天然红色素灵菌红素的急性经口毒性和遗传毒性

陈新颜,杨培周*,姜绍通,郑 志,操丽丽,操新民,朱星星,张丹峰,刘广庆
(合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽省农产品精深加工重点实验室,安徽 合肥 230009)

摘 要:灵菌红素属于天然色素,具有离体抑制肿瘤和癌症细胞增殖、抑制微生物生长以及抗疟疾和免疫抑制等功效,具有潜在的巨大应用价值。缺少急性经口毒性和遗传毒性实验的研究限制了灵菌红素在食品工业领域的应用。本研究依据食品安全国家标准进行了灵菌红素的小鼠急性经口毒性实验、哺乳动物红细胞微核实验、小鼠精子畸形实验和细菌回复突变实验。结果表明,灵菌红素急性经口半数致死剂量LD50>10 g/kg(以体质量计),3 项遗传毒性实验结果为阴性,灵菌红素对小鼠的急性经口毒性属无毒级,对正常细胞无毒,对动物生殖系统没有毒害。

关键词:灵菌红素;急性经口毒性;遗传毒性;食品安全

灵菌红素(prodigiosin)属于天然色素,是由粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)等微生物合成的一类次级代谢产物[1],其表达和积累主要受微生物发酵温度的调控。灵菌红素已经被证明具有抗肿瘤[2-3]、抗疟疾[4]和免疫抑制[5]等功效,对癌细胞有较强的针对性[6],而在其有效浓度范围内不会对正常细胞造成伤害,对肺[7]、肝脏[8]、肾[9]、结肠[10]和乳房[11-12]等组织器官的癌细胞均有一定的生长性抑制作用[13]。目前的抗癌抗肿瘤药物大都是在发现癌细胞后使用的,在通过化学和物理等强力手段杀死癌细胞的过程中,正常细胞和组织受到极大伤害,破坏人体正常功能,增加病人的痛苦。开发一种能够有效抑制癌细胞和肿瘤细胞增殖的食品,将对保护人们身体健康、降低后期抗癌药物对身体伤害、预防癌细胞的增殖等具有重要的应用价值。

本课题组已从鱼肠道中分离出一种高产灵菌红素的微生物[14],通过结构鉴定、灵菌红素表达定量方法、发酵条件优化[15]、以及抑制癌细胞增殖等研究,初步建立灵菌红素高产菌株选育,发酵条件控制以及分离纯化生产体系,为开发基于灵菌红素的食药用产品提供良好基础。灵菌红素虽然在自然界广泛存在,但是其在动物体内的代谢机理研究缺乏,已有的报道侧重于高产菌株选育[16]、发酵条件[17-18]以及抗癌机制[2,13]等方面,而对灵菌红素在动物体内的食品安全性方面还鲜见报道,本研究拟从食品安全角度进行急性经口毒性和遗传毒性实验,为开发对正常细胞无害的灵菌红素食品原料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

本研究采用的灵菌红素是由本课题组筛选获得的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)HFUT 1301发酵大豆油表达的次生代谢产物,经过离心沉淀收集菌丝体,超声波辅助乙醇萃取浸提以及硅胶色谱分离纯化,纯度为95%[19],对灵菌红素进行紫外-可见光全波长扫描、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)、液相色谱-质谱联用以及核磁共振图谱分析[19],确定该色素为灵菌红素色素,分子式为C20H25N3O,结构式如图1所示。

图1 灵菌红素的结构
Fig. 1 Structure of prodigiosin used in this study

SPF级健康昆明小鼠由常州卡文斯实验动物有限公司提供,生产许可证号:SCXK(苏)2011-0003。

环磷酰胺、叠氮钠、2-氨基芴、狄克松、1,8-二羟蒽醌、二甲基亚砜 Sigma-Aldrichi(中国)公司;大鼠肝匀浆S-9混合物(S9) 上海宝录生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

80i光学显微镜 日本尼康公司;普通生物显微镜日本奥林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 前期准备

实验前对SPF动物实验室、饲养笼、饮水瓶以及实验设备和器具等进行清洗消毒,紫外杀菌;为提高小鼠的环境适应能力,将小鼠在喂养室喂养3 d,观察其生命活力及饮食饮水状况,确定实验动物为健康小鼠,小鼠灌胃体积为0.2 mL。

1.3.2 急性经口毒性实验

小鼠急性经口毒性实验(限量法)选用体质量为18~22 g的健康小鼠20 只,其中雌雄各10 只,分两组;实验前禁食6 h,自由饮水。小鼠一次灌胃体积0.2 mL,将分离得到的纯度为95%的灵菌红素与淀粉混合获得混悬液,含灵菌红素含量约为200 mg(根据小鼠体质量进行适当调整),确保喂饲灵菌红素的剂量达到10.0 g/kg(以体质量计)。一次性给予受试物后继续禁食1.5 h,然后正常饲养,连续观察14 d;每天观察实验小鼠的进食情况、活动能力、粪便有无异常及精神状况,观察是否存在中毒症状以及死亡情况,每隔7 d称体质量并记录,分析体质量的变化。14 d后剖检存活小鼠,分割心、肝、脾、肺和肾等器官,并进行称质量,计算脏体比;制备肝脏切片,光学显微镜观察细胞形态并进行病理组织学分析。

1.3.3 遗传毒性实验

1.3.3.1 细菌回复突变实验

平板掺入法采用经鉴定符合要求的4 株组氨酸缺陷型鼠伤沙门氏菌(TA97、TA98、TA100和TA102)。灵菌红素的质量浓度设置为50、158、500、1 580 μg/皿和5 000 μg/皿,并设置空白对照、溶剂对照(二甲基亚砜)和阳性对照(叠氮钠、狄克松、2-氨基砜、1,8-二羟蒽醌)。每组加大鼠肝匀浆S-9混合物和不加S9的均设置3 个平板,37 ℃恒温培养48 h,观察实验结果,统计培养基平板上菌落数。以实验菌株的回复突变数等于或大于空白对照组的2 倍,且具有明显剂量-效应关系定为阳性,小于2 倍确定为阴性。

1.3.3.2 哺乳动物红细胞微核实验

选择7~12 周龄,体质量25~35 g的健康小鼠50 只,雌雄各半,随机分为5 组,每组10 只。阳性对照组剂量为40 mg/kg(以体质量计,下同)的环磷酰胺,阴性对照组为等量的淀粉溶液,由经口毒性实验结果将灵菌红素的剂量设为2.5、5.0、10.0 g/kg,经口灌胃,第1次灌胃后间隔24 h后第2次给予受试物,而后6 h颈椎脱臼处死小鼠,取股骨,剪去两端,小牛血清多次冲洗,制成细胞悬液,涂片,自然干燥后放入甲醇中固定5~10 min,Giemsa染色10~15 min,然后立即用蒸馏水冲洗,干燥,标签记录,保存。从小鼠眼眶采血,制成血涂片。普通生物显微镜油镜下对每个动物的骨髓涂片,观察2 000 个噬多染红细胞,统计有微核的噬多染红细胞数,计算噬多染红细胞与成熟红细胞比例(PCE/NCE)。

1.3.3.3 小鼠精子畸形实验

选取6~8 周龄体质量为25~30 g的成年雄性小鼠25 只,随机分为5 组,每组各5 只。阳性对照组为剂量为40 mg/kg(以体质量计,下同)的环磷酰胺,阴性对照组为等量淀粉。由经口急性毒性实验将灵菌红素剂量设为2.5、5.0、10 g/kg。经口灌胃5 d,每天1 次,于受试物首次给予35 d后取颈椎脱臼处死小鼠,解剖,取出两侧附睾盛放于含有2mL生理盐水的平皿中,将附睾纵向剪1~3 刀,静置3~5 min后,轻微摇动,过滤,吸取滤液涂片;干燥后置于甲醇中固定5~10 min,伊红浸泡染色时间1 h,灭菌蒸馏水轻冲洗,去除表面杂物,光学显微镜下观察精子形态,每只小鼠样品涂片鉴定1 000个小鼠精子,分析精子形态类型,统计畸形数,计算畸形率。

2 结果与分析

2.1 急性经口毒性实验结果

实验观察期间,喂饲灵菌红素的小鼠正常进食,饮水,身体活动正常且生长发育良好,未观察到明显的中毒特征,无小鼠死亡,观察期间小鼠的体质量记录结果见表1,小鼠的体质量正常增长,雄性小鼠的体质量稍高于雌性小鼠,小鼠的生长状况良好。

表1 灵菌红素对小鼠体质量的影响(n=10)
Table 1 Mouse acute oral toxicity of prodigiosin in terms of body weight,n=10)

图2 小鼠肝脏观察
Fig. 2 Liver of mice

将小鼠肝脏解剖后进行检查(图2),与对照相比,喂饲灵菌红素的实验小鼠肝脏颜色正常、红润(图中未显示),无中毒特征体现,无创伤和其他异常炎症。对图2相应的肝脏进行病理切片,如图3所示,实验小鼠的肝脏与对照小鼠的肝脏相比较,细胞纹路清晰,组织结构完整,无异常情形,未发现明显的病理特征。

图3 小鼠的肝脏病理切片
Fig. 3 Liver pathological sections of mice

表2 小鼠急性毒性脏体比结果(n=10)
Table 2 Ratio of viscera to body weight in mouse in acute oral toxicity test (,n=10)

分析灵菌红素喂饲小鼠的急性毒性脏体比见表2,结果表明,实验小鼠的脏体比处于正常范围,未见明显的靶器官;小鼠的经口急性毒性半数致死量(lethal dose 50%,LD50)大于10 g/kg;根据急性毒性剂量(LD50)分级表,属实际无毒级别。

2.2 遗传毒性实验

2.2.1 细菌回复突变实验结果

表3 灵菌红素Ames试验(x±s)
Table 3 Ames test of prodigiosin (x±s)

注:**.与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);##.与溶剂对照组相比差异极显著(P<0.01);+、—. 加、不加S9。

由表3可见,灵菌红素各剂量组在加或不加S9的细菌回复突变数与空白对照和溶剂对照组相似,均未达到其2 倍,且灵菌红素各剂量组间的实验结果未见明显的统计学差异。阳性对照组在加或不加S9的细菌回复突变数与空白组和溶剂对照组相比均大于其2倍,有剂量-效应关系。表明受试物实验结果为阴性,在实验的剂量范围内,灵菌红素对4 株组氨酸缺陷型鼠伤沙门氏菌无致突变作用。

2.2.2 小鼠红细胞微核实验结果

由图4可见,小鼠红细胞包括带有微核的噬多染红细胞(图4A)、未带有微核的噬多染红细胞(图4B)、阳性对照红细胞(图4C)。微核实验在普通生物显微镜的油镜下进行镜检及计算,结果见表4,灵菌红素3 个剂量组的雌、雄性小鼠微核数、微核率与阴性对照组相比差异性均无统计学意义(P>0.05),3 个剂量组之间也没有明显的统计学差异,表明在实验剂量范围内,灵菌红素对小鼠红细胞微核诱导量和剂量间没有明显关系,可以研究剂量和功能之间的关系。而阳性对照组环磷酰胺的小鼠微核率与阴性对照组相比差异具有明显统计学意义(P<0.01)。综上,表明在实验条件下,灵菌红素不能够引起小鼠噬多染红细胞含微核率增加且与剂量无关。

图4 红细胞微核实验
Fig. 4 Erythrocyte micronucleus test

表4 灵菌红素的小鼠骨髓微核实验结果(
Table 4 Mouse bone marrow micronucleus test of prodigiosin)

注:**.与阴性对照组相比差异极显著(P<0.01)。表5同。

2.2.3 小鼠精子畸形实验结果

表5 灵菌红素小鼠精子畸形实验结果
Table 5 Sperm shape abnormality test of prodigiosin in mice

通过油镜镜检考察小鼠精子的畸形情况,包括正常精子、不定形精子、双尾精子、胖头等形状。统计结果表明灵菌红素3 个剂量组精子畸形率与阴性对照组间差异无统计学意义(P>0.05),且3 个剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05),环磷酰胺阳性对照组精子畸形率与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)

3 结论与讨论

(表5)。结果表明,在实验条件下,灵菌红素不会引起小鼠精子畸形数增加,进而引起畸形率的增加且和剂量无关。

灵菌红素不仅对人肺癌细胞[20-21],人肝癌细胞[22-23]和人乳腺癌细胞[24]等具有抑制作用,此外灵菌红素衍生物对治疗淋巴瘤[25]等也有治疗功能,但商品化灵菌红素及其衍生物产品还未有产品上市,因此,开发灵菌红素产品具有潜在的重大意义。粘质沙雷氏菌是自然界广泛存在的一种条件致病菌[26],作为次生代谢产物的灵菌红素随粘质沙雷氏菌在人的身体内存在,但其对人身体的影响也鲜见相关报道。急性经口毒性和遗传毒性实验不仅是基于灵菌红素的食品产品开发的重要依据,还有助于探究粘质沙雷氏菌的致病机制。本研究进行了细菌回复突变实验、哺乳动物红细胞微核实验、小鼠精子畸形实验以及急性经口毒性实验,结果表明灵菌红素是安全的,研究结果将为基于灵菌红素的开发提供科学依据。

粘质沙雷氏菌在表达灵菌红素过程中,发酵环境条件变化容易改变代谢路径[27],生成多种灵菌红素衍生物[28-29],因此,控制发酵条件是获得确定发酵产物的必要条件[30]。本实验以大豆油为唯一碳源进行发酵,过量的大豆油将粘质沙雷氏菌包裹在油脂内部,保证粘质沙雷氏菌发酵环境稳定,尽量保证灵菌红素结构稳定。本实验结果为基于大豆油为底物发酵产灵菌红素的开发和利用提供参考。

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Experimental Study of Acute Oral Toxicity and Genetic Toxicity of Natural Red Pigment Prodigiosin

CHEN Xinyan, YANG Peizhou*, JIANG Shaotong, ZHENG Zhi, CAO Lili, CAO Xinmin, ZHU Xingxing, ZHANG Danfeng, LIU Guangqing
(Anhui Key Laboratory of Intensive Processing of Agricultural Products, College of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract:Prodigiosin is a natural pigment that has the capability of inhibiting tumor cell proliferation in vitro, microbial growth, and exhibits anti-malaria and immunosuppression properties, thereby having a huge application potential. The application of prodigiosin in the food industry is limited due to the lack of knowledge about its acute oral toxicity and genetic toxicity. In the present study, according to the food safety national standards, the acute oral toxicity test of prodigiosin was performed in mice, and the genetic toxicity was assessed by mammalian erythrocyte micronucleus test, sperm malformation test and bacterial reverse mutation test. The results showed that acute oral medial lethal dose (LD50) of prodigiosin was greater than 10 g/kg BW. All three genetic toxicity tests gave negative results. In acute oral toxicity test, prodigiosin was found to be non-toxic to mice. Prodigiosin had no toxicity to normal cells and the reproductive system of animals.

Key words:prodigiosin; acute oral toxicity; genetic toxicity; food safety

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713037

中图分类号:TS201.6

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)13-0224-05

引文格式:

陈新颜, 杨培周, 姜绍通, 等. 天然红色素灵菌红素的急性经口毒性和遗传毒性[J]. 食品科学, 2017, 38(13): 224-228. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713037. http://www.spkx.net.cn

CHEN Xinyan, YANG Peizhou, JIANG Shaotong, et al. Experimental study of acute oral toxicity and genetic toxicity of natural red pigment prodigiosin[J]. Food Science, 2017, 38(13): 224-228. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201713037. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-05

基金项目:合肥工业大学大学生创新创业训练项目(201510359056);安徽省自然科学基金项目(1408085MC67);安徽省科技攻关项目(1604a0702001)

作者简介:陈新颜(1994—),男,本科,研究方向为发酵工程。E-mail:1172149534@qq.com

*通信作者:杨培周(1976—),男,副教授,博士,研究方向为食品微生物和发酵工程。E-mail:yangpeizhou@163.com