脂肽和茶多酚对副溶血弧菌的协同抑菌效应和机理

刘唤明1,张文滔1,吴燕燕2,孙力军1,*,王雅玲1,刘 颖1,张雪梅1,洪鹏志1,吉宏武1
(1.广东海洋大学食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,水产品深加工广东普通高校重点实验室,广东 湛江 524088;2.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东 广州 510300)

摘 要:研究脂肽和茶多酚对副溶血弧菌的协同抑菌效应和机理,为脂肽协同茶多酚应用于副溶血弧菌的控制提供理论依据。利用“棋盘法”研究脂肽和茶多酚对副溶血弧菌的协同抑菌效应;通过研究脂肽和茶多酚独立作用及协同作用对细胞膜完整性、细胞蛋白质合成及磷代谢方面影响来研究二者的协同抑菌机理。结果表明:脂肽和茶多酚对副溶血弧菌存在强烈的协同抑菌效应,部分抑菌浓度指数达到0.19;与1/16最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)脂肽或1/8 MIC茶多酚各自独立作用相比,在1/16 MIC脂肽和1/8 MIC茶多酚协同作用下,副溶血弧菌的细胞膜通透性显著增强,细胞部分蛋白质合成的抑制作用得到进一步加强,并且细胞的磷代谢完全受到抑制。结果表明,脂肽和茶多酚对副溶血弧菌具有强烈的协同抑菌效应,其协同抑菌作用主要通过二者协同破坏细胞膜的完整性,从而影响细胞部分蛋白质的合成与正常代谢实现的。

关键词:脂肽;茶多酚;副溶血弧菌;协同抑菌效应;协同抑菌机理

国家食源性疾病监测网数据显示,沿海省份副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物性食物中毒的首位[1]。该菌在水产品中的天然带菌率较高,温暖季节在海虾中可高达90%[2-3]。因此副溶血弧菌的绿色控制对水产品的质量与安全保障尤为重要。目前食品工业广泛应用的天然防腐剂Nisin主要作用于对革兰氏阳性菌的控制,而对水产品中主要致病菌副溶血弧菌则无抑制作用,因而急需开发新型天然防腐剂用于水产品中副溶血弧菌的控制。

脂肽是以枯草芽孢杆菌[4-5]、淀粉液化芽孢杆菌[6]为代表的芽孢杆菌产生的一系列脂肽类物质(通常有表面活性素、伊枯草菌素、芬荠素等)。脂肽具有广谱的抗菌活性,对革兰氏阳性(G)菌和革兰氏阴性(G)菌皆有抗菌作用。脂肽作为一种新型天然食品防腐剂,近些年来在在食品工业的应用得到了快速发展,Huang Xianqing等[7-9]将脂肽应用于蜡样芽孢杆菌的芽孢、大肠杆菌、沙门氏菌的控制,均取得了良好的效果。特别值得关注的是,脂肽对水产品中主要致病菌副溶血弧菌[10-11],以及水产品中在冷藏过程中的特定腐败菌[12-14]都有良好的控制效果,表明其在水产品有害微生物的控制方面具有良好的应用前景。

茶多酚是茶叶中的主要成分之一,占茶叶干物质质量的15%~30%。茶多酚大约由30 种以上的酚类物质组成。茶多酚安全、无毒,是一种纯天然的生物保鲜剂;并且茶多酚抑菌谱广,对G菌和G菌均有明显抑制作用。作为一种新型天然防腐剂,茶多酚已经在副溶血弧菌的控制方面显示出良好的应用效果[15]。另外,茶多酚还有良好的抗氧化功能,特别是其能抑制多酚氧化酶的活性从而延缓对虾的黑变[16],这进一步促进了茶多酚在水产品保鲜中的应用。

存在协同抑菌效应的2 种抗菌物质联合作用时,二者的抗菌活性都可显著增强,因而对协同抑菌的相关研究一直以来备受人们的关注。目前有关食品工业广泛应用的Nisin的协同抑菌作用更是研究热点,Nisin与植物精油[17]、大蒜茎汁[18]、噬菌体内溶素[19]等许多物质存在协同抑菌作用。然而目前对于协同抑菌的研究主要集中在协同抑菌效应层面,缺乏对协同抑菌的机理进行深入研究。脂肽和茶多酚都为优良的天然防腐剂,在水产品中主要致病菌副溶血弧菌的控制方面有良好的效果[10,15],但有关二者协同使用目前鲜见研究报道。本实验研究脂肽和茶多酚对副溶血弧菌的协同抑菌效应与机理,为脂肽协同茶多酚应用于副溶血弧菌的控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC17802购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NT-6由广东海洋大学食品科技学院水产品食源性病原微生物及毒素绿色控制研究室提供[20]

LB液体培养基:牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%,pH 7.2。改良LB液体培养基:牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 3.5%, pH 7.2。改良Landy培养基:葡萄糖10.0 g/L、谷氨酸钠5.0 g/L、MgSO40.5 g/L、KCl 0.78 g/L、KH2PO41.0 g/L、FeSO40.05 mg/L、CuSO40.16 mg/L、MnSO45.0 mg/L,pH 7.0。

茶多酚(纯度≥98%) 杭州浙大茶叶科技有限公司;碘化丙啶(propidium iodide,PI) 美国Sigma公司。1.2 仪器与设备

HZQ-F160振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;FDU-1100真空冷冻干燥机 东京理化器械株式会社;DYY-12电泳仪 北京市六一仪器厂;凝胶成像系统、Multiskan MK3酶标仪 上海精密科学仪器有限公司;E600荧光显微镜 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肽的制备

取斜面保存的Bacillus subtilis NT-6菌株,接种于LB液体培养基中,于37 ℃、150 r/min振荡培养24 h作为种子液。按照5%接种量接种于改良的Landy培养基,于33 ℃、180 r/min培养38 h。5 000 r/min离心15 min除去菌体,上清液调pH值至2.0,低温过夜。5 000 r/min离心15 min取沉淀,用甲醇溶解,调节pH值至7.0,于磁力搅拌器上低温搅拌5 h,10 000 r/min离心20 min后得到的上清液,即为含脂肽的甲醇溶液,然后利用低温冷冻干燥除去甲醇。制备得到的脂肽产品通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)的方法[21]测定其脂肽含量为61.2%。

1.3.2 副溶血弧菌菌悬液的制备

分别取斜面保存的副溶血弧菌ATCC17802接种于改良LB液体培养基中,于37 ℃、150 r/min振荡培养16 h。5 000 r/min,离心10 min收集菌体,用无菌水洗涤3 次后,用无菌生理盐水悬浮,制备成合适浓度的菌悬液备用。

1.3.3 最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法将脂肽和茶多酚分别用改良LB培养基稀释,然后将各质量浓度的脂肽与茶多酚分别取100 μL加入到96 孔板小孔中;取108CFU/mL副溶血弧菌菌悬液20 μL加入到10 mL改良LB液体培养基中,制备成2×105CFU/mL副溶血弧菌菌悬液,然后分别取2×105CFU/mL副溶血弧菌菌悬液100 μL加入到上面装有脂肽与茶多酚的小孔中,并混匀。立刻将96 孔板放入到酶标仪中,于630 nm波长处测定OD值;然后将96 孔板放入到37 ℃恒温培养箱中培养24 h后取出,再次放入到酶标仪中,于630 nm波长处测定OD值。经过24 h培养后,OD值没有增加所对应的脂肽或茶多酚的最小浓度为二者对副溶血弧菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。

1.3.4 脂肽与茶多酚对副溶血弧菌协同抑菌效应的测定

参考White等[22]的“棋盘法”研究脂肽与茶多酚对副溶血弧菌的协同抑菌效应。将脂肽与茶多酚用改良LB培养基分别稀释到质量浓度为各自的1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC和2 MIC。从低质量浓度到高质量浓度分别按行加入脂肽稀释液50 μL,同行脂肽质量浓度相等,每行加7 孔,第1行作为不加脂肽的茶多酚对照组。从低质量浓度到高质量浓度分别按列加入茶多酚稀释液50 μL,每列加7 孔,同列茶多酚质量浓度相同,第1列作为不加茶多酚的脂肽对照组。第1列和第1行各孔中分别加入浓度为2×105CFU/mL的副溶血弧菌菌悬液50 μL。其余各孔中分别加入同浓度菌悬液100 μL,使每孔菌液的终浓度为1×105CFU/mL。将组合好的细胞培养板在37 ℃恒温培养箱中孵育24 h,采用比浊法进行观测,记录2 种抗菌物质联用时的MIC,实验重复3 次,结果取平均值。以抗菌药物部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)作为药物联用效果的判断依据,计算公式如下:

结果判定:FICI<0.5为协同;0.5≤FICI≤1为相加作用;l<FICI≤2为无关作用;FICI>2拮抗作用[23]

1.3.5 脂肽协同茶多酚对菌悬液电导率的影响

分别取制备的108CFU/mL副溶血弧菌ATCC17802菌悬液100 mL加入到4 个无菌离心管中,往其中3 管分别加入等体积的脂肽稀释液、茶多酚稀释液和脂肽+茶多酚的混合液,使3 管分别含有1/16 MIC脂肽、1/8 MIC茶多酚和1/16 MIC脂肽+1/8 MIC茶多酚的混合物;在另一管加入同体积的无菌水作为对照。4 个离心管都置于37 ℃恒温培养箱中,每隔20 min测一次电导率。平行实验3 次。

1.3.6 菌体荧光染色的测定

分别取制备的108CFU/mL副溶血弧菌ATCC17802菌悬液5 mL加入到4 个无菌离心管中,往其中3 管分别加如等体积的脂肽稀释液、茶多酚稀释液和脂肽+茶多酚的混合液,使3 管分别含有1/16 MIC脂肽、1/8 MIC茶多酚和1/16 MIC脂肽+1/8 MIC茶多酚的混合物;在另一管加入同体积的无菌水作为对照。4个离心管都置于37 ℃恒温培养箱中作用1 h,然后10 000 r/min,离心5 min,弃上清液,沉淀加入0.5 mL PI染液避光染色30 min,离心,pH 7.2磷酸盐缓冲液洗去多余的PI ,再用1 mL pH 7.2磷酸盐缓冲液重悬。荧光显微镜下进行观察。

1.3.7 脂肽协同茶多酚对蛋白质合成的影响

参考刘梦茵等[24]的研究方法,将副溶血弧菌ATCC17802培养12 h至对数生长期,按5%接种量分别接种于4 个装有50 mL改良LB培养基的三角瓶中,在其中3 个三角瓶中分别加入等体积的脂肽、茶多酚及脂肽和茶多酚的混合物,使3瓶分别含有1/16 MIC脂肽、1/8 MIC茶多酚和1/16 MIC脂肽+1/8 MIC茶多酚的混合物,在另外1 个三角瓶中加入同体积的无菌水作为对照。4 个三角瓶都放置于37 ℃、150 r/min摇床培养12 h后取样,稀释成相同的吸光度后取样10 mL于5 000 r/min离心10 min,然后用生理盐水洗涤2 次,取沉淀加80 μL无菌水和20 μL上样缓冲液于100 ℃保温5 min,再次离心沉淀后取20 μL上清液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),观察蛋白谱带的变化。浓缩胶质量分数为5.0%,分离胶质量分数为12%,染色液为0.1%考马斯亮蓝。

1.3.8 脂肽协同茶多酚对细菌磷代谢的影响

根据翟培等[25]的方法,分别取制备的106CFU/mL副溶血弧菌 ATCC17802菌悬液0.5 mL分装在4 个离心管中,再往每管都加入200 μL磷标准溶液,然后在其中3 个离心管中分别加入200 μL脂肽稀释液、茶多酚稀释液及脂肽+茶多酚的混合液,使3 管分别含有1/16 MIC脂肽、1/8 MIC茶多酚和1/16 MIC脂肽+1/8 MIC茶多酚,在另一离心管中加入200 μL无菌水作为对照。4 个离心管都置于37 ℃培养箱中孵育,分别在0、1、2、3、4、5、6 h时吸取悬浮液100 μL,用三氯乙酸-硫酸亚铁和钼酸铵处理后,通过酶标仪测定处理液在630 nm波长处的OD值。平行实验3 次。

1.4 数据统计分析

所有实验均平行3 次,结果以±s表示。运用SAS 8.0软件统计,采用单因素方差分析(ANOVA)进行显著差异分析(P<0.05)。数据图由Origin 8.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 脂肽与茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802的MIC

表1 脂肽与茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802的抑制作用
Table 1 Antibacterial effect of lipopeptides and tea polyphenols against Vibrio parahaemolyticus ATCC17802

注:△OD630nm=OD630nm,24h-OD630nm,0h

由表1结果可知,脂肽与茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802均具有抑菌作用,并且二者对副溶血弧菌的MIC分别为1.20 mg/mL与0.75 mg/mL。

2.2 脂肽与茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802的协同抑菌作用

表2 脂肽和茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802的协同抑菌作用
Table 2 Synergistic antimicrobial effect of lipopeptides and tea polyphenols against Vibrio parahaemolyticus ATCC17802

由表2可知,在亚抑菌质量浓度茶多酚的存在下,随着茶多酚质量浓度的增加,脂肽对副溶血弧菌ATCC17802的MIC快速降低,当茶多酚质量浓度为0.190 mg/mL(1/4 MIC)时,脂肽的MIC减小到其单独作用时的1/32;在亚抑菌质量浓度脂肽的存在下,随着脂肽质量浓度的增加,茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802的MIC快速降低,当脂肽质量浓度为0.300 mg/mL(1/4 MIC)时,茶多酚的MIC减小到其单独作用时的1/32。可见,脂肽和茶多酚联合作用时的抗菌活性要强于它们单独作用时的抗菌活性,使得它们联合作用时完全抑制副溶血弧菌ATCC17802生长时所需的抗菌物质的总剂量降低很多。FICI的最小值为0.19,这进一步表明脂肽和茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802存在强烈的协同抑菌作用。

2.3 脂肽协同茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802细胞膜完整性的影响

2.3.1 对细胞膜通透性的影响

细胞膜是细菌的保护屏障,当细菌遇到强抑菌剂而使细胞膜遭到破坏时,菌体的保护屏障被打破,使其内部电解质外泄至培养液中,进而使得培养液的电导率上升,因此,菌悬液电导率的变化反映了细菌细胞膜通透性的变化[26]

图1 脂肽和茶多酚处理对副溶血弧菌ATCC17802菌悬液电导率的影响
Fig. 1 Effect of combined treatment with lipopeptides and tea polyphenols on conductivity of Vibrio parahaemolyticus suspension

由图1可知,在1/16 MIC脂肽或1/8 MIC茶多酚的单独作用下,副溶血弧菌菌悬液的电导率几乎不变;然而在1/16 MIC脂肽和1/8 MIC茶多酚的联合作用下,菌悬液的电导率随时间的延长显著增加。

2.3.2 对细胞膜完整性的影响

PI与核酸结合后在波长450~490 nm的绿光照射下会发射波长520 nm左右的红色荧光,但是PI本身不能透过生物膜。所以,当在荧光显微镜下观察到细胞在PI的染色下呈红色时,则意味着该细胞膜的完整性受到了破坏。

由图2可以看出,在1/8 MIC茶多酚或1/16 MIC脂肽的单独作用下,染成红色的细菌的数量与对照组相比并没有显著差异(颜色未显示,后同);然而在1/8 MIC茶多酚和1/16 MIC脂肽的协同作用下,许多副溶血弧菌ATCC17802被染成了红色。结果表明,1/16 MIC脂肽或1/8 MIC茶多酚的单独作用并不能破坏细胞膜的完整性;然而1/16 MIC脂肽与1/8 MIC茶多酚的联合作用,可明显破坏细胞膜的完整性,这也为之前实验证明二者联合作用可使得副溶血弧菌细胞膜通透性显著增加提供了直接证据。刘唤明等[27]研究表明,脂肽是通过作用副溶血弧菌ATCC17802的细胞膜使其通透性增加,或形成孔洞导致细胞内物质泄漏,使细胞生长受到抑制,进而导致死亡。Yi Shumin等[28]研究表明茶多酚主要是通过损坏细胞膜的方式抑制铜绿假单胞菌的生长的。可见,脂肽与茶多酚均是通过作用于细胞膜的方式而实现抑菌的。然而本研究进一步探明了脂肽和茶多酚对副溶血弧菌细胞膜的作用存在协同效应,不过二者对细胞膜胞的作用存在协同效应的机制还需进一步深入研究。

图2 副溶血弧菌ATCC17802的PI染色荧光显微图片(×1 000)
Fig. 2 Microphotographs of Vibrio parahaemolyticus stained with PI after being treated by lipopeptides combined with tea polyphenols observed under fluorescence microscopy (× 1 000)

2.4 脂肽协同茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802蛋白质合成的影响

图3 脂肽与茶多酚处理后副溶血弧菌ATCC17802的菌体总蛋白SDS-PAGE图谱
Fig. 3 SDS-PAGE patterns of total proteins of Vibrio parahaemolyticus treated by lipopeptides combined with tea polyphenols

从图3可以看出,1/16 MIC脂肽处理组的蛋白质谱带与对照组相比,虽未见明显特征谱带的消失,但很多蛋白质的谱带亮度变浅很多,说明脂肽对细菌部分蛋白质的合成有一定的抑制作用;1/8 MIC茶多酚处理组的很多蛋白质的谱带亮度变浅很多,并且还有明显特征谱带(35 ku附近)的消失,这表明茶多酚不但对细菌部分蛋白质的合成有抑制作用,而且还会抑制部分蛋白的表达,这与钱丽红等[26]的研究结果类似;1/16 MIC脂肽与1/8 MIC茶多酚联合处理使很多蛋白质谱带亮度进一步变浅。实验结果表明,与1/16 MIC脂肽或1/8 MIC茶多酚单独作用于副溶血弧菌ATCC17802相比,在脂肽与茶多酚的协同作用下,副溶血弧菌ATCC17802部分蛋白质合成的抑制作用得到进一步加强。这可能是由于在1/16 MIC脂肽与1/8 MIC茶多酚的协同作用下,细胞膜通透性显著性增强,细胞里面的物质发生了泄漏,从而使得细胞部分蛋白质合成的抑制作用得到进一步加强。

2.5 脂肽协同茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802磷代谢的影响

图4 脂肽与茶多酚处理对副溶血弧菌磷代谢的影响
Fig. 4 Effect of combined treatment with lipopeptides and tea polyphenols on phosphorous metabolism of Vibrio parahaemolyticus

细菌利用葡萄糖经过一系列磷酸化反应,为生长繁殖提供所需能量,因此,通过检测细菌代谢活动中磷的消耗状况可反映细胞的整体代谢功能和生长状态。由图4可知,与对照组相比,在1/16 MIC脂肽或1/8 MIC茶多酚的单独作用下,副溶血弧菌ATCC17802的磷代谢受影响不大;然而在1/16 MIC脂肽与1/8 MIC茶多酚的协同作用下,细菌的磷代谢基本上完全被抑制。这可能是由于在1/16 MIC脂肽与1/8 MIC茶多酚的协同作用下,细胞里面与磷代谢相关的物质发生了泄漏,或者与磷代谢相关的酶的合成受到了抑制,从而使得细菌的磷代谢完全受到抑制。

3 结 论

脂肽对副溶血弧菌ATCC17802的MIC为1.20 mg/mL,茶多酚对其的MIC为0.75 mg/mL。“棋盘法”的实验结果表明,脂肽和茶多酚对副溶血弧菌ATCC17802存在强烈的协同抑菌效应,FICI达到0.19。

与1/16 MIC脂肽或1/8 MIC茶多酚各自的单独作用相比,在1/16 MIC脂肽和1/8 MIC茶多酚的协同作用下,副溶血弧菌ATCC17802的细胞膜通透性显著增强,细胞部分蛋白质合成的抑制作用得到进一步加强,并且其磷代谢几乎完全受到抑制。脂肽和茶多酚对副溶血弧菌的协同抑菌作用主要通过二者协同破坏细胞膜的完整性,从而影响细胞部分蛋白质的合成与正常代谢实现的。

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Synergistic Antimicrobial Effect and Mechanism of Lipopeptides and Tea Polyphenols against Vibrio parahaemolyticus

Abstract:In order to provide a theoretical basis for controlling Vibrio parahaemolyticus by using lipopeptides combined with tea polyphenols, the synergistic antimicrobial effect of lipopeptides and tea polyphenols against V. parahaemolyticus was assessed through checkerboard microtiter tests, and the underlying mechanism was studied by determining the change in cell membrane integrity, protein synthesis and phosphorus metabolism. The results showed that the combination of lipopeptides and tea polyphenols displayed strong synergistic antibacterial effect against V. parahaemolyticus with a fractional inhibitory concentration index of 0.19, resulting a notable increase in the membrane permeability and further inhibition of the synthesis of some proteins. Phosphorus metabolism was entirely inhibited when treated by 1/16 MIC lipopeptides combined with 1/8 MIC tea polyphenols when compared with the group treated by 1/16 MIC lipopeptides or 1/8 MIC tea polyphenols alone. In conclusion, there was a notable synergistic antimicrobial effect of lipopeptides and tea polyphenols against V. parahaemolyticus, which was achieved by destroying the cell membrane integrity and thus resulting in inhibition of protein synthesis and normal cell metabolism.

Key words:lipopeptide; tea polyphenols; Vibrio parahaemolyticus; synergistic antimicrobial effect; synergistic antimicrobial mechanism

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713003

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)13-0014-06

收稿日期:2016-05-16

基金项目:国家自然科学基金面上项目(30972287;31371746);农业部水产品加工重点实验室开放课题(NYJG201302);广东省水产品加工与安全重点实验室开放课题(GDPKLAPPS1407);广东海洋大学“创新强校工程”科研项目(GDOU20014050203;GDOU2013050204;GDOU2013050205;GDOU2013050313);广东省海洋战略性新兴产业专项(GD2012-B02-007)

作者简介:刘唤明(1978—),男,副教授,硕士,研究方向为水产品质量与安全控制。E-mail:lhmgdhydx@126.com

*通信作者:孙力军(1965—),男,教授,博士,研究方向为水产品质量与安全控制。E-mail:suncamt@126.com

引文格式:

刘唤明, 张文滔, 吴燕燕, 等. 脂肽和茶多酚对副溶血弧菌的协同抑菌效应和机理[J]. 食品科学, 2017, 38(13): 14-19.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713003. http://www.spkx.net.cn

LIU Huanming, ZHANG Wentao, WU Yanyan, et al. Synergistic antimicrobial effect and mechanism of lipopeptides and tea polyphenols against Vibrio parahaemolyticus[J]. Food Science, 2017, 38(13): 14-19. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713003. http://www.spkx.net.cn

LIU Huanming1, ZHANG Wentao1, WU Yanyan2, SUN Lijun1,*, WANG Yaling1, LIU Ying1, ZHANG Xuemei1, HONG Pengzhi1, JI Hongwu1

(1. Aquatic Product Processing and Safety Key Laboratory of Guangdong Province, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Product of Guangdong Higher Education Institution, College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)