衰减全反射-傅里叶变换红外光谱法对花生仁霉变的分析

（1.南京林业大学机械电子工程学院，江苏南京 210037；2.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京 210046）

摘要：为快速检测贮藏花生的质量安全，对灭菌后的新鲜花生仁样品分别接种5 种常见的有害霉菌，并于26 ℃、相对湿度80%条件下贮藏9 d。利用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）采集不同贮藏阶段花生样品在4 000～600 cm－1的光谱信息，通过权重分析阐述花生中侵染霉菌后光谱特征的变化，并结合偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析建立样品有害霉菌污染的定量分析模型。结果表明，不同贮藏阶段样品的峰谱出现明显波动，PLSR模型对单一菌株与多种菌株样品菌落总数的预测精度较高，其中对赭曲霉3.6486处理组样品预测模型相对偏优，有效决定系数（R2p）为0.915 7、交互验证均方根误差（root mean-square error of cross-validation，RMSECV）为0.208 0（lg（CFU/g））、剩余预测偏差（residual predictive deviation，RPD）为2.52；对多种菌株预测结果R2p、RMSECV、RPD分别为0.780 3、0.358 0（lg（CFU/g））与1.76。应用ATR-FTIR技术对花生受霉菌侵染的状况进行快速分析具有可行性。

关键词：衰减全反射-傅里叶变换红外光谱；花生仁；有害霉菌；快速检测

自然界中广泛存在多种霉菌，易侵染贮藏期的农副产品，从而造成严重的经济损失，带来食品安全问题。许多学者着手对霉菌进行研究，发现曲霉属真菌易感染油类种子[1]如花生等，赭曲霉易感染贮藏期间的食物与谷物[2]。霉菌通过消耗农副产品中的营养并代谢产生霉菌毒素，从而严重危害人类与动物的健康。花生生长于地下，在丰收期过程中，它易携带土壤中存在的霉菌，如黄曲霉与寄生曲霉等[3]。在贮藏期间，由于温度、湿度的改变，花生也极易发现霉变。食品中霉菌毒素的现有的检测方法主要有生物学方法、免疫学方法[4]和化学仪器分析法。有学者采用了薄层色谱法[5-6]、高效液相色谱法[7-8]与酶联免疫吸附法[9-10]等检测了花生霉变。这些方法检测精度高，但存在操作繁琐、时效性差及成本高等不足。因此，亟需建立一种快速、准确及便捷的方法检测花生霉变程度。

衰减全反射-傅里叶红外光谱技术（attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy，ATRFTIR）可快速检测样品中光谱指纹特征，反映整个细胞中的分子振动特征[11]。它已成功用于检测食用油中反式脂肪酸含量[12]、水果中蔗糖含量[13]、农业环境中霉菌种类[14]、微生物及病毒分析[15]等多方面研究。在花生研究方面，Mirghani等[16]采用FTIR对购买花生中黄曲霉毒素含量（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2）进行分析，通过偏最小二乘回归分析（partial least square regression，PLSR）方法进行定量预测，其预测决定系数（R2）均超过0.97。姜科声等[17]采用FTIR对7 种不同花生种子之间及花生烘烤前后状态进行区分。Kaya-Celiker等[18]应用ATR-FTIR对霉变花生进行检测，通过对霉变花生中掺入洁净花生，使花生呈现不同霉变状态，结合PLSR方法预测花生中黄曲霉毒素含量，从而判断花生霉变程度，其有效决定系数（R2）达到0.99。综上可知，应用傅里叶红外光谱技术检测花生霉变的研究较早，但是对贮藏期间花生霉变程度以及对花生中菌落总数和霉菌感染的种类研究较少。

本实验采用ATR-FTIR技术对花生仁中5 种微量有害霉菌进行鉴别，利用不同贮藏阶段样品的指纹光谱信息，结合权重分析花生中侵染霉菌后光谱特征的变化，并运用PLSR对花生中菌落总数含量进行预测，为实现贮藏期间花生的质量安全进行监控提供相关依据。

1 材料与方法

花生仁样品选购于南京当地超市，挑选表面没有破损、发霉及发芽且大小均一的样品，通过60Co强辐射（15 kGy）灭菌后，装入无菌塑料密封袋中，置于4 ℃环境下，待用。

黄曲霉（Aspergillus flavus）3.17、黄曲霉（Aspergillus flavus）3.3950、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）3.395、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）3.0124与赭曲霉（Aspergillus ochraceus）3.64865 种霉菌均选购于中国北京北纳创联研究所，于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基上培养。使用时，运用无菌塑料接种环将霉菌分生孢子接种至PDA培养基上26 ℃、80%相对湿度条件下活化培养7 d，运用无菌水冲洗分生孢子，通过平板计数方法调整无菌水调节孢子悬浮液浓度至105CFU/mL，待用。

Tensor 27型傅里叶变换红外光谱仪德国Bruker公司；ZnSe衰减全反射附件美国Pike公司；GNP_9160型隔水式恒温培养箱上海三发科学仪器有限公司；SW_ CJ_1F型单人双面净化工作台苏州净化设备有限公司；TP_214分析天平（精度0.0001 g）丹佛仪器（北京）有限公司；FW_200型高速万能粉碎机北京中兴伟业仪器有限公司。

称取每份质量约50 g的灭菌花生仁120 份，分成5 组，每组24 份。用移液器分别移取10 μL孢子悬浮液接种于每份花生仁表面，每组接种同一种霉菌，并在26 ℃、相对湿度80%条件下，贮藏9 d。期间，每隔3 d从每组中各取6 份样品用于实验分析。其中，第0天花生样品设为对照组，样品装入无菌密封袋中。为使花生中霉菌及其代谢产物分配更加均匀，采用高速万能粉碎机将花生磨成糊状，并置于4 ℃环境下，待用。

在样品扫描前，将冷藏花生糊置于室温（23±1） ℃条件下2 h直至样品达到室温。采用FTIR及ATR附件扫描霉变花生糊样品的光谱信息，ATR数据从配有ZnSe晶体的变角衰减全反射附件获取，光线入射角为45°，样品测量时，将花生糊均匀涂覆在ZnSe晶体的凹槽中，即可进行红外扫描，测量结束后使用无菌毛巾擦拭干净，再利用70%乙醇溶液擦洗ZnSe晶体，待ZnSe晶体表面乙醇完全挥发后进行下一次测量，为了防止花生样品在检测出油而影响实验结果，并不使用压力锤，同时以空气为背景对样品进行检测，每测一个样品前，均进行一次背景扫描。扫描波数范围为4 000～600 cm－1，分辨率4 cm－1，扫描64 次[19]，每份花生糊扫描3 次，取平均值作为花生光谱数据。

参照GB/T 4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》[20]进行操作。

数据处理软件采用TQ Analyst v6.2.1（Thermo Electron公司，美国）软件。PLSR是一种强有力多变量统计分析工具，对样品中菌落总数含量进行定量分析。将已获取花生光谱数据作为自变量，菌落总数作为因变量，其中取2/3样品作为建模集，1/3作为预测集。为了去除光谱中高频随机噪声、基线漂移等带来的误差，采用标准正态变换、Savitzky-Golay[21]（13 点与3 次多项式平滑过滤）的预处理方法。在模型评价方面，主要考察有效决定系数（R2）、建模集均方根误差（root meansquared error o f calibration，RMSEC）、预测集均方根误差（root mean-squared error of prediction，RMSEP）、交互验证均方根误差（root mean-squared error of cross validation，RMSECV）和剩余预测偏差（residual predictive deviation，RPD）等统计量。其中RPD为标准偏差与预测均方根误差的比值。

2 结果与分析

运用ATR-FTIR收集霉变花生的光谱信息，贮藏期间花生中菌落总数的增加及代谢产物排出，引起花生光谱中分子键的改变。由图1可以看出，4 000～1 800 cm－1波数范围内不同种类霉菌的光谱差异较小，在3 600～3 100 cm－1和1 700～1 500 cm－1波数范围内由霉菌中蛋白质成分（主要为酰胺A、酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ）引起；在3 050～2 750 cm－1和1 500～1 300 cm－1波数范围内由脂肪与蛋白质吸收键的形变振动引起；在2 750～1 800 cm－1波数范围内的光谱变化较为平缓，但仍有部分噪声波动，这是由于花生样品放置于ATR附件上测量时ZnSe晶体表面反射所引起的；在900～600 cm－1波数范围内波动主要由芳香环振动引起。因此，本实验主要对1 800～900 cm－1指纹区域的光谱进行研究。

图1 5 种霉变花生的ATR-FTIR原始平均光谱图
Fig.1 Averaged raw ATR-FTIR spectra of peanuts infected with five different fungal species

图2 5 种霉变花生前3 个主成分权重光谱
Fig.2 Spectra of first three principal components for peanut samples infected with five different fungal species

表1 ATR-FTIR光谱区的功能团特性[22-25]
Table1 Functional groups identified from ATR-FTIR spectra[22-25]

为了进一步分析样品光谱特性，对所有样品前3 个主成分进行权重分析，结果如图2所示，同时表1列出霉变花生中化学键变化波段及振动方式。观察可知，第1主成分的最高权重位于1 743 cm－1与1 460 cm－1处，由于酮类及脂肪引起。第2主成分的最高权重位于1 726、1 378、1 131 cm－1以及1 088 cm－1处，主要由于脂肪、酯类及多糖引起。第3主成分的最高权重位于1 650、1 543、1 238 cm－1及1 160 cm－1处，主要由于蛋白质、磷酸盐及多糖引起。花生霉变期间，蛋白质、脂肪与多糖等为霉菌生长提供主要营养[26]，在1 743 cm－1处由于花生中黄曲霉毒素G酮类的C＝O基团的伸缩振动引起，同时花生中甘油三酸酯的羰基也出现伸缩振动，随着脂肪被水解，脂肪酸含量增加，1 726 cm－1附近存在较强的峰谱。在1 695～1 543 cm－1光谱区由于蛋白质（酰胺：amideⅠ和amideⅡ）中C＝O、C—N基团的伸缩振动引起，在1 460 cm－1与1 378 cm－1处由于脂肪中甲基与亚甲基的C—H基团出现振动引起，在1 200～900 cm－1之间主要由多糖引起，随着花生样品霉变程度的加深，在1 131、1 088 cm－1处酯类的C＝O基团出现伸缩振动。因此，随着花生霉变侵染程度的加深，花生中营养物质逐渐被消耗，样品的光谱信息也随之改变。

谷物中侵染有害霉菌，并在适宜温度、湿度条件下培养，谷物中的毒素含量与菌落总数均会随之增加[27]。本实验对无菌花生表面侵染5 种有害霉菌，并在26 ℃、相对湿度80%环境条件下贮藏9 d，对不同贮藏时间花生的菌落总数进行测定，5 种霉变花生的菌落总数范围均分布于在2～4.5（lg（CFU/g））之间，即样品的霉变程度不断加深。本实验依据菌落总数的变化将花生分成健康（低于2.7（lg（CFU/g）））、霉变（2.7～4（lg（CFU/g）））和重度霉变（高于4（lg（CFU/g）））[28]。图3显示：贮藏9 d期间5 种霉变花生中菌落总数的变化，可以发现随着贮藏时间的延长，花生中菌落总数均逐渐增长。在前3 d时，除赭曲霉3.6486组已经达到霉变状态外，其他样品霉菌生长均较为平缓；到第6天时，黄曲霉3.3950和赭曲霉3.6486组滋生相对较为缓慢，剩余3 组增长速度明显较快。其中，黄曲霉3.3950组仍处于健康状态，其余4 组均已达到霉变状态；到第9天时，寄生曲霉3.395与寄生曲霉3.0124组滋生速度开始放缓，而黄曲霉3.3950组增长速度加快，达到霉变状态。黄曲霉3.17与赭曲霉3.6486组菌落总数均已超过4.0（lg（CFU/g）），已达到重度霉变。综上，对无菌花生表面侵染5 种有害霉菌并贮藏9 d，花生中脂肪、蛋白质与碳水化合物等相继被消耗，菌落总数随之增加，即花生霉变程度加深，从而引起花生的特征谱带强度和位置的变化。

图3 5 种霉变花生中菌落总数随时间的变化
Fig.3 Changes in total number of molds in contaminated peanut samples during storage

表2 花生中侵染5 种霉菌PLSR分析结果
Table2 PLSR regression statistics of five fungal species in infected peanut sammpplleess

利用PLSR对花生中菌落总数进行预测，从而判断花生的霉变程度，结果如表2所示。对单一霉菌进行建模时，可以得到较高的有效决定系数（R2）与较低的建模RMSEC，其中赭曲霉3.6486处理组建立模型相对最优，即R2值为0.998 3，RMSEC为0.024 6（lg（CFU/g）），对单一霉菌进行留一交互验证时，所得到RMSECV也偏低，其中黄曲霉3.17处理组的RMSECV值最大，为0.409 0（lg（CFU/g）），赭曲霉3.6486处理组的RMSECV值偏小，为0.208 0（lg（CFU/g）），而进行交互验证时，RMSECV值的大小由PLS因子所决定[29]。对单一霉菌进行预测时，同样得到较高的R2值与较低的预测RMSEP，RPD反映模型的预测分析能力，当RPD不小于3时，表明该模型的预测精度较优，鲁棒性好，可用于实际分析；当大于等于2且小于3时，表明该模型的具有定性分析的潜力，该模型的鲁棒性有待提高；当大于等于1.5且小于2时，表明该模型可用于定性分析[30]。可以看出黄曲霉3.3950处理组R2值相对最小，为0.723 1，而RMSEP值最低，为0.244 0（lg（CFU/g）），赭曲霉3.6486处理组的R2值相对最高，为0.915 7，RMSEP值已低于0.3，除了赭曲霉3.6486处理组RPD值为2.52，其余4组的RPD均低于2。综上对比，对单一霉菌进行预测时，赭曲霉3.6486处理组得到结果相对最优，Rp2、RMSECV与RPD值分别为0.915 7、0.208 0（lg（CFU/g））与2.52。

对花生侵染5 种霉菌的光谱信息建立PLSR预测分析模型，如图4所示，共有120 个样品用于建模，通过计算光谱数据中心平均值与一阶微分排除4 个异常样品，其中79 个样品作为建模集，37 个样品作为预测集。所有样品均分布于中心线两侧，进行PLSR建模时，共计11 个因子用于建模计算，预测集Rp2、RMSECV与RPD值分别为0.780 3、0.358 0（lg（CFU/g））与1.76。结果表明，采用PLSR预测花生样品菌落总数含量，从而判断花生霉变状态具有可行性。

图4 多种霉菌感染花生后预测集模型
Fig.4 Predictive model for total fungal species in infected peanut samples

3 结论

本实验应用ATR-FTIR技术对灭菌花生样品中侵染5 种有害霉菌，并呈现出不同霉变程度的研究。花生与霉菌均具有复杂结构，通过权重分析发现，花生的霉变程度在不断加深时，花生中脂肪、蛋白质与多糖等成分的特征谱带均呈现一定程度的波动。运用PLSR分析对花生中菌落总数进行预测，预测集结果Rp2、RMSECV与RPD值分别为0.780 3、0.358 0（lg（CFU/g））与1.76。结果表明ATR-FTIR技术作为一种快速、便捷的方式对贮藏期间的花生进行检测，判断花生是否发现霉变具有可行性。

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Analysis of Moldy Peanut Kernel by Attenuated Total Reflectance-Fourier Transform Infrared Infrared Spectroscopy

JIANG Xuesong1, LIU Peng1, SHEN Fei2, ZHOU Hongping1, CHEN Qing1
(1. College of Mechanical and Electronic Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210046, China)

Abstract：Peanut products are susceptible to changes in temperature and relative humidity (RH) during storage. Peanuts are easily infected by hazardous fungal species, producing a variety of potent mycotoxins. This study aimed to develop a method for the rapid detection of moldy peanuts. Firstly, clean and fresh peanut kernels were sterilized and inoculated individually with fi ve common hazardous fungal species. Then, the samples were stored at 26 ℃ and 80% RH for9 days. During this period, spectral information of the peanut samples in the wave number range of4 000 to 600 cm-1were collected using attenuated total re fl ectance-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR). The spectral changes of peanut samples infected with different fungal species were analyzed by loading analysis. A quantitative model to predict contamination levels of hazardous fungi in peanut samples was developed by partial least squares regression (PLSR). The results showed that the spectral alterations for the samples were clearly fl uctuated during different storage periods. The PLSR model could predict the total number of colonies of single and multiple strains in fungus-infected peanut samples with good accuracy. Especially, the model provided better prediction of Aspergillus ochraceus 3.6486 infection with a coef fi cient of determination for the prediction set (Rp2) of 0.915 7, a root mean-square error of cross-validation (RMSECV) of 0.208 0 (lg (CFU/g)) and a residual predictive deviation (RPD) of 2.52. The R2p, RMSECV and RPD values of the prediction model for total fungal species were 0.780 3, 0.358 0 (lg (CFU/g)) and 1.76, respectively. These fi ndings demonstrated that ATR-FTIR could be used as a reliable analytical method for rapid determination of fungal contamination levels in peanuts during storage.

Key words：attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR); peanut kernel; hazardous fungi; rapid detection

中图分类号：中图分类号：TS255.7；O657.33 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2017）12-0315-06

基金项目：南京林业大学青年科技创新基金项目（CX2015010）；江苏省高校优秀中青年教师和校长境外研修资助项目（苏教办师〔2015〕7号）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2014BAD08B04）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

作者简介：蒋雪松（1979—），男，副教授，博士，研究方向为生物传感器技术。E-mail：xsjiang@126.com

引文格式：蒋雪松, 刘鹏, 沈飞, 等. 衰减全反射-傅里叶变换红外光谱法对花生仁霉变的分析[J]. 食品科学, 2017, 38(12)： 315-320.

JIANG Xuesong, LIU Peng, SHEN Fei, et al. Analysis of moldy peanut kernel by attenuated total reflectance-Fourier transform infrared infrared spectroscopy[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 315-320. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712049. http：//www.spkx.net.cn

衰减全反射-傅里叶变换红外光谱法对花生仁霉变的分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论