QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法快速测定牛奶中18 种糖皮质激素类药物残留

（1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省食品安全重点实验室，河北石家庄 050200）

摘要：通过QuEChERS前处理方法，结合高效液相色谱-串联质谱多反应监测模式下的定性和定量分析，实现牛奶中18 种糖皮质激素的同时检测。牛奶样品加入酸化乙腈溶剂提取后，加入氯化钠和无水硫酸镁进行盐析，经PSA、C18吸附剂净化后，取上清液进行高效液相色谱-串联质谱分析。方法的基质效应影响在0.81～0.96之间，方法检出限在0.1～0.3 μg/kg之间，定量限在0.3～1.1 μg/kg之间，在0.5～100 ng/mL范围内呈线性关系，目标物线性相关系数（R2）均大于0.993 6，3 个水平加标回收率在73.7%～98.6%之间，精密度（n=5）在4.9%～12.9%之间。该方法简单快捷、准确可靠，适合于大批量牛奶样品中糖皮质激素的快速检测。

关键词：牛奶；QuEChERS；糖皮质激素；高效液相色谱-串联质谱

糖皮质激素又名“肾上腺皮质激素”，是由肾上腺皮质分泌的一类甾体激素，主要为皮质醇、多糖、脂肪和蛋白质等，在生物合成和代谢过程中具有较强的调节作用，还具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒、抗休克作用。在畜牧生产中，由于其对提高饲料转化率有显著作用进而促进禽畜和水生生物的生长繁殖而得到广泛使用。然而近年来因为生产者对其认识不清、应用原则掌握不严、市场监管不力等原因使其在畜牧生产过程中出现滥用。研究发现，糖皮质激素类药物在畜牧业中的过量使用导致的药物残留可引起肥胖、高血压、骨质疏松等疾病，危害消费者健康[1-7]。

目前，针对兽药残留监控的标准技术规范日益完善[8-10]。糖皮质激素检测手段主要有气相色谱法[11-12]、高效液相色谱法[13-17]、气相色谱-质谱法[18]和液相色谱-质谱法[19-23]。气相色谱法和高效液相色谱法的灵敏度低，选择性差。气相色谱-质谱法需要繁琐的衍生过程。高效液相色谱-质谱法因具有较高的灵敏度和特异性，已成为痕量药物分析的首选方法。但高效液相色谱-质谱法仍需要较好的净化效率来减少基质影响，以保证仪器的稳定性，传统的前处理方法比较耗时费力。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safety）法即为“快速、简易、廉价、有效、稳定、安全”的萃取方法。自诞生以来己经在农药残留分析中得到了广泛应用。在国内外研究者的探索过程中，将此方法应用范围扩大到兽药残留、发光剂等方面。史文景等[24]建立同时检测柑橘中4 种真菌毒素的QuEChERS-超高效液相色谱-质谱分析方法。张耀海等[25]运用QuEChERS前处理方法与气相色谱-串联质谱法得到软包装饮料中8 种光引发剂的测定方法。本实验建立牛奶中18 种激素类药物残留的高效液相色谱-串联质谱检测方法。使用QuEChERS前处理方法进行净化提取，简化实验前处理过程，提高实验效率。也可以为其他动物源性食品中的兽药多残留分析提供借鉴。

1 材料与方法

牛奶市购；乙腈、甲醇、甲酸（均为色谱纯）美国Sigma-Aldrich公司；糖皮质激素标准物质德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；N-丙基乙二胺（N-(n-propyl) ethylenediamine，PSA）（粒径40～60 μm）、C18（粒径50 μm）、NH2（粒径40～60 μm）吸附剂天津Agela Technologies公司；氯化钠、无水硫酸镁均为国产分析纯；实验所用水由美国Milli-Q超纯水系统纯化制得。

20A高效液相色谱仪日本岛津公司；5500 QTrap四极杆/离子阱质谱仪（配有电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），应用软件Analyst（1.6版本））美国AB SCIEX公司；3K-15型离心机美国Sigma公司；PT2100型均质器瑞士Kinematica公司；Milli-Q纯化系统美国Millipore公司。

取冷藏牛奶样品放置室温，称取待测牛奶样品5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL 1%甲酸-乙腈溶剂涡旋提取2 min，加入1 g氯化钠进行盐析，涡旋混合2 min，加入4 g无水硫酸镁、50 mg PSA与75 mg C18吸附剂净化后，以5 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液经0.22 µm微孔滤膜过滤后进样测定。

高效液相色谱分析柱为X B r i d g e B E H C18（100 mm×2.1 mm，2.5 µm）；流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0.1～2 min，30% B；2～7.5 min，80% B；7.5～8.5 min，80% B；8.5～12 min，30% B。流速0.25 mL/min；进样量2 μL。

ESI正离子扫描；多反应监测（multi-reaction monitoring，MRM）模式；离子源温度500 ℃；离子源电压5 000 V；雾化气压力345 kPa；气帘气压力241 kPa；辅助加热气压力345 kPa；碰撞气Medium且均为高纯氮气。MRM检测离子对、去簇电压及碰撞电压见表1。

表1 18 种糖皮质激素的质谱优化条件
Table1 Optimized mass spectrometric parameters for18 glucocorticoids

注：*.子离子为定量离子。

2 结果与分析

由于糖皮质激素的疏水性，实验选择常用的提取溶剂乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙醚作为提取效果对比实验。结果表明，乙腈、甲醇与牛奶中水互溶，仪器响应表明乙腈提取效果比甲醇好；正己烷和乙醚不分层，提取液中杂质较多，仪器响应值不理想；乙酸乙酯不与水互溶，需要多次富集之后浓缩待用，实验操作复杂。所以实验采用乙腈作为提取溶剂。

在乙腈中加入适量的酸有利于对牛奶样品中蛋白质的沉淀[26]，配制体积分数0.5%、1%、2%、4%、6%的甲酸-乙腈溶液作为提取溶剂。如图1所示，1%甲酸-乙腈溶液提取效果最好，糖皮质激素类药物的回收率较高，实验过程中添加较多酸的乙腈溶液提取剂再进一步净化中易与净化剂结合从而降低回收率。

常用的吸附剂有PSA、C18、石墨化碳等[27-31]。牛奶中富含脂肪、糖类和蛋白质等成分，根据牛奶的基质特点，本实验选取了PSA、C18、NH23 种吸附剂作为实验考察对象，如图2所示，经过NH2吸附剂净化的样品复溶过膜后仍呈现混浊状态，很容易对仪器造成污染，C18净化后基质效应降低，且回收率都在80%左右，PSA进行净化后基质效应也有明显改观，实验将PSA、C182 种吸附剂同时运用到前处理发现，50 mg PSA与75 mg C18吸附剂的组合时基质干扰小，且目标化合物的回收率更接近100%，过多的吸附剂可以吸附目标化合物使回收率降低。

18 种糖皮质激素中有2 对同分异构体，分别为泼尼松龙和可的松、地塞米松和倍他米松，因精确分子质量均相同，若要准确定量这些化合物，色谱峰要有一定程度的分离。实验考察了甲醇、乙腈、0.1%甲酸溶液、0.2%甲酸溶液作为流动相，运用不同的梯度，在XBridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）色谱柱上进行色谱分离，结果运用甲醇不能够分开地塞米松和倍他米松，0.1%甲酸溶液的响应要稍高于0.2%甲酸溶液。因此，方法选择0.1%甲酸和乙腈为流动相。优化液相色谱条件测定样品如图3所示。

糖皮质激素在质谱的行为较为复杂，在ESI－可产生[M－H]－、[M+CH3COO]－和[M+HCOO]－的负离子，在ESI+可产生[M+H]+的正离子。在负离子扫描模式下，若流动相含有甲酸或甲酸铵则以[M+HCOO]－为主，若含有乙酸根则以[M+CH3COO]－为主，若两者都没有则以[M－H]－为主，实验发现负离子扫描模式稳定较[M+H]+差。所以方法采用正离子扫描模式。本研究对每种目标物质进行质谱条件的优化，使实验的定量分析更加稳定有效。首先将每种目标物的标准溶液（100 ng/mL），使用针泵流动注射直接进样进行质谱分析，确定其母离子和子离子，为了使每种目标物质的灵敏度达到最佳，在针泵进样过程中需要优化碎裂电压、碰撞电压等仪器参数。每种分析物要选择最强且稳定的离子作为定量离子，另一个则为定量离子。

方法采用MRM模式，提取偏差在±0.005‰范围内的精确质荷比的色谱图进行定量，加上色谱保留时间，方法的特异性高，没有发现有干扰成分影响18 种糖皮质激素的测定。在空白样品和空白样品添加的色谱质谱图中未发现干扰峰，说明方法具有较好的选择性。

表2 方法的线性、基质效应、LOD 和 LOQ
Table2 Linearity, matrix effect, LOD and LOQ of the method

对前处理净化方法的基质效应进行评价，如表2所示，其中倍氯米松、氟米龙的基质效应最强，为0.96，其余均在0.81到0.96之间。从回收率和精密度结果来看，虽然18 种糖皮质激素均有一定的基质效应影响，但并不影响测定的准确性。文献[32-34]研究基质效应在0.80～1.20之间可以不考虑基质效应的影响。

用18 种糖皮质激素的混合定溶液配成系列标准工作溶液，用分析物峰面积与被测组分的质量浓度作图，方法在0.5～100 ng/mL呈线性关系，其线性相关系数（R2）高于0.993 6。以3 倍和10 倍信噪比确定了方法的检出限和定量限，18 种分析物的定量限在0.3～1.1 μg/kg之间。

在3 个水平做了添加回收率实验，考察了方法的准确度和精密度，如表3所示，回收率在73.7%～98.6%之间，精密度在4.9%～12.9%之间。方法具有较好的准确度和精密度。

表3 方法的回收率和精密度（ = 5）
Table3 Recovery and precision of the method ( = 5)

用实验建立方法检测12 种不同品牌的市售牛奶，如图4所示，在其中1 种牛奶中含有微量的氢化可的松，其余批次的牛奶未发现其他种类的兽药残留。

3 结论

通过优化对比实验，探讨提取净化等QuEChERS前处理条件，考察牛奶样品的基质效应，优化QuEChERS前处理条件和质谱条件，研究方法的回收率、检出限和定量限等技术指标，实现了牛奶样品中18 种糖皮质激素的同时检测。实验结果表明，该方法简单快捷、准确可靠，适合于市售牛奶样品中糖皮质激素的快速检测。

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Rapid Determination of18 Glucocorticoids in Milk Using QuEChERS Coupled with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

TIAN Haiwei1,2, FENG Haobin2, LI Jin1, LI Lili1, LI Hui2, HA Jing1,*
(1. College of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Hebei Food Safety Key Laboratory, Shijiazhuang 050200, China)

Abstract：A simple, rapid and sensitive method for the simultaneous determination of18 kinds of glucocorticoids in milk was developed by the quick, easy, cheap, effective, rugged and safe (QuEChERS) method coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. Milk samples were extracted with acidified acetonitrile, and salted out by adding sodium chloride anhydrous sodium magnesium sulfate. After purification with PSA and C18as the adsorbent, the supernatant was analyzed by HPLC-MS/MS. The matrix effect in the method was in the range of 0.81-0.96, the limits of detection (LODs) were in the range of 0.1-0.3 μg/kg and the limits of quantification (LOQs) for the analytes were in range of 0.3-1.1 μg/kg. The method exhibited a good linear relationship in the range of 0.5-100 ng/mL, with a correlation coefficient (R2) of higher than 0.993 6, and recoveries were between 73.7% and 98.6% at three spiked levels with relative standard deviations (n = 5) of 4.9%-12.9%. This method was simple, accurate, reliable, and suitable for the rapid detection of glucocorticoids in bulk serum samples.

Key words：milk; QuEChERS; glucocorticoids; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLCMS/MS)

引文格式：田海伟, 冯浩彬, 李晋, 等. QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法快速测定牛奶中18 种糖皮质激素类药物残留[J].食品科学, 2017, 38(12)： 310-314.

TIAN Haiwei, FENG Haobin, LI Jin, et al. Rapid determination of18 glucocorticoids in milk using QuEChERS coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 310-314. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712048. http：//www.spkx.net.cn

基金项目：河北省科技计划项目（15275505D）；北京市重点实验室开放课题（BKBD-2016KF（01））

作者简介：田海伟（1988—），女，硕士研究生，研究方向为药物多残留分析。E-mail：15511371395@163.com

*通信作者：哈婧（1970—），女，教授，博士，研究方向为分析化学。E-mail：hajing02@163.com

QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法快速测定牛奶中18 种糖皮质激素类药物残留

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论