图1 72 种兽药的提取离子流叠加图（a）及3 种磺胺类同分异构体化合物的色谱分离图（b）b
Fig.1 Overlapping extracted ion chromatograms (XICs) of 72 veterinary drugs (a) and chromatograms of three sulfonamide isomers (b)
郝 杰1，姜 洁1,*，余建龙2，路 勇1，毛 婷1，孙晓冬1，杨丽梅1
（1.北京市食品安全监控和风险评估中心，北京 100041；2.沃特世科技有限公司，北京 100026）
摘 要：利用通过固相萃取法结合超高效液相色谱-串联质谱法建立同时检测猪肉、鱼、虾等动物源性食品中磺胺类、喹诺酮类、糖皮质激素类、大环内酯类、β-受体激动剂类、类固醇激素类、四环素类、青霉素类、氯霉素类、头孢菌素类10大类72 种兽药残留的分析方法。样品经80%乙腈溶液提取，直接通过不经活化的Prime HLB固相萃取柱进行净化。使用C18色谱柱分离，电喷雾离子源分段多反应监测扫描模式检测，外标法定量。72 种兽药定量限为0.5～5 μg/kg，各基质中回收率在75.6%～122.3%之间，相对标准偏差为0.6%～10.7%。本方法极大地提高了多残留兽药的检测效率，适用于食品安全突发事件应急处置中多残留兽药的快速分析。
关键词：固相萃取；超高效液相色谱-串联质谱法；兽药多残留；动物源性食品
随着农业养殖科技水平的不断提高，兽药在畜牧业中的使用日趋广泛。动物源性食品因消费量大，受众范围广，其兽药残留受到人们普遍的关注。为保证食品安全，我国发布了多项法规以规范兽药使用[1]，及明确动物源性食品中兽药残留的检出限量等[2-3]。但是畜牧业中目前有近百种兽药在使用[4]，其理化性质各异，大量的动物源性食品需进行兽药残留分析。国家标准方法多以化学结构类似的同族化合物进行方法开发[5-6]，对同一样本无法做到在短时间内快速筛查多类兽药残留。相关多残留检验方法也有报道[7-10]，陈刚等[11]开发了35 种兽药残留的多残留检测方法，Dasenaki等[12]开发了牛奶、黄油、鱼、鸡蛋中115 种兽药的多残留方法，Zhang Yaqian等[13]利用飞行时间质谱法研究了蜂王浆中90 种兽药的检测方法。在已报道的分析方法中，由于目标物极性分布宽泛，前处理技术多采用QuEChERS法[14-17]或吸附-洗脱模式的固相萃取法[18-21]，但这些方法依然有前处理步骤多、速度较慢，涵盖基质范围不宽等局限性。
本研究采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法对猪肉、鱼、虾等动物源性食品中10大类72 种兽药进行测定，方法快速、稳定、定量限低，能够满足动物源性食品中多种类兽药风险筛查及监测工作的需要。
1.1 材料与试剂
甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯） 美国Fisher公司；72 种兽药标准品，其中包括16 种喹诺酮类、14 种磺胺类、9 种糖皮质激素类、7 种大环内酯类、7 种β-受体激动剂类、6 种类固醇激素类、4 种四环素类、4 种青霉素类、3 种氯霉素类、2 种头孢菌素类（纯度均大于95%），购自德国Dr.Erenstofer公司、加拿大Toronto Research Chemicals公司或美国Sigma Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪（配有Acquity UPLC超高效液相色谱仪及电喷雾离子源）、Oasis Prime HLB 200 mg/6 mL固相萃取柱 美国Waters公司；Thermo X1R高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher公司；Milli Q超纯水系统 美国Millipore公司；GM200刀式研磨仪德国Retsch公司；ENVI氮吹仪 美国OA公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
称取适量标准品，分别用甲醇配制成1 000 μg/mL的标准储备液，存放在－20 ℃环境中，在后续实验中，根据实验需要分别取适当量的储备液，用甲醇稀释成混合标准工作液。
1.3.2 样品前处理
称取2.5 g均质后的样品于聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL 80%的乙腈溶液，充分涡旋混匀后，超声提取30 min，在10 000 r/min离心10 min，取5 mL上清液，以通过的形式经过不经活化的Prime HLB固相萃取柱，接收过柱后的样液，取4 mL在45 ℃条件下用微弱N2气流吹干，用1 mL 0.1%甲酸溶液-甲醇（90∶10，V/V）复溶残渣，经0.22 μm滤膜过滤后，上机测定。
1.3.3 超高效液相色谱-串联质谱条件
色谱柱：W a t e r s A c q u i t y B E H C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；流动相：A相为甲醇，B相为0.1%甲酸溶液；梯度洗脱程序：0～0.25 min，2% A，0.25～12.25 min，2%～99% A，12.25～13.00 min，99% A，13.00～13.01 min，99%～2% A，13.01～17.0 min，2% A；流速：0.45 mL/min；进样量：10 μL。
质谱条件：采用电喷雾离子源；正负离子切换扫描；多反应监测扫描模式分段检测（每个质谱扫描窗口为该化合物保留时间±0.5 min）；毛细管电压0.80 kV，锥孔气流量150 L/h；脱溶剂气温度450 ℃；脱溶剂气流量800 L/h；雾化气压力7.0 bar。
2.1 超高效液相色谱-串联质谱条件的选择
用甲醇分别配制50 ng/mL的标准品，通过蠕动泵注入持续进样，与适当流速的流动相共同进入质谱仪中。化合物进入电喷雾离子源后，均能够形成稳定的加合离子，在一级质谱模式下，调节锥孔电压使得母离子的丰度最大。开启二级质谱后，逐渐增大碰撞能量，观察记录离子碎片，选择相对丰度较高，出峰稳定的碎片，微调碰撞能量，使得碎片离子的丰度最大。
图1 72 种兽药的提取离子流叠加图（a）及3 种磺胺类同分异构体化合物的色谱分离图（b）b
Fig.1 Overlapping extracted ion chromatograms (XICs) of 72 veterinary drugs (a) and chromatograms of three sulfonamide isomers (b)
在已报道的文献中[22-25]，对兽药多残留检测中色谱柱的选择有很好的优化，故在本研究中参考其结论，选用Waters BEH C18色谱柱对目标化合物进行分离，考察了甲醇、乙腈、0.1%甲酸溶液、甲醇（含1%1 mol/L pH 5.0乙酸铵），水（含1%1 mol/L pH 5.0乙酸铵）等不同流动相组成对分离效果的影响。结果表明，使用甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相可有效分离72 种目标化合物。其中，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶等同分异构体也能达到良好的分离，如图1所示。72 种兽药的保留时间、定量、定性离子对、锥孔电压和碰撞能量见表1。
表1 72 种兽药保留时间及质谱参数
Table1 Retention times and mass spectrometric parameters of 72 veterinary drugs
续表1
续表1
注：*.定量离子对。
2.2 提取溶剂的选择
甲醇和乙腈作为兽药多残留检测最常用的提取溶剂[26-28]，本实验考察了不同提取溶剂对目标化合物提取效率的影响，包括乙腈、0.1%甲酸-乙腈、80%乙腈溶液、甲醇。如图2所示，首先使用酸化提取溶剂会对氯霉素、糖皮质激素等化合物的回收率造成较大影响。另外多组分兽药的极性范围较广，结果表明使用纯甲醇提取效率低于使用乙腈的提取液，但是采用纯乙腈溶液提取，无法兼顾极性较大的兽药（如西马特罗、磺胺醋酰），加入水相调整提取液极性可以兼顾不同极性的目标物质，80%乙腈溶液具有较好的提取效率。另一方面由于后续步骤选用了直接通过净化的固相萃取处理，如水相比例过高，则有可能导致目标化合物在固相萃取中吸附，且后续浓缩过程也可能收到影响。综合以上因素考虑，使用80%乙腈溶液作为提取溶剂。
图2 比较分析不同提取条件对目标化合物的影响
Fig.2 Comparative effect of different extraction methods on recovery of target compounds
2.3 净化策略的选择
图3 比较分析4种固相萃取柱对10 类化合物回收率的影响
Fig.3 Comparison of average recovery of10 veterinary drugs using4 different SPE columns
72 种目标化合物极性不同，且适用于不同的固相萃取柱，为兼顾所有化合物，采用了极性吸附原理的固相萃取柱，使用通过策略进行固相萃取净化，可以在去除磷脂，蛋白等杂质的同时，把净化步骤对目标化合物的损失降至最小。prime HLB固相萃取柱是在HLB亲水亲脂平衡柱的基础上，增加了对磷脂、蛋白等干扰物的净化效果，同时改进了筛板使得不易造成堵塞[29]。选取了Waters Oasis HLB（200 mg/6 mL）、Waters Oasis prime HLB（200 mg/6 mL）和Dikma ProElut PLS（200 mg/6 mL）3 种常见的亲水亲脂平衡柱及Dikma ProElut C18（500 mg/6 mL）柱进行对比。图3为使用不同固相萃取柱情况下，10大类化合物的平均回收情况。结果表明，使用prime HLB柱可有效降低杂质干扰，在相对比的情况下，可在喹诺酮类、青霉素类等化合物上达到更高回收率。
表2 猪肉、鱼、虾中72 种兽药的线性范围、曲线相关系数、定量限、基质效应、回收率及精密度数据
Table2 Linear range, correlation coefficient, LOQ, matrix effect, recovery and precision data of 72 veterinary drugs in pork, fish and shrimp
续表2
2.4 方法学验证
2.4.1 基质效应
选取猪肉、鱼、虾等常见动物源性食品基质进行了方法验证。基质效应根据基质空白配制标样响应值与同质量浓度溶剂标样响应值的比值进行评价。基质效应大于1时为基质增强效应，小于1为基质抑制。对于基质效应过强的样品，应采取相应的处理手段以减小其对测定的干扰。从实验结果可以看出，基质对倍他米松、倍氯米松、泰乐菌素等化合物具有较强的基质抑制效应，而头孢匹林、磺胺甲氧哒嗪、睾酮等化合物表现出基质增强效应，为消除基质效应带来的影响，本方法采用基质加标标准曲线定量法。
2.4.2 标准曲线和定量限
在空白样品中添加混合标准溶液，制备成分别为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/kg的系列加标样品不同系列水平的混合标准溶液，按前处理步骤处理后上机测定，按信噪比10∶1得到目标化合物的定量限。以质谱响应值为纵坐标，添加质量浓度为横坐标，绘制基质加标工作曲线，得到本方法的线性范围，回归曲线方程及相关系数（表2）。
2.4.3 回收率和精密度
分别取猪肉、淡水鱼、虾空白样品，根据定量限1、2、10 倍的质量浓度，添加低、中、高3 个不同水平的72 种兽药混合标准溶液，进行前处理，测定目标化合物。每个水平进行6 次实验，结果见表3，72 种化合物在猪肉中的平均回收率为77.9%～122.3%，相
对标准偏差为0.6%～10.4%；在淡水鱼中平均回收率为76.5%～112.5%，相对标准偏差为0.9%～10.7%；在虾中平均回收率为75.6%～117.8%，相对标准偏差为0.6%～10.2%。参考GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的相关要求[30]，其精密度满足残留检测的要求。
2.5 实际样品测定结果
图4 淡水鱼样品中检出头孢噻肟、恩诺沙星提取离子流图
Fig.4 XICs of fish samples containing enrofloxacin and ciprofloxacin
随机选取市售淡水鱼、虾共计64 个。应用建立的方法对样品进行72 种兽药残留的快速筛查，结果如图4所示，在淡水鱼样品中检出恩诺沙星（7.8 μg/kg）、头孢噻肟（10.2 μg/kg）等药物。
本研究采用通过固相萃取前处理，超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了猪肉、淡水鱼、虾中72 种兽药多残留快速检测方法。本方法使用通过固相萃取法这一快速、简便的前处理步骤，与标准方法及已有报道相比，可以省去了活化、淋洗、洗脱等传统固相萃取法中较为耗时的步骤，极大地节约了样品处理时间。经方法学验证，该方法测定低限、回收率、精密度均满足残留检测的要求，适用于猪肉、淡水鱼、虾等动物源性食品中十大类兽药的快速筛查测定。
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Simultaneous Determination of Multi-Veterinary Drug Residues in Animal-Origin Food by Solid Phase Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
HAO Jie1, JIANG Jie1,*, YU Jianlong2, LU Yong1, MAO Ting1, SUN Xiaodong1, YANG Limei1
(1. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring, Beijing 100041, China; 2. Waters Technology Co. Ltd., Beijing 100026, China)
Abstract：An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) with solid phase microextraction method was established for the simultaneous determination of 72 veterinary drugs including sulfanilamide, quinolone, glucocorticoid, macrolides, beta-agonist, steroid hormone, tetracycline, penicillin, chloramphenicol and beta-lactam in pork, fish and shrimp samples. Samples were extracted by 80% (V/V) acetonitrile in water, followed by cleanup of the extracts through a Prime HLB solid phase extraction column directly without activation. Separation was performed on a C18column and the eluates were detected by multiple reaction monitoring scanning with electronic spray ionization. An external standard method was applied for quantification. The limits of quantitation (LOQ) for 72 veterinary drugs were in the range of 0.5 to5 μg/kg. Recoveries from different food matrices were from 75.6% to 122.3% with relative standard deviations between 0.6% and 10.7%. This method was significantly efficient in the determination of multiple veterinary drugs and suitable for rapid multiresidual analysis of veterinary drugs in handling of food safety emergencies.
Key words：solid phase extraction; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); veterinary drug multiresidues; animal-derived food
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712041
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）12-0266-07
引文格式：郝杰, 姜洁, 余建龙, 等. 固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中多种兽药残留[J]. 食品科学, 2017, 38(12)： 266-272.
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712041. http：//www.spkx.net.cn
HAO Jie, JIANG Jie, YU Jianlong, et al. Simultaneous determination of multi-veterinary drug residues in animal-origin food by solid phase extraction coupled with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 266-272. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712041. http：//www. spkx.net.cn
收稿日期：2016-07-22
基金项目：北京市科技计划项目（Z161100000616007）
作者简介：郝杰（1984—），男，工程师，硕士，研究方向为食品安全。E-mail：haojiecrab@126.com
*通信作者：姜洁（1972—），女，教授级高级工程师，博士，研究方向为食品安全。E-mail：jybjj2004@126.com