李秋慧，齐宝坤，王海晴，李 红，江连洲，李 杨，隋晓楠*
（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150000）
摘 要：通过不同酶解时间得到大豆溶血磷脂，对大豆分离蛋白-溶血磷脂相互作用及其对复合乳化体系乳化特性的影响进行探究，采用荧光光谱法在Stern-Volmer和Van’t Hoff方程基础上对大豆分离蛋白-溶血磷脂荧光猝灭作用、相互结合常数、结合位点及相互作用力类型进行判断，并对复合乳化体系分别进行乳化活性、乳化稳定性的测定及微观结构变化的观察。结果表明：随着磷脂酶A1酶解时间的延长，大豆分离蛋白-溶血磷脂相互作用先增强后下降，乳化特性指标同样基本呈现先升高后降低的趋势，这表明二者的相互作用对乳化特性具有一定影响。其中，当酶解时间为4 h时，二者相互作用最强，乳液的乳化特性表现最佳，这表明适度酶解产生的溶血磷脂会促进其与大豆分离蛋白的相互作用，在水油界面上形成较稳定的界面膜，形成稳定的复合乳状液。
关键词：大豆分离蛋白；溶血磷脂；相互作用；乳化特性
大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）在食品加工领域中应用广泛，其中乳化性又是较为重要的功能特性之一，工业生产中常常通过添加大豆分离蛋白提高产品乳化特性，然而单一的天然大豆蛋白并不能很好地满足现代工业对乳化剂的要求，所以人们往往向蛋白中添加天然小分子物质如磷脂、糖类、多酚等[1-2]。大豆溶血磷脂（lysophospholipids，LPC）是既具有普通磷脂的双亲两性结构，又由于非极性基团的减少而增强了亲水性能的一种纯天然、高营养乳化剂。因此，溶血磷脂除了拥有普通磷脂的优良乳化特性外，更在一定程度上改善了由于亲水亲油平衡值（hydrophile-lipophile balance number，HLB）偏低导致普通磷脂应用范围受限的状况[3]。国内外有学者研究表明由于磷脂及溶血磷脂结构中同时具有亲水基团和亲油基团可以添加到不同蛋白当中增强食品的乳化活性及乳化稳定性，其二者通过相互作用形成的复合体系更有利于维持乳液的贮存稳定性，延长货架期，但目前的研究对溶血磷脂与蛋白的相互作用机理及二者相互作用对乳液乳化特性的影响规律尚不清楚[4-8]。
因此，本研究在前期研究基础上采用磷脂酶A1自制溶血磷脂，再将一定量溶血磷脂与大豆分离蛋白共建复合乳化体系，在Stern-Volmer和Van’t Hoff公式基础上，通过荧光光谱法对大豆分离蛋白-溶血磷脂猝灭类型、结合常数、结合位点数、相互作用力方式进行判断，并对二者相互作用对复合乳化体系的乳化活性、乳化稳定性的影响规律进行分析，同时通过激光共聚焦显微镜对乳状液的微观结构进行观察，为天然复合乳液的工业生产应用提供理论依据。
1.1 材料与试剂
脱脂豆粕 哈尔滨高科技股份有限公司；溶血磷脂本课题组自制；磷脂酶A1（活力8 900 U/mL） 诺维信生物技术有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美国Sigma公司；尼罗红、尼罗兰哈尔滨四叶草试剂有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
磁力搅拌器 广州仪科实验仪器有限公司；Allegra64R台式高速冷冻离心机 美国贝克曼公司；SFD5-3型冷冻干燥机 美国SIM公司；T18 basic高速乳化均质机 英国IKA公司；LS-55荧光分光光度计 美国PE公司；TU-1800紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；激光共聚焦显微镜 汇佳生物股份（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 大豆分离蛋白的制备
参考Molina等[9]的方法并稍加修改，将质量比1∶10脱脂豆粕与水混合，加入浓度为2 mol/L NaOH溶液调节pH值至8.0，磁力搅拌1 h，4 ℃、4 000×g离心30 min。取上清液加入1 mol/L的HCl溶液调节pH值至大豆蛋白等电点4.5，搅拌1 h后室温静置15 min。在4 ℃、6 000×g离心30 min，取沉淀用去离子水洗涤3 次，再将沉淀溶于水中加入1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7，再次4 ℃、6 000×g离心30 min，过滤取蛋白质溶液，进行冷冻干燥得大豆分离蛋白粉末。经凯氏定氮仪测得蛋白含量为90.08%（氮溶解指数为6.25）。
1.3.2 溶血磷脂的制备
参考杜章斌等[10]的方法并稍加修改，准确称取大豆粉末磷脂加入75 mL、pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液，再依次加入磷脂酶A1（按磷脂质量的5%）、150 mmol/L CaCl2溶液（按磷脂质量的0.1%），将其密封，40 ℃水浴恒温振荡条件下分别酶解反应2、4、6、8 h，90 ℃灭酶30 min。然后加入冷丙酮，用玻璃搅拌脱脂后4 000×g离心15 min，如此进行反复脱脂，将样品进行抽真空脱溶，溶液快速挥干即得溶血磷脂。
1.3.3 大豆分离蛋白-溶血磷脂的制备
参考李杨等[11]的方法，精确称取大豆分离蛋白和磷脂及磷脂酶解产物（质量比为10∶1）样品，溶解于浓度为0.1 mol/L pH 7的磷酸盐缓冲溶液中，1 000 r/min室温搅拌溶液1 h。其中样品分别为1号：大豆分离蛋白-磷脂（SPI-Lec）、2号：大豆分离蛋白-2 h磷脂酶解产物（SPI-2 h LPC）、3号：大豆分离蛋白-4 h磷脂酶解产物（SPI-4 h LPC）、4号：大豆分离蛋白-6 h磷脂酶解产物（SPI-6 h LPC）、5号：大豆分离蛋白-8h磷脂酶解产物（SPI-8 h LPC）。
1.3.4 内源荧光光谱的测定
参考Li Jufang等[12]的方法，将配制好的20 mg/mL SPI用pH 7.2、0.02 mol/L Tris-HCl溶液稀释100 倍，取稀释后的溶液蛋白溶液置于1 cm石英比色皿中，以l0 µL为单位逐次加入配制好的磷脂和磷脂经酶解2、4、6、8 h制得的溶血磷脂，二者充分混匀。以280 nm为激发波长，记录300～500 nm波长范围内的荧光光谱。
1.3.5 大豆分离蛋白-溶血磷脂猝灭类型、结合位点数、作用力类型的测定
样品荧光强度的测定：5 mL大豆分离蛋白溶液置于15 mL试管中，再分别加入5、4、3、2、1、0 mL磷脂及不同酶解时间磷脂酶解产物（溶血磷脂）样品溶液，和0、1、2、3、4、5 mL pH 7.2、0.02 mol/L磷酸盐缓冲溶液，分别配制3 组相同溶液，并于298、308、318 K水浴锅中水浴15 min。取样品溶液于1 cm石英比色皿中，设置荧光激发波长为280 nm，扫描300～500 nm波长范围的荧光光谱，激发和发射光谱谱带宽均为l0 nm，记录340 mn波长处的荧光强度，每次读数在10 次以上，求取平均值，对应相同浓度，用样品测定值减去空白值（空白值在相同条件下未添加样品的荧光强度测定值）得到样品的实际荧光强度。
1.3.6 乳化特性的测定
取9 mL搅拌均匀的大豆分离蛋白-溶血磷脂复合体系与3 mL葵花籽油混合搅拌，预乳化后倒入25 mL烧杯中，用高速乳化均质机在20 000 r/min条件下乳化1 min，制备乳液及空白对照样品。参考Comas等[13]的方法。将均质的乳状液用质量分数为0.1%的SDS溶液稀释到确定倍数，在500 nm波长处用紫外分光光度计测定吸光度，按式（1）计算乳化活性指数（emulsion activity index，EAI）。静置30 min后测定吸光度，按式（2）计算乳化稳定性指数（emulsion stability index，ESI）。
式中：N为稀释倍数（250）；ρ为乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质质量浓度/（g/mL）；φ为乳化液中油相体积分数/%；A0为0 min时的吸光度；A30为30 min时的吸光度。
1.3.7 乳液微观结构观察
乳液中油滴的分布状态采用激光共聚焦显微镜进行观察，将新制备的乳状液使用尼罗红及尼罗兰染色剂分别染色30 min后，在激发波长488 nm 和633 nm条件下放大40 倍观察油滴分布及微观结构，标尺采用20 µm进行标注。
1.4 数据统计分析
每个实验均重复3 次，采用ANOVA进行误差分析，并用Origin 8.5和Excel软件统计分析数据并作图。
2.1 溶血磷脂对大豆分离蛋白内源荧光的猝灭作用
图1 大豆分离蛋白-溶血磷脂内源荧光的猝灭作用
Fig. 1 Fluorescence quenching of SPl by LP
图1 表示猝灭剂（磷脂及不同酶解时间条件下产生的溶血磷脂）对大豆分离蛋白内源荧光的猝灭作用。Ishita等[14]指出蛋白质的内源荧光主要依赖于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）在固定激发波长处发射的荧光，其中苯丙氨酸的荧光可以忽略不计。由图1A～E可知，当磷脂与溶血磷脂加入到大豆分离蛋白中时，均会出现较为明显的荧光猝灭现象，且随着猝灭剂质量浓度的增大，大豆分离蛋白的荧光强度逐渐降低，这表明磷脂及溶血磷脂均对大豆分离蛋白产生了一定的猝灭作用。另外，大豆分离蛋白的最大荧光发射波长发生了轻微的红移现象，这很有可能是由于亲水性较强的溶血磷脂的加入导致大豆分离蛋白所处的微环境发生变化，向亲水环境进行转变[15]。从图1中可明显观察到5 种样品的猝灭效果呈现先增强后减弱的趋势，其中经磷脂酶酶解4 h后产生的溶血磷脂对大豆分离蛋白产生的猝灭作用最强，而经磷脂酶酶解8 h后产生的溶血磷脂对大豆分离蛋白产生的猝灭作用最弱，这表明不同酶解时间产生的溶血磷脂量不同，适量的溶血磷脂可与蛋白形成较好的相互作用，而当酶解时间过长，相互作用有减弱的趋势，这可能与酶解途中磷脂的酰基转移现象有关[16]。
2.2 大豆分离蛋白-溶血磷脂的猝灭方式
由图1还可判断出磷脂及溶血磷脂的加入均可对大豆分离蛋白产生荧光猝灭作用，Xiang Yanling等[17]指出猝灭方式可分为动态猝灭和静态猝灭两种方式。其中动态猝灭过程中，蛋白质的猝灭常数会随着温度的升高而上升，然而静态猝灭过程中，蛋白质的猝灭常数会随着温度的升高而下降。因此，本实验采用荧光光谱法对5 种样品的猝灭方式进行测定。根据Stern-Volmer方程，以（F0－F）/F对猝灭剂浓度[Q]作Stern-Volmer曲线拟合，所得拟合斜率即为猝灭常数，Stern-Volmer公式如下：
式中：F0为未加入猝灭剂时蛋白质的荧光强度；F为加入猝灭剂后蛋白质的荧光强度；[Q]为猝灭剂的浓度/（mol/L）；Ksv为Stern-Volmer方程中猝灭常数。
图2 不同温度条件下溶血磷脂对大豆分离蛋白荧光猝灭的Stern-Volmer图
Fig. 2 Stern-Volmer curves of SPI fluorescence quenching by LP at different temperatures
表1 不同温度条件下Stern-Volmer猝灭常数
Table 1 Stern-Volmer fluorescence quenching constants at different temperatures
图2A～E为5 种样品在不同温度下对Stern-Volmer的曲线拟合，由图2可知，5 种样品曲线的斜率均随温度的升高而减小，这表明猝灭常数Ksv随温度的升高而减小，因此可以判断磷脂以及经磷脂酶酶解产生的溶血磷脂对大豆分离蛋白的猝灭均为静态猝灭过程。Basu等[18]研究指出静态猝灭过程中猝灭剂与蛋白质在基态状态下可生成复合物，使蛋白质荧光强度降低，二者的相互作用会对蛋白质二级结构产生变化从而导致复合物的生理活性及功能特性。从表1可以看出，1～4号样品猝灭常数随温度变化发生明显减小，而5号样品变化并不明显，这表明磷脂及磷脂经酶解后产生的溶血磷脂均可以与大豆分离蛋白在基态时通过结合作用生成复合物，且随着酶解时间的延长，复合物的生成呈现先易后难的趋势，其中长时间酶解产生的溶血磷脂不易与大豆分离蛋白形成复合物[19]。
2.3 大豆分离蛋白-溶血磷脂的结合位点数
由表1可判断出5 种样品均为静态猝灭方式，因此猝灭剂与大豆分离蛋白之间相互作用过程中的结合位点数计算可采用静态猝灭公式[20]，见式（4）。
式中：F0为未加入猝灭剂时蛋白质的荧光强度；F为加入猝灭剂后蛋白质的荧光强度；K0为结合常数/（L/mol）；n为结合位点数；[Q]为猝灭剂的浓度/（mol/L）。
本实验根据静态猝灭公式以lg（（F0－F）/F）对lg[Q]作拟合曲线，所得曲线斜率表示5 种样品在不同温度条件下结合位点数（n），曲线截距表示5 种样品在不同温条件度下结合常数（K0），所得拟合曲线方程、结合常数、结合位点数见表2。
表2 拟合曲线的回归方程、结合常数、结合位点数、热力学参数值
Table 2 lg[(Fo- F)/F] against lg[Q] equations, correlation coefficients, and number of binding sites, binding constants and thermodynamic parameters
注：ΔG.吉布斯自由能；ΔH. 焓变；ΔS.熵变。
由表2可知，5种样品的结合常数K0均随温度的升高而增大，由此可判断出猝灭剂与大豆分离蛋白结合过程为吸热反应过程[21]。结合常数K0基本均大于103L/mol，且对比5 种样品K0可知结合常数呈现先增大后减小的趋势。其中，3号样品最大K0为2.1×105L/mol，而5号样品最大K0为0.46×103L/mol，前者K0远大于后者，由此可以判断5号样品在静态猝灭过程中溶血磷脂与大豆分离蛋白结合能力较低，形成复合物稳定性较差[22]。由表2还可知，5种样品的表面结合位点数基本呈现先增大后减小的变化规律。
2.4 大豆分离蛋白-溶血磷脂的作用力类型判断
通常情况下，蛋白质与小分子物质之间相互作用力主要有疏水作用力、静电作用力、范德华力和氢键4 种。Ross等[23]指出当ΔH＞0、ΔS＞0时复合物之间主要以疏水作用相结合，当ΔH≈0、ΔS＞0时静电作用力起到主要结合作用，当ΔH＜0、ΔS＜0时复合之间可能以范德华力和氢键作用相结合。本实验在Van’t Hoff方程基础之上，并行考察ΔH及ΔS的值来判断5 种样品中复合物之间的相互作用力类型，Van’t Hoff 公式如式（5）、（6）所示。
式中：K0为结合常数/（L/mol）；T为温度/K；R为气体常数（8.314 J/（mol·K））。
由表2可知，5种样品复合物的ΔG均小于0，说明磷脂及溶血磷脂与大豆分离蛋白之间的结合作用均可以自发进行。且5 种样品中的ΔH及ΔS均大于0，表明磷脂及溶血磷脂与大豆分离蛋白之间的结合作用均为吸热过程，这与结合常数K0随温度的升高而增大相符合，且可以判断出5 种样品复合物中作用力类型均为疏水相互作用，这与李菊芳等[24]的研究相一致。从表2还可看出，5 种样品ΔH及ΔS基本呈现先增大后减小的趋势，3号样品具有最大值而5号样品具有最小值，这表明3号样品中经酶解4 h所得溶血磷脂与大豆分离蛋白相互作用力最强，而5号样品中经酶解8 h所得溶血磷脂与大豆分离蛋白相互作用力最弱[25]。
2.5 大豆分离蛋白-溶血磷脂的乳化特性结果
图3 溶血磷脂对复合体系乳化活性及乳化稳定性的影响
Fig. 3 Effect of LP on emulsifying activity and emulsion stability
乳化活性及乳化稳定性是表征乳状液乳化特性及稳定状态的最重要指标之一[26]。由图3可知，随着酶解时间的延长，乳化活性及乳化稳定性呈先增强后减弱的变化规律，其中，3号样品经酶解4 h所得溶血磷脂与大豆分离蛋白复合液具有最高乳化活性及乳化稳定性，分别为34.2 m2/g 和72 min，与1号样品相比有显著提高（P＜0.05）。而1号及5号样品的乳化活性及稳定性最低。根据图1、2及表1、2共同分析发现磷脂及溶血磷脂与大豆分离蛋白之间的相互作用对乳液的乳化特性具有一定影响，且疏水相互作用力越强乳化稳定性越好，这是由于LPC疏水基团的减少，亲水性增强，通过与大豆分离蛋白的相互作用形成大豆分离蛋白-溶血磷脂复合体系，构成双亲性结构，使疏水性区域更好地包裹油滴，亲水性区域更好地伸入水相当中去，降低水油间的界面张力，使其乳化特性有所提高[27]。然而5号样品中复合物之间虽疏水作用力较弱但稳定性与1号样品差异并不显著，这表明除复合物相互作用对乳液乳化特性有重要影响外，仍有其他因素对乳液稳定性具有影响。
2.6 乳液微观结构
乳液微观结构的观察是最为直观表征乳液稳定性的方法，本实验采用尼罗兰及尼罗红对5 种新鲜制备的乳液样品中的蛋白质、油脂和磷脂物质进行染色，30 min后在激光共聚焦显微镜下进行观察[28-29]。从图4可以看出，大豆分离蛋白-溶血磷脂复合物可以处于油水界面膜上，与其他样品相比，3号样品乳滴分布较为均匀，乳滴较小。这表明复合物可以很好地包裹在油滴外侧，降低水油界面张力，减少乳滴聚集现象的发生，提高乳液的乳化稳定性，这与之前的乳化稳定性测定结果相似，但1、2、4号样品间区别并不十分明显[30]。
大豆分离蛋白可与不同酶解时间条件下产生的溶血磷脂发生相互作用，且作用力类型为疏水相互作用，随着酶解时间的增长相互作用呈现先增强后下降的趋势。复合物之间的相互作用变化规律与乳化活性及乳化稳定性变化趋势基本一致，表明大豆分离蛋白-溶血磷脂间相互作用对其复合体系乳液的特性具有一定影响。磷脂经适度时间酶解后产生的溶血磷脂会明显改善大豆分离蛋白乳状液的乳化特质，这将为现今食品工业中蛋白的生产以及复合乳状液的制备提供理论参考。
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LI Qiuhui, QI Baokun, WANG Haiqing, LI Hong, JIANG Lianzhou, LI Yang, SUI Xiaonan*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150000, China)
Abstract：In this work, we explored the effect of enzymatic hydrolysis time for preparing lysophospholipid on the interaction between soybean protein isolate (SPI) and lysophospholipid (LP) and the emulsifying properties of an SPI-LP composite emulsion system. Fluorescence quenching, binding sites and constant and interaction forces between SPI and LP were investigated based on the Stern-Volmer and Van’t Hoff equations by fluorescence spectroscopy. Furthermore, the emulsifying activity and stability were determined, and the microstructural change of emulsion was observed. The results showed that as the hydrolysis time by phospholipase A1was prolonged, the interaction between SPI and LP first increased and then decreased, and so did the emulsifying properties, which suggested that the interaction had some effects on the emulsifying properties. Among five hydrolysis times tested, 4 h hydrolysis demonstrated the strongest interaction between SPI and LP and the best emulsifying properties indicating that lysophospholipid produced by moderate hydrolysis showed improved interaction with SPI to form a stable interfacial film at the water-oil interface for stable composite emulsion.
Key words：soybean protein isolate; lysophospholipid; interaction; emulsifying property
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201713002
中图分类号：TS214. 2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）13-0007-07
引文格式：
李秋慧, 齐宝坤, 王海晴, 等. 酶解时间对大豆蛋白-溶血磷脂相互作用及乳化特性的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(13): 7-13. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713002. http://www.spkx.net.cn
LI Qiuhui, QI Baokun, WANG Haiqing, et al. Effect of enzymatic hydrolysis time on emulsifying properties and interaction of soybean protein isolate-lysophospholipid emulsion[J]. Food Science, 2017, 38(13): 7-13. (in Chinese with English abstract)
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201713002. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-05-27
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31601475；31571876）；黑龙江省自然科学基金项目（ZD201302）；国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102104）；黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划项目（UNPYSCT-2015011）
作者简介：李秋慧（1991—），女，硕士研究生，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：cherish_lqh620@163.com
*通信作者：隋晓楠（1987—），男，副教授，博士，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：xiaonan.sui@u.nus.edu