吹扫捕集-热脱附-气相色谱-质谱联用法分析不同产地香樟叶精油成分及抑菌活性比较

王 进,曹先爽,宋 丽,丁兆青,汤 锋,岳永德

(国际竹藤中心,国家林业局竹藤科学与技术重点实验室,北京 100102)

摘 要:采用吹扫捕集-热脱附-气相色谱-质谱法,分析3 个不同产地(广西、江西和安徽)的香樟叶精油成分差异,比较3 种香樟叶精油对植物病原真菌的抑制活性。结果表明,从3 种不同产地香樟叶精油中检出挥发性成分的数量依次为:江西香樟22 种,安徽香樟20 种,广西香樟16 种。3 种香樟叶精油的共有成分主要为萜烯类化合物,相对含量不小于1%的共有成分为月桂烯、β-石竹烯和芳樟醇。芳樟醇的相对含量在3 个产地的精油中差异较大,依次为:广西产地(76.97%)>江西产地(32.40%)>安徽产地(1.39%)。进一步利用全二维气相色谱-飞行时间质谱法,分析广西产地的香樟叶精油成分,结合保留指数,鉴定出44 种化合物。抑菌活性结果表明,广西产地的香樟叶精油具有较好抑菌活性,对苹果炭疽菌、番茄灰霉菌和小麦赤霉菌的半抑制浓度值(处理48 h后)分别为:31.74、35.79 mg/L和38.02 mg/L。香樟叶精油中的芳樟醇成分对其抑菌活性具有重要贡献。本研究为香樟叶精油在果蔬防腐保鲜剂及相关产品的研发提供基础。

关键词:香樟;精油;挥发性成分;抑菌活性;吹扫捕集-热脱附-气相色谱-质谱联用仪;全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOFMS)

果蔬等食品容易受到真菌侵染而腐烂变质,影响果蔬的品质和货架期。目前,常用农药杀菌剂作为果蔬防腐剂,存在农药残留超标和环境污染等问题。因此,迫切需要天然果蔬防腐剂的研发[1-3]。自古以来,在民间药方及食品防腐中常用芳香植物,植物精油有良好的抑菌效果,并具有安全无毒的优点[4]。研究表明,植物精油以涂膜的方式对柑桔果实进行防腐保鲜,能保持果实良好的品质,可用于商业推广[5]

香樟(Cinnamomum camphora L. Presl)属于樟科,是一种常绿阔叶树种,广泛分布在我国南方地区,该树种富含植物精油。香樟精油具有多种生物活性,如抑菌[6-7]、抗氧化[8]、杀虫[9-10]和趋避[11]等活性。香樟精油中含有萜烯类、酮类、醇类等成分[12-14],但不同产地的香樟精油成分受地理、气候等因素的影响会存在差异[15]。在食品领域,香樟果提取物添加在食品包装材料中,起到对食品防腐保鲜的作用[16]。另外,植物精油结合气调包装,也能达到较好的抑菌效果[17]。在体外抑菌实验中,香樟精油可抑杀空气中约32.79%的细菌[18]。这说明植物精油的挥发性成分起到重要活性作用。因此,香樟精油既有触杀抑菌活性,又有熏蒸作用。目前,在果蔬保藏过程中抑菌的研究存在主要问题是:1)单一成分的杀菌剂易产生抗性菌株,导致药物残留高,影响食品安全性;2)植物精油作为替代化学药剂的果蔬防腐剂,能够保持果实品质,食用安全性高,但精油的有效组分会受植物产地等因素影响,存在不确定性,抑菌机理不完全清楚。前期研究发现,香樟精油具有抑菌活性,其化学成分是抑菌活性的物质基础,但对不同产地香樟精油化学成分的比较分析及抑菌活性评价,鲜见报道。因此,本实验利用吹扫捕集(purge and trap,P&T)法对香樟叶精油的挥发性成分进行富集,用热脱附结合气相色谱-质谱(thermal desorption-gas chromatographymass spectrometry,TD-GC-MS)联用技术进行分析,比较了3 个不同产地的香樟叶精油的挥发性成分;采用菌丝生长速率法,评价不同产地的香樟叶精油对3 种常见的果蔬植物病原真菌的抑制活性;对抑制菌丝生长能力较强的广西香樟叶精油成分,进一步利用全二维气相色谱-飞行时间质谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry,GC×GCTOFMS)技术进行分析鉴定,通过不同仪器手段对香樟精油成分比较分析,旨在全面分析香樟精油的化学成分特征,为香樟叶精油在果蔬防腐剂领域的应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香樟叶从广西南宁、江西南昌和安徽合肥采集,将采回的香樟叶放在室内自然风干,粉碎后于-20 ℃冰柜中备用。供试菌株苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)均由安徽农业大学植物病理学教研室提供。

芳樟醇(纯度97%) 美国Sigma-Aldrich公司;咪鲜胺(纯度98.5%) 德国Dr. Ehrenstorfer公司;正构烷烃混标(C7~C30) 美国Supelco公司;正己烷(色谱纯)美国Fisher公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Turbo Matrix 650 ATD全自动热脱附仪 美国PE公司;Tenax TA吸附管 美国Camsco公司;P&T瓶自制;6890N/5973i GC-MS联用仪 美国Agilent公司;Pegasus 4D GC×GC-TOFMS联用仪 美国LECO公司;CL-3型恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;CHB-1抗生素效价测量仪 北京潮声公司;BP221S电子天平 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 香樟叶精油的制备

准确称取50.0 g粉碎后的香樟叶样品,装入挥发油提取器(规格1 L)中,加入500 mL超纯水,加热至微沸腾,提取6 h,获得的精油经无水硫酸钠干燥,实验重复3 次,获得精油于-20 ℃冰柜中备用[10]。按公式(1)计算精油得率:

式中:M1为精油的净质量/g;M2为植物干样的总质量/g。

1.3.2 香樟叶精油成分的P&T-TD处理

取0.1 mL的香樟叶精油置于吹扫捕集瓶中,在室温条件下,一端以100 mL/min的流速通入高纯氮气(99.999%),另一端接上老化后的吸附管(含Tenax TA吸附剂),采样时间5 min,取下Tenax TA吸附管,立即在两端盖上铜制防护帽,于干燥器内密封保存,待测。

TD条件:吸附管干吹1 min(为降低解析过程中吸附剂和样品被氧化的风险);脱附温度(一级热脱附温度)260 ℃,脱附10 min;脱附流量25 mL/min;一级热脱附时冷阱温度为-30 ℃,一级至二级热脱附过程中,冷阱以40 ℃/s升温至300 ℃,进样时间0.5 min;进口分流90 mL/min;载气(He)流速1 mL/min;阀温度250 ℃;传输线温度255 ℃;循环时间70 min[19-20]

1.3.3 不同产地香樟叶精油的抑菌活性

采用菌丝生长速率法[21],选择常见的果蔬、农作物致病菌苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)3 种植物病原真菌为供试菌种。称取1.3.1节制备的香樟叶精油适量,先用1 mL的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解后,再用无菌水定容至10 mL,最终将香樟叶精油配成质量浓度为250、500、700、850 mg/L和1 000 mg/L。未加精油的无菌水作为对照,以农药咪鲜胺为阳性对照,每个处理重复3 次,用打孔器把供试菌种的培养基制成菌饼(直径7 mm),接种于含药培养基平板的中心(菌丝面朝下),放置于28 ℃培养箱内培养48 h和60 h,用十字交叉法测量真菌菌落直径(mm)。

1.3.4 GC-MS分析条件

色谱柱:J&W D B-5 M S石英毛细柱(30 m×0.25 mm,0.25 µm);升温程序:50 ℃保持1 min,以3 ℃/min升至180 ℃。

MS条件:电子电离源;电子能量70 eV;传输线温度280 ℃;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;全扫描模式采集数据,质量扫描范围m/z 25~550。

1.3.5 GC×GC-TOFMS分析条件

色谱柱:一维柱:Rxi-5 Sil MS石英毛细柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);二维柱:Rxi-17 Sil MS石英毛细柱(2 m×0.18 mm,0.18 μm);一维柱升温程序:50 ℃保持0.2 min,以8.0 ℃/min速率升至280 ℃;二维柱炉温补偿5 ℃;调制周期4.0 s,热脉冲0.8 s;进样口及传输线温度为240 ℃和280 ℃;载气流速:高纯氦气1.0 mL/min;分流进样模式,分流比50∶1;进样量1 μL。

MS条件:检测器电压1 420 V;离子源温度250 ℃;采集频率100 spec/s;质量扫描范围m/z 33~550[10]

1.3.6 真菌生长抑制率

抑菌活性的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)和95%置信区间是用统计分析软件SPSS的概率回归分析计算[22]。按公式(2)计算菌丝生长抑制率:

式中:dc为空白对照的菌落直径/mm;d0为供试菌饼的直径/mm;dt为处理样品抑菌后菌落的直径/mm。

2 结果与分析

2.1 P&T-TD-GC-MS分析不同产地香樟叶精油挥发性成分

从广西、江西和安徽3 个产地采集的香樟叶,经水蒸气蒸馏法制备精油,其精油得率分别为(2.3±0.4)%、(0.9±0.1)%和(0.6±0.2)%。所得精油的颜色外观均为浅黄色,香味浓郁。以P&T-TD-GC-MS分析3 种香樟叶精油的挥发性成分,用NIST 02标准质谱图库检索(匹配度≥80%),以峰面积归一化法计算精油成分的相对含量,结果见表1。

表1 P&T-TD-GC-MS分析不同产地樟树叶精油的挥发性成分
Table1 Volatile compounds identified in the essential oils of C. camphora from different geographic origins by P&T-TD-GC-MS

注:/.未检出或不存在。

由表1可知,从香樟叶精油中共鉴定出挥发性成分31 种,包括萜烯类、醇类、酮 类和醛类等。其中,从江西产地的香樟叶精油中鉴定出22 种,检出峰的面积占总峰面积的( 面积归一化法)96.14%,从安徽产地的香樟叶精油中鉴定出20 种,占总峰面积的78.66%,从广西产地的香樟叶精油中鉴定出16 种,占总峰面积的92.77%,说明检出的化合物是香樟叶精油的主要挥发性成分。

不同产地的3 种香樟叶精油,其挥发性成分的共有成分有10 种,分别为烯类7 种(莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-水芹烯、柠檬烯、β-罗勒烯和β-石竹烯)、醛类1 种(青叶醛)、烷烃类1 种(对伞花烃)和醇类1 种(芳樟醇)。共有成分主要为烯类化合物,其中相对含量在1%以上的成分为β-月桂烯、β-石竹烯和芳樟醇。芳樟醇的相对含量在3 个产地的精油中差异较大,依次为广西产地(76.97%)>江西产地(32.40%)>安徽产地(1.39%)。

2.2 GC×GC-TOFMS分析香樟叶精油成分

根据预实验的结果,广西产地的香樟叶精油表现出较好抑菌活性,为了进一步分析其精油的化学成分,把广西香樟叶精油用正己烷稀释后,直接进GC×GCTOFMS仪进行分析,通过NIST 2011谱库检索结合保留指数(retention indices,RI)进行定性,保留指数根据正构系列烷烃C7~C30在相同色谱条件下的保留时间计算。检出化合物与谱库的相似度大于80%的予以报道,见表2。

表2 GC×GC-TOFMS分析广西樟树叶精油成分结果
Table2 Chemical compounds identified in the essential oil of C. camphora from Guangxi province by GC GC-TOFMS

22松油烯-4-醇 terpinen-4-ol1 182640、1.808360.05 23松油醇 α-terpineol1 193652、1.888260.09

续表2

注:保留时间分别为一维色谱柱和二维色谱柱的出峰时间。

从表2可知,GC×GC-TOFMS检出化合物的数量为44 种,明显多于P&T-TD-GC-MS的检出数量(16 种),可能由于全二维色谱提供了良好色谱分离度,一些化合物在一维色谱难以分开,在二维色谱中能够较好分离,并结合飞行时间质谱进行定性,鉴定结果的可靠度更高。

把GC×GC-TOFMS和P&T-TD-GC-MS两种方法检出的香樟叶精油成分,按化合物类别进行归类比较,每种类型包括化合物的个数、相对含量和共有成分,见表3。

表3 GC×GC-TOFMS和P&T-TD-GC-MS分析香樟叶精油成分种类的比较
Table3 Comparison of volatile compounds of the essential oil of C. camphora using GC GC-TOFMS and P&T-TD-GC-MS

由表3可看出,2 种分析技术共鉴定出60 种化学成分,其中,共有成分为10 种,主要成分均为醇类和萜烯类,其中芳樟醇的相对含量均大于70%。醇类的相对含量最高,萜烯类化合物的数量最多。利用GC×GC-TOFMS和P&T-TD-GC-MS两种不同的分析技术,对广西香樟叶精油成分进行深入分析,获得更为全面的香樟精油成分信息,为其应用研究提供参考。

2.3 不同产地香樟叶精油抑菌活性比较

表4 不同产地香樟精油和咪鲜胺对3 种真菌的半抑制浓度值及置信区间
Table4 Antifungal activities of prochloraz and different C. camphora oils against three pathogenic fungi

注:括号内数值为IC50值的95%置信区间;—.未处理。

以3 个产地的香樟叶精油为材料,采用菌丝生长速率法,进行抑菌活性比较,阳性对照为化学农药咪鲜胺,抑菌活性结果,见表4。3 种不同产地香樟叶精油对供试病原真菌均具有抑菌效果,以IC50值为指标,广西香樟精油能有效抑制供试植物病原真菌的菌丝生长,对苹果炭疽菌、番茄灰霉菌和小麦赤霉菌的IC50值(处理48 h后)分别为31.74、35.79和38.02 mg/L。不同产地的3 种香樟叶精油对苹果炭疽菌和番茄灰霉菌的抑菌活性大小依次为广西>安徽>江西。

据报道,精油中萜烯类化合物,如樟脑、柠檬烯、蒎烯等具有抑制真菌的作用[23]。体外实验证明,芳樟醇、β-石竹烯有显著的抑菌活性[24-25]。由表4可知,芳樟醇表现出较强的抑菌活性,对苹果炭疽菌、番茄灰霉菌和小麦赤霉菌的IC50值(处理48 h后)分别为69.30、34.75 mg/L和26.21 mg/L,而广西香樟叶精油中含有丰富的芳樟醇,因此,芳樟醇可能是香樟叶精油抑菌活性的主要成分。

3 讨论与结论

造成果蔬腐烂变质的真菌病害主要有青霉病、绿霉病、黑腐病、蒂腐病、炭疽病和酸腐病等[26]。本研究选择了3 种常见的植物病原真菌作为供试靶标,但抑菌的活性与文献报道存在差异。如魏琴等[27]研究油樟精油对几种植物病源真菌的抗菌作用,其中对赤霉菌和炭疽菌的IC50值分别为1.29 μL/mL和1.50 μL/mL。存在抑菌活性差异的主要原因可能是样品来源以及菌种等因素。

不同产地樟树叶精油的化学成分的相对含量存在差异,如,Zhu Fengjun等[28]用静态顶空分析了上海樟树叶的挥发性成分,检出化学成分59 种,其中反式橙花叔醇的相对含量最高占19.49%,芳樟醇占3.84%。任露洁等[29]利用TD-GC-MS联用技术,对香樟林内的挥发物进行分析,结果表明,醇类、酮类、烯烃以及烷烃等化合物的相对含量较高,是香樟林内的主要有机挥发物,与本实验研究的香樟叶精油成分的结果类似,也说明了香樟林中的挥发物成分主要是香樟叶精油成分。同时,香樟林空气中的微生物也受到明显的抑制作用[30]。起到抑菌作用的精油成分,主要是易挥发的成分,精油的脂溶性能使其更容易透过细胞质膜,精油中的挥发性成分能够使细胞质凝结和菌丝裂解凋亡,从而产生抑菌作用[23]

据报道,把芳樟醇化合物添加到肉桂、丁香等精油中,能够对精油的抑菌活性起到协同增效作用[25]。本研究表明,广西香樟叶精油中富含芳樟醇,但以苹果炭疽菌为例,芳樟醇单体化合物的抑菌活性(IC50=69.30 mg/L)比广西香樟叶精油的抑菌活性(IC50=31.74 mg/L)低,可能由于广西香樟叶精油中存在其他抑菌能力更强的成分,或不同成分间产生了协同增效作用,因此,将广西香樟叶精油与其他植物精油复合,可能会有更好的抑菌效果。下一步有待于用香樟精油中主要成分的标准品进行抑菌和定量分析,确定出主要抑菌成分及其协同增效关系。

本研究对3 个不同产地香樟叶精油成分及其抑制真菌活性进行比较,研究结果说明不同产地香樟叶精油的主要成分相似,但相对含量存在差异,这些主要 成分是香樟叶精油抑菌活性的物质基础,研究发现广西香樟叶精油对供试真菌的抑制活性较好,芳樟醇是香樟叶精油的主要活性成 分之一,因此,将广西香樟叶精油应用在果蔬防腐剂领域,有望取得更好的抑菌效果和应用前景。

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Comparative Chemical Composition and Antifungal Activity of the Essential Oils of Cinnamomum camphora L. Presl Leaves from Three Geographic Origins

Abstract:The essential oils of Cinnamomum camphora L. Presl from three different origins obtained by hydrodistillation were analyzed by purge and trap thermal desorption-gas chromatography-mass spectrometry (P&T-TD-GC-MS), and their in hibitory activity against plant pathogenic fungi was comparatively assessed. A total of 22, 20 and16 volatile components were detected in the essential oils of C. camphora grown in Jiangxi, Anhui and Guangxi provinces, respe ctively. The major components identified with a relative content of more than 1% were β-myrcene, β-caryophyllene and linalool. Furthermore, the essential oil of C. camphora from Guangxi province was also analyzed by comprehensive two-dimensional gas chromatography-timeof-flight mass spectrometry (GC×GC-TOFMS). A total of 44 components were identified in the essential oil of C. camphora from Guangxi province, dominated by alcohols and terpenes. In the antifungal assay, the leaf oil from Guangxi province showed strong antifungal activities against Colletotrichum gloeosporioides, Botrytis cinerea, and Fusarium graminearum with half maxim al inhibitory concentration (IC50) values of 31.74, 35.79 and 38.02 mg/L (after 48 h of treatment), respectively. Linalool was found to be a significant contributor to the antifungal activity. Overall, the essential oil of C. camphora might have the potential to be developed into a natural antimicrobial agent that can be used in the preservation of fruits and vegetables.

Key words:Cinnamomum camphora L. Presl; essential oil; volatile components; antifungal activity; purge and trap thermal desorption-gas chromatography-mass spectrometry (P&T-TD-GC-MS); comprehensive two-dimensional gas chromatographytime-of-flight mass spectrometry (GC×GC-TOFMS)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201712 020

中图分类号:TS201.6;S789.4

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)12-0131-06

引文格式:

收稿日期:2016-09-13

基金项目:国家林业局948项目(2014-4-33);国际竹藤中心基本科研业务费专项(1632014009);“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD23B0304)

作者简介:王进(1977—),男,副研究员,博士,研究方向为植物化学。E-mail:wangjin@icbr.ac.cn王进, 曹先爽, 宋丽, 等. 吹扫捕集-热脱附-气 相色谱-质谱联用法分析不同产地香樟叶精油成分及抑菌活性比较[J]. 食品科学, 2017, 38(12): 131-136.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201712020. http://www.spkx.net.cn

WANG Jin, CAO Xianshuang, SONG Li, et al. Comparative chemical composition and antifungal activity of the essential oils of Cinnamomum camphora L. Presl leaves from three geographic origins[J]. Food Science, 2017, 38(12): 131-136. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201712020. http://www.spkx.net.cn

WANG Jin, CAO Xianshuang, SONG Li, DING Zhaoqing, TANG Feng, YUE Yongde

(SFA Key Laboratory of Bamboo and Rattan Science and Technology, International Centre for Bamboo and Rattan, Beijing 100102, China)