCl浓度对于大豆发芽富集GABA的影响

图7 NaCl的浓度对GABA含量的影响
Fig.7 Effect of NaCl concentration on the GABA content

NaCl胁迫处理显著的提高了发芽大豆中GABA含量,发芽大豆中GABA含量随NaCl浓度的增加呈先升高后降低趋势,在100 mmol/L NaCl处理下发芽大豆GABA富集量最高,且差异性显著(P<0.05),是对照组的1.48 倍。

2.3.3 NaCl胁迫对于大豆发芽过程中理化指标的影响

由图8a可知,大豆在100 mmol/L NaCl胁迫下,芽生长速率显著低于对照,培养60 h时,大豆芽长仅为对照的75%。方差分析表明,处理组芽长显著低于对照组(P<0.05),即NaCl胁迫抑制了发芽大豆的生长。

由图8b可知,随着发芽时间的延长,发芽大豆中可溶性蛋白含量都在升高,处理组中可溶性蛋白含量始终显著高于对照组(P<0.05),且可溶性蛋白增长速率也高于对照组。48 h后,处理组可溶性蛋白含量开始下降。

由图8c可知,盐胁迫处理下发芽大豆60 h内游离氨基酸含量呈先上升后下降的趋势,处理组显著高于对照组(P<0.05)。在48 h时,处理组游离氨基酸含量达到最大值22.24 mg/g,这对于人体必需氨基酸的摄入和快速补充具有重要意义。据报道,盐胁迫下氨基酸的积累不仅仅是由于蛋白质水解的加剧,其自身合成能力的增强和蛋白质合成能力下降可能是氨基酸含量上升的主要原因[30-31]

由图8d可知,在NaCl胁迫条件下,随着发芽时间的延长,GAD活性逐步增高,且处理组与对照组具有显著差异(P<0.05)。在48 h时,处理组达到最大值1.43 U/g,是对照组的1.35 倍。发芽48 h后,发芽大豆中GAD活性有下降的趋势。

图8 NaCl胁迫下发芽大豆生理生化指标的变化
Fig.8 Changes in physiological indexes of soybean during germination under NaCl stress

2.3.4 盐胁迫对于大豆发芽过程中GABA含量的影响

图9 NaCl胁迫下发芽大豆中GABA含量的变化
Fig.9 Changes in GABA content of soybean during germination under NaCl stress

由图9可知,盐胁迫下发芽大豆中GABA含量呈先上升后下降的变化趋势,且处理组含量显著高于对照组(P<0.05)。盐胁迫处理48 h时,GABA含量达到最大值244.40 mg/100 g,是胁迫前的1.14 倍。48 h后,GABA含量开始下降。

2.3.5 盐胁迫下大豆发芽生理活性和GABA等物质含量的相关性分析

表5 盐胁迫下大豆发芽生理活性和GABA等物质含量的相关性分析
Table5 Correlation coefficients between GABA content and physiological and biochemical properties of germinated soybean under NaCl stress

注:*.显著,P<0.05;**.极显著,P<0.01。

盐胁迫下大豆发芽期间GABA含量与其他指标之间相关性分析表明,盐胁迫下发芽大豆GABA含量与芽长(r=0.852)、GAD活性(r=0.939)、游离氨基酸含量(r=0.848)和可溶性蛋白含量(r=0.812)之间显著或极显著正相关。

以上研究表明,盐胁迫下发芽大豆GABA的富集与大豆的生长、GAD活性、游离氨基酸和可溶性蛋白质密切相关,在低盐胁迫下,大豆发芽受到抑制,但促进了GAD活性的升高,游离氨基酸和可溶性蛋白质含量增加,从而富集产生了较多的GABA。

3 结 论

大豆发芽富集GABA有效的培养液组分为MSG 1.0 mg/mL、PLP 2.0 mmol/L、CaCl22.0 mmol/L、NaCl 100 mmol/L。在最佳工艺参数下得到的发芽大豆,其中GABA含量为(269.93±4.73)mg/100 g,比大豆发芽前提高了约10 倍。

不同盐类胁迫下,大豆发芽富集GABA含量不同,NaCl胁迫下GABA富集量最高;发芽大豆中GABA含量随NaCl浓度的增加呈先升高后降低趋势,在100 mmol/L NaCl处理下发芽大豆GABA富集量最高。

发芽大豆游离氨基酸含量、GAD活性和GABA含量随胁迫时间延长先升高后下降,在48 h时都达到最佳点;盐胁迫下大豆发芽期间GABA含量与芽长、GAD活性、游离氨基酸和可溶性蛋白含量之间显著正相关;随着发芽时间的延长,盐胁迫下发芽大豆生长越好,发芽大豆的芽长更长,GAD活性更高,可溶性蛋白和游离氨基酸含量更高,从而使干物质含量降低。同时,在蛋白酶的作用下,大分子蛋白分解为小分子的可溶性蛋白和游离氨基酸,这为GABA富集提供了充足的底物,从而富集产生了较多的GABA。

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Optimization of Medium Composition for γ-Aminobutyric Acid Accumulation in Germinated Soybean and Mechanism of γ-Aminobutyric Acid Accumulation under Salt Stress

ZENG Qing1, XIE Fei1, YIN Jingyuan2, GAO Haiyan1,*
(1. Shanghai Key Laboratory of Bio-Energy Crops, School of Life Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China; 2. School of Computer Engineering and Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

Abstract:The aim of this study was to investigate the inf l uence of medium components on γ-aminobutyric acid (GABA) enrichment during soybean sprouting and further to optimize the variables by response surface methodology (RSM). Furthermore, the mechanism of GABA accumulation in germinated soybean under low salt stress was also preliminarily investigated. The results demonstrated that soybean germination in the optimized medium containing 1.0 mg/mL sodium glutamate (MSG), 2.0 mmol/L pyridoxal phosphate (PLP), 2.0 mmol/L CaCl2and 100 mmol/L NaCl yielded accumulation of a high level of GABA, (269.93 ± 4.73) mg/100 g dry weight, which was around11 times higher compared with ungerminated soybeans (control). With increasing concentration of NaCl and extending stress time, glutamine acid decarboxylase activity and GABA content of sprouted soybean increased. Correlation analysis indicated that there was a signif i cantly positive correlation between the GABA content of sprouted soybean and sprout length, glutamine acid decarboxylase activity, free amino acids content or soluble protein content. The germination of soybeans was restrained, the GAD activity was enhanced, and the contents of free amino acid and soluble protein were increased under low salt stress. Finally, GABA was accumulated at a high level.

Key words:γ-aminobutyric acid; response surface methodology; salt stress; enrichment process

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201712015

中图分类号:TS201.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)12-0096-08

引文格式:曾晴, 谢菲, 尹京苑, 等. 大豆发芽富集γ-氨基丁酸的培养液组分优化及盐胁迫下的富集机理[J]. 食品科学, 2017, 38(12):96-103.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201712015. http://www.spkx.net.cn

ZENG Qing, XIE Fei, YIN Jingyuan, et al. Optimization of medium composition for γ-aminobutyric acid accumulation in germinated soybean and mechanism of γ-aminobutyric acid accumulation under salt stress[J]. Food Science, 2017, 38(12): 96-103. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201712015. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-07-01

基金项目:上海大学“食品科学学科建设”项目

作者简介:曾晴(1992—),女,硕士研究生,主要从事果蔬采后保鲜技术研究。E-mail:zengqing0403@163.com

*通信作者:高海燕(1975—),女,副教授,博士,主要从事果蔬采后保鲜技术研究。E-mail:hygao1111@126.com