酶法水解乳清分离蛋白制备纳米纤维

李 璇,单 杰,冯志彪*,刘春红,李冬梅
(东北农业大学理学院,黑龙江 哈尔滨 150030)

摘 要:采用天冬氨酸内切酶(Asp endoproteinase,AspN)在37 ℃诱导乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)制备蛋白质纳米纤维(protein nanofibrils,PNFs),考察WPI不同水解时间对产物PNFs形貌的影响。利用透射电子显微镜、原子力显微镜、小分子蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、硫磺素T荧光、红外光谱以及激光散射法对PNFs及形成过程进行表征。结果显示,该方法制备的产物PNFs呈乳白色,AspN水解得到的5 kD左右的多肽为构筑单元,β-折叠为PNFs稳定存在的主要二级结构,PNFs平均粒径随水解时间延长而增大。酶法制备PNFs解决了酸法中的褐变问题,有望拓展其在食品领域的应用。

关键词:乳清分离蛋白;天冬氨酸内切酶;蛋白质纳米纤维;多肽

蛋白质在一定条件下可自发或触发地自组装成具有特定形状的有序性结构,例如,研究发现人类淀粉样纤维疾病与其体内蛋白结构的变化有关[1-3]。不仅少数的病原性蛋白能够构建蛋白质纳米纤维(protein nanofibrills,PNFs),食源性蛋白在特定条件下亦可自组装成纳米纤维[4-8]。在食品科学领域,因PNFs具有良好的流变性,主要用作增稠剂[9]和凝胶填充物[10],降低凝胶成本[11];另一方面,PNFs可以作为保鲜的涂膜剂[12],还能够有效稳定油水/汽水界面[13]

构建PNFs主要分为酸解高温诱导和酶解诱导两种方法。酸解高温诱导是食源性蛋白构建纤维的主要方法[14-16],其中乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)能够在pH 2.0、353 K条件下自组装形成纤维状聚集[17]。通过蛋白质自组装制备的纳米纤维可作为增稠剂和胶凝剂用于食品工业,但酸解高温诱导得到的乳清分离蛋白纳米纤维呈现褐色凝胶状,极大地限制了其在食品领域的应用。针对以上问题,研究者尝试采用酶解诱导构建蛋白质纳米纤维来减轻褐变。早在1973年,Linke等[18]报道Bence Jones蛋白胃酶水解后在体外可以构建出类似于人类淀粉样纤维的结构,并指出不同酶处理得到的淀粉样结构在形态上有所差异。Gao Yuzhe等[19]利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶A以及蛋白酶M热处理改性乳清浓缩蛋白后发现了不同程度聚集的纤维体。Akkermans等[20]研究天冬氨酸蛋白酶酶解β-乳球蛋白后温育诱导可以得到长的纤维状聚集物。但β-乳球蛋白的价格昂贵,缺乏实际应用价值。

天冬氨酸内切酶(Asp endoproteinase,AspN)是一种能够限制性切割天冬氨酸残基和谷氨酸残基N端肽键的锌金属内切酶[21]。本研究以工业生产干酪以及干酪素的廉价副产品WPI为原料,采用AspN水解并在接近于常温条件诱导制备PNFs。以透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察不同水解时间终产物PNFs的形貌,对WPI水解液和WPI-PNFs用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)分析纳米纤维的表面微现结构及剖面,利用小分子蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(tricine-sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis,Tricine-SDS-PAGE)对水解物进行分子质量分析,以硫磺素T荧光和红外光谱对PNFs形成过程二级结构β-折叠进行定量考察,激光纳米粒径技术对PNFs粒径分布进行表征。酶法诱导构建的PNFs呈现乳白色,相比于酸解高温诱导的PNFs,条件温和易于制备,而且解决了褐变问题,有望拓展在食品领域的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

WPI(蛋白质量分数为91.5%) 美国Hilmar公司;AspN(EC. 3.4.24.76) 美国NEB公司;超低分子质量标准蛋白质 美国Thermo Scientific公司;溴化钾(光谱纯)、硫磺素T 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

磁力加热搅拌器 杭州仪表电机厂;Z36HK冷冻离心机 德国Hermle公司;SHB-36型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸公司;FE-20型pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;数显式电热恒温水浴锅天津欧诺仪器仪表有限公司;H-7650型TEM 日本日立公司;ICON3100型扫描探针显微镜 德国Bruker公司;凝胶成像分析系统 上海山富科学仪器有限公司;FTIR-8400S傅里叶变换红外光谱仪 日本岛津株式会社;PE LS-55荧光分光光度计 美国PE公司;90Plus/BI-MAS激光纳米粒径分析仪 美国Brookhaven公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI纳米纤维的制备

将WPI溶解于50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0,含2 mmol/L醋酸锌)中配制成质量分数为3%的蛋白溶液。室温条件下磁力搅拌30 min使蛋白质充分溶解。9 000 r/min、4 ℃离心15 min后上层清液用尺寸Ф100 mm,孔径0.45 μm的混合纤维素酯微孔滤膜真空抽滤去除不溶性蛋白。AspN按0.83 U/mg蛋白质加入到上述蛋白溶液中,于37 ℃进行反应一定时间后,加入体积分数18%盐酸调节至pH 2.0终止酶解反应。

酶解反应后的WPI水解液在30 ℃条件下继续搅拌24 h后,取出置于4 ℃冰箱中冷藏备用,以不加酶的WPI溶液作为空白对照。

1.3.2 TEM观察

通过TEM观察WPI纳米纤维的微观形貌,采用Bolder等[22]的方法并加以改进。取待测样品100 μL,加入2 mL pH 2.0的盐酸溶液,混匀后经100 kD的超滤离心管(离心管先用pH 2.0的盐酸溶液冲洗)3 000 r/min离心15 min,去除滤液后再将2 mL pH 2.0盐酸溶液加入到截留物中,再次3 000 r/min离心15 min,截留物用2 mL pH 2.0的盐酸溶液注满,重复3 次,最后将1 mL pH 2.0的盐酸溶液加入到截留物中,翻转倒置,转移至1.5 mL的塑料管中,样品最终稀释倍数接近于10 倍。取适量的样品滴加到专用铜网的碳膜上,静置吸附15 min,用滤纸于边缘缓慢移走多余液体之后滴加质量分数2%醋酸铀进行负染色约8 min,于TEM进行纤维形貌的观察,并捕捉拍照得到WPI纳米纤维的形貌图。

1.3.3 AFM扫描

AFM扫描通过ICON3100型扫描探针显微镜进行。本工作中AFM的测量条件如下:采用轻敲模式(Tapping Mode)成像,将新鲜干净的载玻片浸入到样品中,取出后于常温条件进行干燥。将样品的载玻片用双面胶小心地粘贴到金属片,放置于显微镜载物台上,扫描探针为商用氮化硅针尖,力的常数为3.2 N/m,微悬臂常数为180 µm,观察蛋白质的微观形态特征。

1.3.4 硫磺素T荧光定量分析

将7.9 mg硫磺素T溶于8 mL 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0,含150 mmol/L NaCl)制得硫磺素T储备液。完全溶解后,过滤除去不溶性的杂质,储备液在4 ℃的冰箱中避光保存。硫磺素T储备液稀释50 倍得到工作液,取48 μL样品加入4 mL工作液,混合均匀反应约1 min后进行荧光分析[23]。检测条件:激发波长设定为460 nm,扫发射光谱,扫描范围为470~600 nm,激发光狭缝10 nm,发射光狭缝10 nm,扫描速率200 nm/min。每个样品荧光值重复测定3 次,整个实验过程注意避光。

1.3.5 红外光谱分析

真空冷冻干燥WPI纳米纤维样品与干燥KBr按1∶200充分研磨混匀,用溴化钾压片模具压片后扫描中红外图谱,样品室N2吹扫,检测器DTGS。参数设置:扫描次数64,分辨率4 cm-1,扫描范围4 000~400 cm-1。图谱分析处理采用Liu Chunhong等[24]的方法。

1.3.6 Tricine-SDS-PAGE分析

参照Schägger等[25]的方法,略有改动。分离胶(质量分数16.5%)、间隙胶(质量分数10%)、浓缩胶(质量分数4%)按体积比为4.0∶1.0∶1.5进行。配制10 mg/mL水解物样品,取100 μL溶液于1.0 mL离心管中与Tricine-SDS-PAGE缓冲溶液1∶1混合均匀,点样前将样品在沸水浴中煮沸5 min,使蛋白质与SDS结合变性[26],点样量为10 µL。凝胶电泳于恒压模式下进行,浓缩胶和间隙胶为60 V恒压,到达分离胶后,电压调至120 V。电泳结束后,将胶片放入乙醇和戊二醛水溶液(体积分数30%乙醇、0.5%戊二醛)中固定30 min,取出放入染色液中(含0.25%考马斯亮蓝R-250、50%甲醇、10%乙酸)染色1 h后用脱色液(甲醇-冰乙酸-水体积比2∶2∶9)脱色,更换脱色液直至条带清晰、背景色完全褪去为止。采用凝胶成像系统中的LabWorks 4.5软件进行数据采集。

1.3.7 水合半径分析

将样品稀释至浓度为0.1%加入到比色皿中,PNFs水合半径的变化采用90Plus/BI-MAS激光纳米粒径分析仪进行测定。参数设置如下:颗粒折光率为1.347;分散剂:水;常温25 ℃测量。每个样品测量3 次,结果取平均值。1.4 数据处理与统计

将所有数据用SAS 9.3统计分析软件进行单因素方差分析,显著性差异界值预设为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 酶法与酸法制备的PNFs对比

图1 AspN法(a)与酸法(b)构建的PNFs颜色对比
Fig. 1 Comparison of whey isolateprotein nanofibrils prepared with AspN (a) or acid (b)

如图1所示,酶法诱导WPI制备出的纳米纤维呈现乳白色,明显改善了酸法高温诱导制备纳米纤维中的褐变问题。

2.2 PNFs形貌分析

采用AspN对分离分离蛋白进行不同时间的水解后,调节pH值至2.0培育24 h,对产物进行TEM观察,所得结果如图2所示。

图2 WPI溶液在不同水解时间条件下培养24 h后TEM图
Fig. 2 Morphology of whey protein isolate solution incubated for 24 h after different hydrolysis times

从图2可以看出,在2~24 h电子显微镜图中均能观察到纤维的存在,且呈不均匀分布,长短不一地共存于溶液中,WPI水解24 h后培养的纤维形貌最佳。随水解时间的延长,WPI的水解度增大,颗粒性蛋白质斑块明显减少,聚集体逐渐展开形成短小的纤维,进而相互缠绕呈团簇状。这说明WPI经AspN水解24 h后,得到的水解物经过培育能够形成高度有序的纳米纤维结构。

AFM图片可以用来分析纳米纤维的表面微现结构,并且能给出三维成像。分别在轻敲模式下观察WPI未水解溶液(0 h)和加酶水解24 h后的微观结构。

图3 轻敲模式的扫描探针AFM图
Fig. 3 Scanning probe AFM images in the tapping mode

如图3所示,0 h时蛋白还未进行水解,以颗粒状聚集在一起;24 h后经过水解及培养过程,形成不均匀分布的细长纤维,其中还可以看出一些未形成纤维的单体,纤维的长度长短不一。同样证实了PNFs形成过程中水解的重要性,间接证明PNFs的构筑单元为多肽。Oboroceanu等[27]利用AFM研究80 ℃体积下β-乳球蛋白加热85 min后,形成的纤维伸直长度大于10 μm。

图4 剖面线图
Fig. 4 Profile chart

图4 分别为WPI水解液和WPI-PNFs的剖面线图。未水解溶液样品颗粒具有不同大小,高度为3~8 nm左右;水解后PNFs高度可以达到9~15 nm,可能是由于WPI纤维的叠加引起纤维堆积。

2.3 水解物的分子质量

通过Tricine-SDS-PAGE技术分析WPI及其水解物的分子质量分布,结果见图5。可以看出,WPI的分子质量主要在10~20 kD之间,其中在14~20 kD的条带颜色最深且最宽,说明在此分子质量范围内的蛋白含量最高,推测是β-乳球蛋白;其次14 kD左右的条带颜色较深,推测是WPI中含量的α-乳白蛋白;其他条带分子质量高于30 kD的蛋白可能是牛血清白蛋白等蛋白质。随着处理时间的延长,分子质量14 kD以下出现新条带,分子质量为5 kD左右的多肽变多,且条带的颜色逐渐变深。水解24 h时,大多数蛋白被水解后分子质量降低,仅有少量蛋白未被水解。结合TEM图证实,形成纤维聚集物的结构单元是肽而不是蛋白分子[28]

图5 不同水解时间WPI水解物的分子质量
Fig. 5 Tricine-SDS-PAGE profiles of whey protein hydrolysates at different hydrolysis times

2.4 纤维生长动力学分析

硫磺素T是一种外源荧光染料,属阳离子苯并噻唑,与淀粉样纤维结合后可极大提高纤维物质的荧光强度,从而判断纤维的聚集情况,因此经常用来检测淀粉样纤维变化并以此判断淀粉样纤维的成熟情况[19]。利用AspN对WPI水解0、1、2、3、4、6、8、10 h及24 h,然后在30 ℃、pH 2.0条件下培育24 h,对产物进行硫磺素T荧光分析。

图6 水解不同时间硫磺素T荧光强度增加的纤维生长动力学
Fig. 6 Kinetics of fibrils formation as observed by increase in ThT fluorescence intensity with hydrolysis time

从图6可以看出,0~1 h之间荧光强度变化与1~4 h相比较小,推测可能是纤维形成的“迟滞期”;随着水解时间的延长,在1~10 h之间荧光强度迅速增大,推测此阶段为纤维的快速“生长期”;水解10 h后,荧光强度增大的幅度趋于平稳,新的纤维生成量减少,纤维的含量逐渐进入“稳定阶段”。这表明纤维化聚集的过程在初始阶段变化较快,这可能与蛋白质分子的亚基解离和水解速度有关[29]

2.5 二级结构含量的变化

对WPI pH 8.0条件下水解24 h的冻干样以及对水解物在最佳条件下培育24 h的样品进行红外光谱测定,红外光谱原始谱图如图7所示。

图7 不同样品傅里叶变换红外光谱原始谱图
Fig. 7 Original FTIR spectra of different samples

对原始图谱进行求导、去卷积、曲线拟合如图8所示,对各子峰进行指认和计算后,得到对应的二级结构相对含量见表1。

图8 红外光谱的酰胺类Ⅰ带曲线拟合的比较
Fig. 8 Comparison of infrared spectra of the amide Ⅰ band with curvr fitting

表1 不同样品二级结构相对含量
Table 1 The contents of secondary structures in different samples %

注:同列肩标不同字母表示不同样品之间差异显著(P<0.05)。

由表1可以看出,在蛋白质水解过程中β-折叠相对含量降低而β-转角相对含量升高,原因可能是水解过程蛋白质天然结构展开,次级键破坏,肽键发生断裂后,β-转角更能够稳定存在于水解液中;多肽自组装形成PNFs的过程中,α-螺旋和β-转角相对含量明显下降,而β-折叠相对含量显著增加到53.67%,可能是由于呈碱性的水解液中,β-转角的第1个氨基酸残基的羰基与第4个氨基酸残基的亚氨基之间氢键稳定存在,而酸性环境使其180°回折处的氢键遭到破坏,在同一条肽链或者相邻肽链的羰基与酰胺基之间形成氢键存在于β-折叠中,β-折叠的氢键能够促进肽链延展并聚集形成纳米纤维[30]。Oboroceanu等[27]研究β-乳球蛋白热诱导聚集时,也证实了在纤维化过程中蛋白质二级结构的α-螺旋含量与β-折叠含量成反比关系。这间接说明β-折叠是构成WPI纳米纤维的主要二级结构。

2.6 粒径分析

动态光散射法是一种可以对蛋白质聚集程度做定性分析的方法,是从整体角度表征溶液中蛋白质粒径及平均分布等信息。利用AspN水解WPI,测定不同水解时间(0、1、2、3、4、6、8、10、24 h)的纤维聚集物的水合半径,结果见图9。

图9 不同水解时间形成PNFs的粒径分布图
Fig. 9 Size distribution of PNFs obtained at different hydrolysis times

图10 平均粒径-水解时间的关系
Fig. 10 Average hydrodynamic radius vs. hydrolysis time

图10 为随水解时间PNFs的水合半径的分布图。综合图9、10结果表明,PNFs的平均粒径分布主要在80~2 500 nm之间,随着水解时间的延长,平均粒径增加,水合半径的分布范围也逐渐变宽。这一结果与TEM图比较接近,与Kroesnijboer等[31]的研究结果一致。平均粒径的增加没有经历类似“S”型滞后生长的趋势,推测原因可能是随着酶水解时间的延长,形成的多肽分子质量逐渐降低,自组装形成纳米纤维需要小分子质量的多肽相互缠绕交联,而相对大分子质量的多肽或者蛋白不是纳米纤维的构筑单元。

3 结 论

以WPI为原料,采用AspN水解后于酸性条件下培育能够制备出PNFs。酶法制备的PNFs于TEM下呈现有序的团簇状。利用Tricine-SDS-PAGE、硫磺素T荧光、红外光谱以及激光纳米粒径技术对PNFs形成过程进行表征,结果显示PNFs的构筑单元为多肽,平均粒径与水解时间成正比,且在形成过程中二级结构β-折叠相对含量增加。

本研究所选的原料蛋白为WPI,较β-Lg廉价易得,构建PNFs的条件温和易控制,得到的溶液呈现乳白色的浑浊状,无褐变现象。因此,此法制备的PNFs可望作为功能性食品添加物用于食品工业,具有较好的应用前景。

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Preparation of Nanofibrils by Enzymatic Hydrolysis of Whey Protein Isolate

LI Xuan, SHAN Jie, FENG Zhibiao*, LIU Chunhong, LI Dongmei
(College of Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:In the present study, Asp endoproteinase (AspN) was used to induce whey protein isolate (WPI) for preparing protein nanofibrils (PNFs) at 37 ℃. Transmission electron microscopy (TEM), atomic force microscope (AFM), tricine-SDS-PAGE, thioflavin T fluorescence spectroscopy, infrared spectroscopy and laser scattering were used for the characterization of PNFs and its formation process. The results showed that the PNFs was milky white in color, and peptides with a molecular weight of 5 kD were the building blocks for PNFs. The major secondary structure in PNFs was β-fold, which played a role in its stability, and the average particle size of PNFs was positively proportional to hydrolysis time. The enzymatic preparation of PNFs, overcoming the problem of browning, is expected to expand its application in food industry.

Key words:whey protein isolate (WPI); Asp endoproteinase (AspN); protein nanofibrils (PNFs); peptides

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713020

中图分类号:Q518.4

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)13-0118-07

引文格式:

李璇, 单杰, 冯志彪, 等. 酶法水解乳清分离蛋白制备纳米纤维[J]. 食品科学, 2017, 38(13): 118-124. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201713020. http://www.spkx.net.cn

LI Xuan, SHAN Jie, FENG Zhibiao, et al. Preparation of nanofibrils by enzymatic hydrolysis of whey protein isolate[J]. Food Science, 2017, 38(13): 118-124. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713020. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-24

基金项目:黑龙江省教育厅面上项目(12531007);黑龙江省青年科学基金项目(QC2010029)

作者简介:李璇(1992—),女,硕士研究生,研究方向为应用化学。E-mail:1539182217@qq.com

*通信作者:冯志彪(1967—),男,教授,博士,研究方向为应用化学。E-mail:fengzhibiao@neau.edu.cn